穩(wěn)定表達熒光素酶的人大腸癌sw480細(xì)胞系及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及穩(wěn)定表達熒光素酶的人大腸癌SW480-luc細(xì)胞系及其構(gòu)建方法。該細(xì)胞系利用陽離子脂質(zhì)體將攜帶熒光素酶報告基因和新霉素抗性基因的PGL4.51[luc2/CMV/neo]質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人大腸癌SW480細(xì)胞株；轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞加入G418，經(jīng)過3次以上的單克隆化操作獲得。該細(xì)胞系已構(gòu)建成功，能穩(wěn)定傳代，在活體成像系統(tǒng)內(nèi)可觀察到發(fā)光情況，發(fā)光強度與細(xì)胞數(shù)量成正比，并且用細(xì)胞構(gòu)建的活體（裸鼠移植瘤）模型在成像系統(tǒng)內(nèi)亦能觀察到腫瘤發(fā)光情況，使動態(tài)觀察腫瘤在活體的生長轉(zhuǎn)移等生物學(xué)活動具有可行性。
【專利說明】穩(wěn)定表達熒光素酶的人大腸癌SW480細(xì)胞系及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及人大腸癌SW480細(xì)胞系的構(gòu)建，尤其涉及穩(wěn)定表達熒光素酶的人大腸癌SW480細(xì)胞系的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]活體生物發(fā)光成像是一種新興的成像技術(shù)，其原理是利用發(fā)光蛋白如熒光素酶催化光子釋放的化學(xué)反應(yīng)，最常用的蛋白是螢火蟲熒光素酶，其機制是酶促反應(yīng)，即熒光素酶在ATP和氧氣存在時，催化熒光素酶底物產(chǎn)生氧化反應(yīng)而發(fā)光，因此，這種發(fā)光現(xiàn)象必須在活細(xì)胞內(nèi)進行。來自這種反應(yīng)的光很明顯，其散發(fā)光譜在400nm至620nm之間，易于被一種CXD相機記錄。研究人員可通過熒光素酶標(biāo)記的細(xì)胞、病毒、DNA、基因表達以及動物模型等進行科學(xué)研究。利用該成像系統(tǒng)可以直接快速的觀察活體內(nèi)腫瘤的生物學(xué)活動。
[0003]BALB/c裸鼠屬于T細(xì)胞免疫功能缺陷動物，且用于活體成像時皮毛產(chǎn)生的自發(fā)熒光干擾較少，是建立體內(nèi)異種移植瘤模型較理想的實驗動物。
[0004]大腸癌包括結(jié)腸癌和直腸癌，是常見惡性腫瘤之一，在我國的發(fā)病率居高，手術(shù)是目前主要的治療方法，而術(shù)后轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的重要因素，因此研究大腸癌細(xì)胞的生物學(xué)活動對于尋找有效的大腸癌治療方法十分重要。利用免疫缺陷動物建立人類腫瘤動物模型是研究腫瘤體內(nèi)生長、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性的重要工具。因此對于大腸癌細(xì)胞通過熒光素酶標(biāo)記，在活體成像系統(tǒng)內(nèi)觀察腫瘤發(fā)光情況，動態(tài)觀察腫瘤在活體的生長轉(zhuǎn)移等生物學(xué)活動，對于大腸癌的研究具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明為了提供一種穩(wěn)定表達熒光素酶的人大腸癌SW480細(xì)胞系及其構(gòu)建方法，以實現(xiàn)在活體成像系統(tǒng)內(nèi)觀察腫瘤發(fā)光情況，動態(tài)觀察腫瘤在活體的生長轉(zhuǎn)移等生物學(xué)活動。
[0006]本發(fā)明是通過以下方案實現(xiàn)的:
上述的穩(wěn)定表達熒光素酶的人大腸癌SW480-1UC細(xì)胞系，是通過以下方法獲得:利用陽離子脂質(zhì)體將攜帶有熒光素酶報告基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人大腸癌SW480細(xì)胞株；轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞加入G418，經(jīng)過3次以上的單克隆化操作，獲得穩(wěn)定表達熒光素酶的人大腸癌SW480-luc 細(xì)胞系。
[0007]所述的穩(wěn)定表達熒光素酶的人大腸癌SW480-1UC細(xì)胞系，其中:利用陽離子脂質(zhì)體將攜帶熒光素酶報告基因和新霉素抗性基因的PGL4.51質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人大腸癌SW480細(xì)胞株。
[0008]所述的穩(wěn)定表達熒光素酶的人大腸癌SW480-1UC細(xì)胞系，其中:所述G418對SW480細(xì)胞株的最佳工作濃度為700ug/ml。
[0009]上述的穩(wěn)定表達熒光素酶的人大腸癌SW480-luc細(xì)胞系的構(gòu)建方法，具體包括以下步驟:首先，G418最佳篩選濃度的確定
