一株高產(chǎn)嗜鐵素的假單胞菌菌株與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株高產(chǎn)嗜鐵素的假單胞菌菌株與應(yīng)用，菌株編號為PA94，分類名稱為Pseudomonas?aeruginosa，保藏編號：CGMCCNo.9180，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。本發(fā)明采集薊運河的土壤樣品，在MMSA-CAS平板上共篩選到15株產(chǎn)嗜鐵素的菌株。在MMSA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)PA94菌株24h，測得嗜鐵素活性單位SU＝63.54％，As/Ar＝0.36，產(chǎn)嗜鐵素的能力為++++。產(chǎn)生的嗜鐵素為氧肟酸型和檸檬酸型的混合型，對致病菌和真菌具有拮抗作用，嗜鐵素可以用于蔬菜種植中疾病的防控，并能夠促進植物的生長。
【專利說明】一株高產(chǎn)嗜鐵素的假單胞菌菌株與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是一株高產(chǎn)嗜鐵素的假單胞菌菌株與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]鐵對大多數(shù)微生物的正常生長至關(guān)重要，一般需要0.4-1.0 μ M鐵來維持自身的正常生長，雖然鐵在地球上的含量很高，但多以不溶的形式存在，生物有效性極低。在這樣一種脅迫作用下，微生物進化出多條途徑來獲得所必須的鐵元素。嗜鐵素介導(dǎo)的鐵元素攝入是微生物獲取鐵元素的最普遍方式，許多微生物甚至合成和分泌超出自身細胞干重的嗜鐵素，來滿足鐵元素的營養(yǎng)需求。
[0003]嗜鐵素廣泛存在于細菌、真菌和植物體內(nèi)，是一種相對低分子量(500-1000D)的鐵螯合物質(zhì)，是在鐵缺乏的情況下合成的，對三價鐵有較強的親和力，通過降低環(huán)境P H值來增加鐵的溶解性，還原三價鐵為生物利用性更高的亞鐵形式幫助微生物從環(huán)境中獲取必需的鐵元素。至今研究者已經(jīng)鑒定出至少500種不同的嗜鐵素，雖然嗜鐵素在整體結(jié)構(gòu)上差別很大，但是按與Fe3+結(jié)合的功能基團的不同將嗜鐵素分為3種:異輕廂酸型(hydroxamate)嗜鐵素、兒茶酹型(catecholate)嗜鐵素和羥基羧酸型(hydroxycarboxylate)嗜鐵素。從產(chǎn)生嗜鐵素微生物的不同將嗜鐵素分為2種:由細菌產(chǎn)生的嗜鐵素和由真菌產(chǎn)生的嗜鐵素兩大類。
[0004]假單胞菌在土壤環(huán)境中分布廣泛，種類繁多，能夠產(chǎn)生不同結(jié)構(gòu)的嗜鐵素。銅綠假單胞菌螯鐵蛋白(Pyochelin)和膿青素(pyoverdine)是假單胞菌產(chǎn)生的最主要的兩類嗜鐵素，其中銅綠假單胞菌螯鐵蛋白與Fe3+的螯合能力小于膿青素的螯合能力。嗜鐵素不僅能夠為細菌自身提供鐵元素，也能夠為其它生物提供鐵營養(yǎng)，但是假單胞菌屬細菌合成的膿青素嗜鐵素，卻不能被本屬外的其它生物利用，而且假單胞菌產(chǎn)生的嗜鐵素的高效螯鐵能力，使其產(chǎn)生菌與同一環(huán)境中的其它微生物在對鐵素營養(yǎng)的競爭中占據(jù)優(yōu)勢，這是利用土壤有益微生物防治土傳病害的作用機理之一。
[0005]嗜鐵素制劑的使用，既可避免大量使用殺蟲劑和殺菌劑，減少病原菌和害蟲產(chǎn)生抗藥性及化學(xué)試劑難降解對環(huán)境的危害，同時又能為植物的生長提供鐵營養(yǎng)元素。因此假單胞菌屬細菌相比其它微生物在對鐵素營養(yǎng)的競爭上具有很大優(yōu)勢，使該屬細菌在生物防治領(lǐng)域具有誘人的潛力和前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于一株高產(chǎn)嗜鐵素的假單胞菌菌株與應(yīng)用，本發(fā)明從環(huán)境中樣品中分離到能高產(chǎn)嗜鐵素的假單胞菌菌株，通過雙層培養(yǎng)基法定性和液體培養(yǎng)法定量篩選出一株高產(chǎn)嗜鐵素的假單胞菌株，又確定了嗜鐵素對對常見致病菌株-副溶血性弧菌、藤黃球菌和金黃色葡萄球菌的拮抗作用，并對真菌生長具有抑制作用，該菌株合成的嗜鐵素，能夠用于蔬菜種植過程中對于疾病的生物防治，并對植物生長具有促進作用。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:[0008]一株高產(chǎn)嗜鐵素的銅綠假單胞菌，菌株名稱為PA94，分類名稱為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa),保藏編號:CGMCCN0.9180,保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期:2014年05月21日。
