人大腸癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種人大腸癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法，該方法包括從從剛離體的大腸癌標(biāo)本上切取腫瘤邊緣?mèng)~肉樣的無(wú)壞死腫瘤組織；將該腫瘤組織剪成0.8-1.3mm3的小塊后，進(jìn)行原代移植與傳代移植，最終通過(guò)傳代移植的瘤模型來(lái)研究個(gè)體特異性，如某一個(gè)體對(duì)化療藥物或放射治療的敏感性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】人大腸癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及，尤其涉及一種人大腸癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大腸癌是消化道常見(jiàn)腫瘤，惡性程度高，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，而且大腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。因此，大腸癌的研究己受到外科界的關(guān)注。為了更好地研究大腸癌的生物學(xué)特性、癌變機(jī)制、腫瘤診斷、抗癌藥物篩選、腫瘤與宿主的關(guān)系、腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的過(guò)程以及治療措施的有效性，建立穩(wěn)定、可靠和重復(fù)性好的動(dòng)物模型是十分必要的。動(dòng)物模型具有避免在人體上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)所帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn):可以嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，增加實(shí)驗(yàn)材料的可比性；克服腫瘤的潛伏期短、病程長(zhǎng)和發(fā)病率低的缺點(diǎn)，提高實(shí)驗(yàn)研究的效率；簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作、日常管理和各種樣品的收集；有助于更全面地認(rèn)識(shí)人類(lèi)腫瘤本質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)。建立合適的大腸癌動(dòng)物模型，是進(jìn)行大腸癌實(shí)驗(yàn)研究的必備條件。[0003]人類(lèi)疾病的動(dòng)物模型是指各種醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中建立的具有人類(lèi)疾病模擬表現(xiàn)的動(dòng)物。借助于動(dòng)物模型可以有意識(shí)地改變那些在自然條件下不可能或不易排除的因素，以便更準(zhǔn)確地觀察模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并與人類(lèi)疾病進(jìn)行比較研究，有助于更方便，更有效地認(rèn)識(shí)人類(lèi)疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，研究防治措施。小鼠與人類(lèi)在遺傳學(xué)、病理學(xué)、生物學(xué)等許多特性方面都非常相似，是腫瘤研究的理想動(dòng)物。理想的小鼠腫瘤模型應(yīng)能模擬并真實(shí)地重復(fù)人類(lèi)腫瘤的自然發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，并具有與之相同的病理和生化特點(diǎn)。大腸癌是消化道常見(jiàn)腫瘤，惡性程度高，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，而且大腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。因此，大腸癌的研究己受到外科界的關(guān)注。
[0004]目前大腸癌動(dòng)物的腫瘤模型的建立大多數(shù)采用單一的細(xì)胞株移植于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)而實(shí)現(xiàn)。這種模型的優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞株通過(guò)數(shù)十代的傳代，成瘤率高，生長(zhǎng)穩(wěn)定。缺點(diǎn)是腫瘤細(xì)胞來(lái)源單一，對(duì)于需要研究個(gè)體化如化療藥物敏感性方面就顯示出局限性，不能反應(yīng)人類(lèi)腫瘤生物學(xué)特性個(gè)體變化巨大的特點(diǎn)，因此,對(duì)于一些需要研究個(gè)體特異性的如某一個(gè)體對(duì)化療藥物或放射治療的敏感性等時(shí)，單一的細(xì)胞株動(dòng)物模型就不能勝任。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明直接利用人大腸癌新鮮腫瘤組織接種于裸小鼠皮下建立模型，所建模型可反映患者的個(gè)體特征，同時(shí)也代表了臨床多樣性,能夠針對(duì)個(gè)體特異性來(lái)研究某一個(gè)體對(duì)化療藥物或放射治療的敏感性。
[0006]一種人大腸癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法，包括以下步驟:
[0007](I)、從剛離體的大腸癌標(biāo)本上切取腫瘤邊緣?mèng)~肉樣的無(wú)壞死腫瘤組織，用生理鹽水反復(fù)沖洗后浸泡于含雙抗的RPMI1640液中，放入冰盒中迅速送往實(shí)驗(yàn)室，在超凈工作臺(tái)上取出標(biāo)本，放入培養(yǎng)皿中，用含雙抗的PBS液反復(fù)沖洗，剪除標(biāo)本外部的脂肪及壞死組織；所述雙抗為青霉素和鏈霉素，兩者濃度均為500U/ml ；
[0008](2)、在培養(yǎng)皿中，用眼科剪將腫瘤組織剪成0.8-1.3mm3的小塊；[0009](3)、原代移植，用濃度為70mg/kg的戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔注射裸鼠，用鑷子將腫瘤組織塊塞到20號(hào)穿刺針的針孔中，然后用穿刺針移植于裸鼠腋下或腹股溝皮下組織內(nèi)，或于裸鼠皮膚上剪一小切口，經(jīng)切口在皮下組織內(nèi)適度分離出一小腔隙，用眼科鑷將腫瘤組織塊塞入腔隙內(nèi)，最后縫合切口 ；每例標(biāo)本原代接種10只裸鼠，共5例；
[0010](4)、原代移植后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的最大直徑Dmax和最小直徑Dmin，按公式V = 1/2XDmaxXDmin2計(jì)算腫瘤體積,待原代荷瘤鼠的瘤體達(dá)300~500mm3時(shí)，隨機(jī)取其中I只進(jìn)行傳代；
[0011](5)、傳代移植，將隨機(jī)選取的荷瘤鼠I只采用拉脫頸椎法處死動(dòng)物，體表消毒，無(wú)菌條件下剖出移植瘤組織，將腫瘤組織放入玻璃均漿器中，加適量無(wú)菌生理鹽水研磨后，經(jīng)濾網(wǎng)過(guò)濾成單個(gè)的細(xì)胞懸液，用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整至5X106~5X107/ml，用Iml的注射器注射到荷瘤鼠腋下或腹股溝皮下組織內(nèi)，每點(diǎn)接種
0.2ml，每例接種25只，共5例。
[0012]進(jìn)一步地，如上所述的人大腸癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法，步驟2還包括用眼科剪在剪切過(guò)程中向腫瘤組織上滴加1-2滴RPMI1640液，以保持濕潤(rùn)。
[0013]進(jìn)一步地，如上所述的人大腸癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法，在步驟5之后，還包括以下步驟:
[0014]將原代與傳荷瘤鼠均于接種后9周處死，所有荷瘤鼠均剖出腫瘤組織，10%甲醛固定，制作石蠟切片，蘇木素一伊紅染色，光鏡下觀察，并與患者原發(fā)腫瘤進(jìn)行對(duì)比。
[0015]本發(fā)明以大腸癌患者手術(shù)切除腫瘤組織為瘤源，接種于裸鼠體內(nèi)，通過(guò)原代移植與傳代移植進(jìn)行建模，經(jīng)過(guò)傳代移植后的瘤成活率高；通過(guò)觀察腫瘤生長(zhǎng)特征，建立一種代表個(gè)體化的大腸癌裸鼠移植模型，并為進(jìn)一步對(duì)大腸癌的個(gè)體化研究提供一種新的模型系統(tǒng)，利用此模型來(lái)測(cè)試患者腫瘤細(xì)胞對(duì)放、化療等治療措施的敏感性，為臨床治療提供參考資料，實(shí)現(xiàn)腫瘤治療的個(gè)體化以提高治療的效果。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為傳代荷瘤鼠腫瘤移植生長(zhǎng)曲線圖；
【具體實(shí)施方式】
[0017]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面本發(fā)明中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0018]實(shí)施例:
[0019]步驟1:原代裸鼠移植瘤模型的建立
[0020] 從剛離體的大腸癌標(biāo)本上切取腫瘤邊緣?mèng)~肉樣的無(wú)壞死腫瘤組織，用生理鹽水反復(fù)沖洗后浸泡于含雙抗(內(nèi)含青霉素和鏈霉素各500U/ml)的RPMI1640液中，放入冰盒中迅速送往實(shí)驗(yàn)室，在超凈工作臺(tái)上取出標(biāo)本，放入培養(yǎng)皿中，用含雙抗的PBS液反復(fù)沖洗，剪除標(biāo)本外部的脂肪及壞死組織；在培養(yǎng)皿中，用眼科剪將組織剪成Imm3左右的小塊，剪切過(guò)程中適當(dāng)向組織上滴加1-2滴RPMI1640液，以保持濕潤(rùn)；用戊巴比妥鈉(70mg/kg)經(jīng)腹腔注射裸鼠，用鑷子將組織塊塞到20號(hào)穿刺針的針孔中，然后用穿刺針移植于裸鼠腋下(或腹股溝)皮下組織內(nèi)，或于裸鼠皮膚上剪一小切口，經(jīng)切口在皮下組織內(nèi)適度分離出一小腔隙，用眼科鑷將腫瘤組織塊塞入腔隙內(nèi)，最后縫合切口。每例標(biāo)本原代接種10只裸鼠，共5例。
[0021 ] 步驟2:裸鼠成瘤情況
[0022]原代移植后每日觀察裸鼠的精神、飲食、活動(dòng)、大小便等一般情況，移植處皮下是否成瘤。從接種之日起至接種部位出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的移植瘤時(shí)為潛伏期，發(fā)現(xiàn)成瘤后開(kāi)始每周用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的最大直徑(Dmax)和最小直徑(Dmin)，按公式V =1/2 X DmaxX (Dmin) 2計(jì)算腫瘤體積，并畫(huà)出腫瘤體積時(shí)間生長(zhǎng)曲線,待原代荷瘤裸鼠的瘤體達(dá)300~500mm3左右時(shí)(約20~30天)，隨機(jī)取其中I只進(jìn)行傳代。