SW480細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含有10%小牛血清的1640培養(yǎng)基；取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為I X 104/ml，每孔100 μ I接種于96孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)；在細(xì)胞接種24h后，倍比稀釋G418，建立0-lmg/mL10個梯度，加入96孔板中，每種濃度設(shè)置6個復(fù)孔；每天觀察細(xì)胞生長情況，在10-14 d內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最低G418濃度，即為篩選轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞的工作濃度；
第二，細(xì)胞轉(zhuǎn)染
取對數(shù)生長期的SW480細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前I天將細(xì)胞接種于6孔板，24 h內(nèi)待細(xì)胞融合度達到70%-90%即可轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000試劑操作指南進行操作；轉(zhuǎn)染后細(xì)胞置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)；
第三，G418篩選抗性細(xì)胞及其單克隆化
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48h，細(xì)胞1:10傳代到24孔板，同時以相同的密度傳代未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對照；細(xì)胞貼壁后，加入G418，根據(jù)細(xì)胞死亡情況和培養(yǎng)基的營養(yǎng)狀況及時換液；待對照組細(xì)胞全部死亡后，即得到初步抗性克隆?？剐钥寺∽鰺晒馑孛富钚詸z測，表達熒光素酶的克隆制備成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，待其增殖后轉(zhuǎn)入24孔板擴大培養(yǎng)。重復(fù)此單克隆化過程3次，即得到穩(wěn)定表達熒光素酶的SW480-1UC細(xì)胞。
[0010]所述的穩(wěn)定表達熒光素酶的人大腸癌SW480-1UC細(xì)胞系的構(gòu)建方法，還包括熒光素酶活性鑒定，具體鑒定方法為:SW480-luc細(xì)胞濃度分別為5.0X105/ml、2.5X105/ml、1.25X 105/ml,0.625X 105/ml,0.313X 105/ml 和 0.156X 105/ml，每孔 100 μ I 加入 96 孔白板中，每組設(shè)3個復(fù)孔；每孔加0.5 μ 130mg/ml的熒光素底物，37°C孵育lOmin，熒光照度計測熒光值；比較各克隆的熒光強度，并分析熒光強度與細(xì)胞數(shù)之間的相關(guān)性。所述G418對SW480細(xì)胞株的最佳工作濃度為700ug/ml。
[0011]有益效果:
本研究將穩(wěn)定表達熒光素酶的SW480-1UC皮下接種裸鼠成功建立活體成像動物模型，為下一步動態(tài)觀察腫瘤生長提供便利條件。SW480-lun細(xì)胞系已構(gòu)建成功，能穩(wěn)定傳代，在活體成像系統(tǒng)內(nèi)可觀察到發(fā)光情況，發(fā)光強度與細(xì)胞數(shù)量成正比，并且用細(xì)胞構(gòu)建的活體(裸鼠移植瘤)模型在成像系統(tǒng)內(nèi)亦能觀察到腫瘤發(fā)光情況，使動態(tài)觀察腫瘤在活體的生長轉(zhuǎn)移等生物學(xué)活動具有可行性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為本發(fā)明實施例的活體成像步驟；
圖2為本發(fā)明實施例的6個陽性克隆的發(fā)光值；
圖3為本發(fā)明實施例的裸鼠體內(nèi)SW480-1UC細(xì)胞發(fā)光情況。
【具體實施方式】
[0013]本發(fā)明的穩(wěn)定表達熒光素酶的人大腸癌SW480細(xì)胞系(SW480-1UC)是通過以下方法獲得:利用陽離子脂質(zhì)體將攜帶有熒光素酶報告基因和新霉素抗性基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人大腸癌SW480細(xì)胞株；轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞加入G418，經(jīng)過3次以上的單克隆化操作，獲得穩(wěn)定表達熒光素酶的人大腸癌SW480-1UC細(xì)胞系。[0014]該穩(wěn)定表達熒光素酶的人大腸癌SW480細(xì)胞系(SW480-1UC)的構(gòu)建方法及鑒定，具體包括以下步驟:
首先，G418最佳篩選濃度的確定