[0009]而且，利用麗SA-CAS平板，篩選產(chǎn)嗜鐵素的菌株，其中菌株P(guān)A94經(jīng)過16SrRNA基因序列分析，鑒定為銅綠假單胞菌。
[0010]而且，所述菌株P(guān)A94在MMSA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，24h后測得嗜鐵素活性單位SU =63.54%, As/Ar = 0.36，產(chǎn)嗜鐵素的能力 ++++。
[0011]而且，所述菌株P(guān)A94產(chǎn)生的嗜鐵素為氧肟酸型和檸檬酸型的混合型。
[0012]而且，所述菌株P(guān)A94產(chǎn)生的嗜鐵素對致病菌和真菌具有拮抗作用。
[0013]高產(chǎn)嗜鐵素的銅綠假單胞菌菌株P(guān)A94產(chǎn)生嗜鐵素用于蔬菜種植中疾病的防護制劑的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果如下:
[0015]本發(fā)明提供的菌株能夠用于發(fā)酵嗜鐵素，在制備成嗜鐵素制劑，該制劑使用后能夠降低病原菌對抗菌素產(chǎn)生抗藥性的可能，避免有毒有害化學(xué)試劑對環(huán)境的危害，能夠為植物的生長提供鐵營養(yǎng)元素，促進蔬菜的生長，在生物防治領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值，同時能夠避免大量使用殺菌劑，達到對蔬菜疾病實行生物防控的目的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為本發(fā)明PA94菌株在麗SA-CAS平板上的菌落形態(tài)。
【具體實施方式】
[0017]下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍中。
[0018]一株高產(chǎn)嗜鐵素的假單胞菌菌株的分離鑒定，步驟如下:
[0019]1.1培養(yǎng)基
[0020]LB培養(yǎng)基:每L中含有酵母粉5g、蛋白胨10g、NaC110g，瓊脂15g，其余為水。
[0021]MMAS培養(yǎng)基:每L中含有蔗糖20g、天冬氨酸28、1(2冊0418、1%5040.58、瓊脂158，其余為水。
[0022]CAS固體培養(yǎng)基:每L中含有鉻天青S1.21g、十六烷基三甲基溴化銨(HDTMA) 1.82g、無水哌嗪 30.24g、FeCl3 (IOmMHCL 溶解)0.27g，瓊脂 15g。液體 CAS 所有成分含量不變，但不需要添加瓊脂。
[0023]1.2 試劑
[0024]Arnow方法檢測試劑用于檢驗兒茶酚型嗜鐵素，其配方為:0.5MHC1 ；10g亞硝酸鈉和IOg鑰酸鈉溶于少量水后加水至IOOmL ;lMNaOH。
[0025]羧酸型嗜鐵素檢測試劑配方為:250 μ MCuSO4和0.2ΜρΗ4.0醋酸鹽緩沖液。
[0026]氧肟酸型嗜鐵素檢測試劑為:IOOmMFeCl3溶解在0.1MHCl中。
[0027]1.3產(chǎn)嗜鐵素菌株的分離與篩選
[0028] 收集環(huán)境中土壤樣品，采用梯度稀釋法涂布在麗SA平板上，待菌落長出后傾倒一層CAS藍色培養(yǎng)基，觀察板上顏色的變化。將板上有顏色變化的菌株劃線純化，挑單菌落接種于LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后按照I %的接種量轉(zhuǎn)接到20mLMMSA液體培養(yǎng)基中，30°C，200rpm 振蕩培養(yǎng) 24h。
[0029]發(fā)酵液離心過濾，與等體積CAS溶液混合，室溫下靜置Ih后測定0D_，通過SU =(Ar-As)/Ar，計算出嗜鐵素的活性單位；通過As/Ar來估計出產(chǎn)生嗜鐵素的能力，As/Ar從
1.0-0之間以0.2為間隔，每減小0.2增加一個“ + ”，一般產(chǎn)嗜鐵素能力較高(+++)的細菌其As/Ar低于0.5 (其中Ar代表等體積的麗SA培養(yǎng)基與CAS溶液混合，室溫下靜置Ih后0D_，As代表等體積的菌株發(fā)酵液上清與CAS溶液混合，室溫下靜置Ih后0D_)。