[0023]步驟3:傳代裸鼠移植瘤模型的建立
[0024]為了解決成本，本發(fā)明當(dāng)原代移植成功后，繼續(xù)進(jìn)行傳代裸鼠移植瘤模型的建立，其方法為:隨機(jī)選取其中的荷瘤鼠I只，拉脫頸椎法處死動(dòng)物，體表消毒，無(wú)菌條件下剖出移植瘤組織，將腫瘤組織放入 玻璃均漿器中，加適量無(wú)菌生理鹽水研磨后，經(jīng)濾網(wǎng)過(guò)濾成單個(gè)的細(xì)胞懸液，用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整至5X IO6~5X IO7/ml，用Iml的注射器注射到裸鼠腋下(或腹股溝)皮下組織內(nèi)，每點(diǎn)(即每個(gè)接種的部位)接種0.2ml，每例接種25只，共5例。
[0025]步驟4:病理學(xué)檢查
[0026]原代與傳代荷瘤鼠均于接種后9周處死，所有荷瘤鼠均剖出腫瘤組織，10%甲醛固定，制作石蠟切片，蘇木素一伊紅(HE)染色，光鏡下觀察，并與患者原發(fā)腫瘤進(jìn)行對(duì)比。
[0027]表1、表2分別是原代荷瘤鼠與傳代荷瘤鼠移植成瘤率的高低以及腫瘤生長(zhǎng)的變化。原代接種共50只，成活20只，成功率為40% (20/50)，傳代接種共125只，成活93只，成功率為74.4% (93/125)。見(jiàn)表1和表2。可見(jiàn)，通過(guò)傳代移植后，成功率更高，因此，在建模的過(guò)程中增加傳代移植建模，可降低本發(fā)明建模的成本。
[0028]表1原代裸鼠皮下移植瘤成活率及潛伏期(Xfs) (η = 10)
[0029]觀察指標(biāo)
[0030]
組別成話例數(shù)成話率14潛伏期(d )
第—例33015.66 士 1.52
第二例44014.33 士 2.51
第三例55013.66 士 2.08
第四例44013.33 士 2.43
第五例44014.63 士 2.32[0031]表2傳代裸鼠皮下移植瘤成活率及潛伏期(rfs) (η = 25)
[0032]觀察指標(biāo)
[0033]
【權(quán)利要求】
1.一種人大腸癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)、從剛離體的大腸癌標(biāo)本上切取腫瘤邊緣?mèng)~肉樣的無(wú)壞死腫瘤組織，用生理鹽水反復(fù)沖洗后浸泡于含雙抗的RPMI1640液中，放入冰盒中迅速送往實(shí)驗(yàn)室，在超凈工作臺(tái)上取出標(biāo)本，放入培養(yǎng)皿中，用含雙抗的PBS液反復(fù)沖洗，剪除標(biāo)本外部的脂肪及壞死組織；所述雙抗為青霉素和鏈霉素，兩者濃度均為500U/ml ； (2)、在培養(yǎng)皿中，用眼科剪將腫瘤組織剪成0.8-1.3mm3的小塊； (3)、原代移植，用濃度為70mg/kg的戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔注射裸鼠，用鑷子將腫瘤組織塊塞到20號(hào)穿刺針的針孔中，然后用穿刺針移植于裸鼠腋下或腹股溝皮下組織內(nèi)，或于裸鼠皮膚上剪一小切口，經(jīng)切口在皮下組織內(nèi)適度分離出一小腔隙，用眼科鑷將腫瘤組織塊塞入腔隙內(nèi)，最后縫合切口 ；每例標(biāo)本原代接種10只裸鼠，共5例； (4)、原代移植后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的最大直徑Dmax和最小直徑Dmin，按公式V=1/2 X Dmax X Dmin2計(jì)算腫瘤體積，待原代荷瘤鼠的瘤體達(dá)300~500mm3時(shí)，隨機(jī)取其中I只進(jìn)行傳代； (5)、傳代移植，將隨機(jī)選取的荷瘤鼠I只采用拉脫頸椎法處死動(dòng)物，體表消毒，無(wú)菌條件下剖出移植瘤組織 ，將腫瘤組織放入玻璃均漿器中，加適量無(wú)菌生理鹽水研磨后，經(jīng)濾網(wǎng)過(guò)濾成單個(gè)的細(xì)胞懸液，用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整至5X IO6~5X107/ml，用Iml的注射器注射到荷瘤鼠腋下或腹股溝皮下組織內(nèi)，每點(diǎn)接種0.2ml，每例接種25只，共5例。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人大腸癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法，其特征在于，步驟2還包括用眼科剪在剪切過(guò)程中向腫瘤組織上滴加1-2滴RPMI1640液，以保持濕潤(rùn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人大腸癌裸鼠皮下移植瘤模型建立的方法，其特征在于，在步驟5之后，還包括以下步驟: 將原代與傳荷瘤鼠均于接種后9周處死，所有荷瘤鼠均剖出腫瘤組織，10%甲醛固定，制作石蠟切片，蘇木素一伊紅染色，光鏡下觀察，并與患者原發(fā)腫瘤進(jìn)行對(duì)比。
【文檔編號(hào)】A61D1/00GK103976803SQ201410225860
【公開(kāi)日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年5月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月26日
【發(fā)明者】顏登國(guó), 張東興, 龔慧 申請(qǐng)人:貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院