SW480細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含有10%小牛血清的1640培養(yǎng)基；取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為I X 104/ml，每孔100 μ I接種于96孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)；在細(xì)胞接種24h后，倍比稀釋G418，建立0-lmg/mL10個梯度，加入96孔板中，每種濃度設(shè)置6個復(fù)孔；每天觀察細(xì)胞生長情況，在10-14 d內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最低G418濃度，即為篩選轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞的工作濃度。
[0015]第二，細(xì)胞轉(zhuǎn)染
取對數(shù)生長期的SW480細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前I天將細(xì)胞接種于6孔板，24 h內(nèi)待細(xì)胞融合度達到70%-90%即可轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000試劑操作指南進行操作，即:500 μ IOPT1-MEM中加入500ug PGL4.51質(zhì)粒，充分混勻，為溶液I ;溶液I中加入7 μ IPLUS,室溫孵育5min ;再加入21 μ 1LTX,室溫孵育30min后加入6孔板孔中；轉(zhuǎn)染后細(xì)胞置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。
[0016]第三，G418篩選抗性細(xì)胞及其單克隆化
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48h，細(xì)胞1:10傳代到24孔板，同時以相同的密度傳代未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對照；細(xì)胞貼壁后，加入G418，根據(jù)細(xì)胞死亡情況和培養(yǎng)基的營養(yǎng)狀況及時換液；待對照組細(xì)胞全部死亡后，即得到初步抗性克隆?？剐钥寺∽鰺晒馑孛富钚詸z測，表達熒光素酶的克隆制備成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，待其增殖后轉(zhuǎn)入24孔板擴大培養(yǎng)。重復(fù)此單克隆化過程3次，即得到穩(wěn)定表達熒光素酶的SW480-1UC細(xì)胞。
[0017]第四，熒光素酶活性鑒定
SW480-luc 細(xì)胞濃度分別為 5.0X 105/ml,2.5X 105/ml,1.25X 105/ml,0.625X 105/ml、0.313X 105/ml和0.156X 105/ml，每孔100 μ I加入96孔白板中，每組設(shè)3個復(fù)孔；每孔加0.5μ 130mg/ml的熒光素底物，37°C孵育lOmin，熒光照度計測熒光值；比較各克隆的熒光強度，并分析熒光強度與細(xì)胞數(shù)之間的相關(guān)性。
[0018]本研究中，我們利用陽離子脂質(zhì)體將攜帶熒光素酶報告基因和新霉素抗性基因的PGL4.51[luc2/CMV/neo]質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人大腸癌SW480細(xì)胞株，參考圖1的活體成像步驟:質(zhì)粒PGL4.51圖譜及觀察發(fā)光的活體成像系統(tǒng)。因不同細(xì)胞株對G418耐受能力不同，本實驗通過Ο-lmg/ml的10個濃度梯度實驗篩選，確定G418對SW480細(xì)胞株的最佳工作濃度為700ug/ml。需要注意的是，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞必須經(jīng)過3次以上的單克隆化操作，才能獲得遺傳穩(wěn)定的細(xì)胞克隆。本實驗初步篩選出7個抗性克隆，測定熒光值后發(fā)現(xiàn)I個為假陽性克隆，6個為陽性克??；參考圖2的6個陽性克隆的發(fā)光值，圖右側(cè)為發(fā)光強度判定值，從下往上發(fā)光強度越強。熒光素酶催化底物反應(yīng)屬于高耗能過程，熒光素酶活性不能太高，因此，本實驗選擇熒光值稍低的SW480-1UC克隆I進行動物實驗。BABL/c裸鼠屬于T細(xì)胞免疫功能缺陷動物，且用于活體成像時皮毛產(chǎn)生的自發(fā)熒光干擾較少，是建立體內(nèi)異種移植瘤模型較理想的實驗動物。本研究將穩(wěn)定表達熒光素酶的SW480-1UC皮下接種裸鼠成功建立活體成像動物模型，為下一步動態(tài)觀察腫瘤生長提供便利條件，裸鼠體內(nèi)SW480-1UC細(xì)胞發(fā)光情況，參考圖3依序顯示的分別在接種后第3天、10天、17天、24天觀察到的情況。
[0019]SW480-lun細(xì)胞系已構(gòu)建成功，能穩(wěn)定傳代，在活體成像系統(tǒng)內(nèi)可觀察到發(fā)光情況，發(fā)光強度與細(xì)胞數(shù)量成正比，并且用細(xì)胞構(gòu)建的活體(裸鼠移植瘤)模型在成像系統(tǒng)內(nèi)亦能觀察到腫瘤發(fā)光情況，使動態(tài)觀察腫瘤在活體的生長轉(zhuǎn)移等生物學(xué)活動具有可行性。
【權(quán)利要求】