[0030]1.4嗜鐵素類型的鑒定
[0031](I)Arnow方法(檢驗兒茶酚型嗜鐵素):
[0032]假單胞菌株的發(fā)酵液1000Orpm離心5min,取ImL上清與ImL0.5MHC1、ImL鑰酸-亞硝酸鈉、ImLNaOH混合，然后添加ImL水至體積為5mL，如果有兒茶酚型嗜鐵素存在，該混合液的顏色會變成紅色，在Ih內(nèi)測定該混合液的0D51(i。顏色越深，OD51tl值越大，表明兒茶酚型嗜鐵素的含量越大。
[0033](2)羧酸型嗜鐵素檢測方法: [0034]取ImL上清與lmL250 μ MCuSO4和2mL0.2MpH4.0醋酸鹽緩沖液混合后，添加ImL水至體積為5mL,測定在190nm-400nm的光吸收。如果有羧酸型嗜鐵素存在，則該混合液在190nm-280nm有最大光吸收 。
[0035](3) FeCl3 方法:
[0036]取ImL上清液200 μ LlOOmMFeCl3混合，如果有三羥基氧肟酸嗜鐵素存在，則混合液會變成桔黃色；如果有二羥基氧肟酸存在，則混合液混變成粉紅色。
[0037]1.5分離菌株的分子鑒定
[0038]對分離到的ΡΑ94菌株，采用苯酚-氯仿-異戊醇抽提法提取菌體DNA，并以此做模板，利用PCR方法擴增16SrRNA基因。將PCR產(chǎn)物進行測序，將得到的序列使用NCBIBlast和Ribosomal Database Project II軟件Classifier,對PA94菌株進行分析與鑒定。其中，擴增16SrRNA基因通用引物27F和1492R，引物序列如下:
[0039]27F:5/ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
[0040]1492R:5/ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
[0041]聚合酶鏈式反應(yīng)體系:
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一株高產(chǎn)嗜鐵素的銅綠假單胞菌，其特征在于:菌株名稱為PA94，分類名稱為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa),保藏編號:CGMCCN0.9180,保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期:2014年05月21日。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述高產(chǎn)嗜鐵素的銅綠假單胞菌，其特征在于:利用麗SA-CAS平板，篩選產(chǎn)嗜鐵素的菌株，其中菌株P(guān)A94經(jīng)過16SrRNA基因序列分析，鑒定為銅綠假單胞菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述高產(chǎn)嗜鐵素的銅綠假單胞菌，其特征在于:所述菌株P(guān)A94在MMSA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，24h后測得嗜鐵素活性單位SU = 63.54%,As/Ar = 0.36，產(chǎn)嗜鐵素的能力為++++。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述高產(chǎn)嗜鐵素的銅綠假單胞菌，其特征在于:所述菌株P(guān)A94產(chǎn)生的嗜鐵素為氧肟酸型和檸檬酸型的混合型嗜鐵素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述高產(chǎn)嗜鐵素的銅綠假單胞菌，其特征在于:所述菌株P(guān)A94產(chǎn)生的嗜鐵素對致病菌和真菌具有拮抗作用。
6.權(quán)利要求1所述高產(chǎn)嗜鐵素的銅綠假單胞菌菌株P(guān)A94產(chǎn)生嗜鐵素作為蔬菜種植中疾病的防護制 劑的應(yīng)用。
【文檔編號】A01N63/02GK104017759SQ201410253499
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月10日
【發(fā)明者】王宏, 朱慧明, 張彥, 楊洪江 申請人:天津雙聯(lián)科鑫生物科技有限公司, 天津科技大學(xué)