1.一種穩(wěn)定表達突光素酶的人大腸癌SW480_luc細(xì)胞系，是通過以下方法獲得:利用陽離子脂質(zhì)體將攜帶有熒光素酶報告基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人大腸癌SW480細(xì)胞株；轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞加入G418，經(jīng)過3次以上的單克隆化操作，獲得穩(wěn)定表達熒光素酶的人大腸癌SW480-luc 細(xì)胞系。
2.如權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定表達熒光素酶的人大腸癌SW480-1UC細(xì)胞系，其特征在于:利用陽離子脂質(zhì)體將攜帶熒光素酶報告基因和新霉素抗性基因的PGL4.51質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人大腸癌SW480細(xì)胞株。
3.如權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定表達熒光素酶的人大腸癌SW480-1UC細(xì)胞系，其特征在于:所述G418對SW480細(xì)胞株的最佳工作濃度為700ug/ml。
4.如權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定表達熒光素酶的人大腸癌SW480-1UC細(xì)胞系的構(gòu)建方法，具體包括以下步驟: 首先，G418最佳篩選濃度的確定 SW480細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含有10%小牛血清的1640培養(yǎng)基；取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為I X104/ml，每孔100 μ I接種于96孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)；在細(xì)胞接種24h后，倍比稀釋G418，建立0-lmg/mL10個梯度，加入96孔板中，每種濃度設(shè)置6個復(fù)孔；每天觀察細(xì)胞生長情況，在10-14 d內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最低G418濃度，即為篩選轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞的工作濃度； 第二，細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的SW480細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前I天將細(xì)胞接種于6孔板，24 h內(nèi)待細(xì)胞融合度達到70%-90%即可轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000試劑操作指南進行操作；轉(zhuǎn)染后細(xì)胞置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)； 第三，G418篩選抗性細(xì)胞及其單克隆化 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48h，細(xì)胞1:10傳代到24孔板，同時以相同的密度傳代未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對照；細(xì)胞貼壁后，加入G418，根據(jù)細(xì)胞死亡情況和培養(yǎng)基的營養(yǎng)狀況及時換液；待對照組細(xì)胞全部死亡后，即得到初步抗性克??；抗性克隆做熒光素酶活性檢測，表達熒光素酶的克隆制備成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，待其增殖后轉(zhuǎn)入24孔板擴大培養(yǎng)；重復(fù)此單克隆化過程3次，即得到穩(wěn)定表達熒光素酶的SW480-1UC細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求4所述的穩(wěn)定表達熒光素酶的人大腸癌SW480-1UC細(xì)胞系的構(gòu)建方法，還包括熒光素酶活性鑒定，具體鑒定方法為:
SW480-luc 細(xì)胞濃度分別為 5.0X 105/ml,2.5X 105/ml,1.25X 105/ml,0.625X 105/ml,0.313X 105/ml和0.156 X 105/ml，每孔100 μ I加入96孔白板中，每組設(shè)3個復(fù)孔；每孔加0.5μ 130mg/ml的熒光素底物，37°C孵育lOmin，熒光照度計測熒光值；比較各克隆的熒光強度，并分析熒光強度與細(xì)胞數(shù)之間的相關(guān)性。
6.如權(quán)利要求4或5所述的穩(wěn)定表達熒光素酶的人大腸癌SW480-1UC細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于:所述G418對SW480細(xì)胞株的最佳工作濃度為700ug/ml。
【文檔編號】C12N15/85GK103468643SQ201310415831
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月13日
【發(fā)明者】徐少勇, 王璠, 魏剛 申請人:十堰市人民醫(yī)院