四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法，該方法為：首先確定二倍體矮牽牛減數(shù)分裂前期Ⅰ時花蕾大小與形態(tài)特征以掌握最佳處理時期，誘導(dǎo)處理時最適宜的秋水仙素濃度和處理次數(shù)等因素，掌握矮牽牛2n花粉與n花粉大小、外觀特征以快速區(qū)分鑒定，對矮牽牛雜交后代植株倍性較為實用簡易的細胞學(xué)鑒定方法。采用本發(fā)明育種方法，所獲得的有性多倍化雜交F1不但具有母本多倍體器官巨大性的特點，還具有一些來自二倍體父本的遺傳性狀，與無性多倍化途徑獲得的同源四倍體相比，具有更廣泛的遺傳多樣性、更高的觀賞性和結(jié)籽率。
【專利說明】四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于園藝植物育種領(lǐng)域，具體涉及到一種四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法。

【背景技術(shù)】
[0002]植物多倍體是指體細胞中含有三個或三個以上染色體組，因具有巨大性、抗逆性強、結(jié)實性低和營養(yǎng)成分高等特點而得到廣泛應(yīng)用，多倍體育種在現(xiàn)代育種中具有廣闊前景，目前人工誘導(dǎo)植物多倍體主要有無性多倍化和有性多倍化二種方法。
[0003](I)無性多倍化(Somatic polyploidizat1n),染色體加倍發(fā)生在有絲分裂過程中，即由染色體加倍的體細胞發(fā)育成多倍體植株。常見的誘導(dǎo)方式是物理和化學(xué)方式。物理方式有溫度激變、機械創(chuàng)傷、電離輻射、非電離輻射、離心力、熱沖擊、X和Y射線等；化學(xué)方式多為藥劑誘導(dǎo)，主要有秋水仙素、吲哚乙酸、萘駢乙烷、芫荽腦、苯及其衍生物、有機砷制劑、有機汞制劑(富民隆)等。秋水仙素是最為有效的化學(xué)誘導(dǎo)劑，它與正在有絲分裂的細胞接觸后，即可抑制微管的聚合過程，不能形成紡錘絲，使染色體不能排在赤道板上，也不能分向細胞的兩極，從而產(chǎn)生染色體加倍的細胞核，常處理種子、子葉、幼苗生長點等部位，一般為浸種和滴涂生長點。目前已在許多園藝植物種中通過秋水仙素誘變獲得了人工多倍體，培養(yǎng)出多倍體蘋果、柑橘、葡萄、金絲小棗、西瓜、白菜、黃瓜、番茄、不結(jié)球白菜、花椰菜、芹菜、蘿卜、金魚草、百合、香石竹、君子蘭等。本申請第一發(fā)明人曾于2005年利用秋水仙素化學(xué)誘導(dǎo)二倍體矮牽牛 ，通過無性多倍化途徑經(jīng)過多年選擇鑒定，培育出同源四倍體新品種‘紅霞’，該品種于2012年10月通過江蘇省農(nóng)作物品種審定委員會鑒定通過(證書編號:2012-2-9)。與原有二倍體植株相比較，具有花期延長、花瓣增大和邊緣褶皺等觀賞性增強的特點，同時植株葉片增厚、長勢增強，抗逆境能力也增加，顯示了矮牽牛多倍體育種具有較好的生產(chǎn)實踐利用前景和研究價值。
[0004]但是通過無性多倍化途徑形成的多倍體植株往往存在著混倍體、嵌合體等現(xiàn)象，誘變后代與母本的遺傳特性差異小后代變異率低，對優(yōu)良單株選擇不利，此外由于無性多倍化后結(jié)實率顯著降低對于結(jié)籽率低的有性繁殖品種不宜采用。
[0005](2)有性多倍化(Sexual polyploidizat1n)。有性多倍化是相對無性有絲分裂過程染色體加倍而言的，其途徑是誘導(dǎo)二倍體減數(shù)分裂紊亂產(chǎn)生2n配子參與受精而形成多倍體。有研究表明2n配子在植物進化過程中起著非常重要的作用，在傳遞雜合性和上位性中具有特殊的價值。但對一年生草本花卉矮牽牛尚無有性多倍化的發(fā)明專利報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供了一種四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法，采用該方法能得到遺傳多樣性、結(jié)籽率高的四倍體矮牽牛。
[0007]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:一種四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法，該方法包括如下步驟:
[0008](I) 二倍體矮牽牛減數(shù)分裂前期I時花蕾大小的確定；
[0009](2)當花蕾長度為2.5-3.0mm時進行2η雄配子的誘導(dǎo)，得到的含有2η花粉的二倍體矮牽牛作為父本；其中父本2η花粉的染色體數(shù)為2χ = 14 ;
[0010](3)有性多倍化雜交:以四倍體矮牽牛為母本，并對母本進行去雄處理，去雄處理后的母本與步驟(2)中的父本進行授粉雜交；得到F1 ；
[0011](4)雜交后RF1倍性的鑒定:第二年春季播種F1種子，成株后進行農(nóng)藝性狀、解剖學(xué)鑒定，鑒定后選取配子染色體數(shù)目2χ = 14的植株即為通過有性多倍化途徑獲得的新四倍體種質(zhì)。
[0012]有益效果:采用本發(fā)明育種方法，所獲得的有性多倍化雜交F1不但具有母本多倍體器官巨大性的特點，還具有一些來自二倍體父本的遺傳性狀，與無性多倍化途徑獲得的同源四倍體相比，具有更廣泛的遺傳多樣性、更高的觀賞性和結(jié)籽率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為未誘變處理的二倍體父本‘夢幻’的η花粉；
[0014]圖2為2η與η花粉同時存在于經(jīng)秋水仙素誘導(dǎo)的二倍體父本‘夢幻’花粉；
[0015]圖3匕花粉母細胞減數(shù)分裂后期II中一極(箭頭示)染色體數(shù)目2x = 14 ;
[0016]圖4葉片比較圖；左為二倍體父本‘夢幻’，右為雜交后代四倍體F1 ；
[0017]圖5花藥和柱頭比較(左為未經(jīng)秋水仙素誘變處理二倍體父本‘夢幻’對照，中為雜交后代四倍體匕，右為四倍體母本‘紅霞’)；
[0018]圖6氣孔比較圖；左為二倍體父本‘夢幻’，右邊的為雜交后代四倍體F1 ；
[0019]圖7花瓣比較圖；左為母本四倍體‘紅霞’，右為雜交后代四倍體F1 ；
[0020]圖8植株形態(tài):左上為二倍體父本‘夢幻’，左下為雜交后代四倍體F1，右為四倍體母本‘紅霞’。

【具體實施方式】
:
[0021]下面通過具體實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明。
[0022]實施例1:一種四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法，方法包括如下步驟:
[0023](1) 二倍體矮牽牛減數(shù)分裂前期I時花蕾大小的確定:晴天上午8:00至10:00取二倍體矮牽牛幼小花蕾，測量其長度后用卡諾氏固定液固定24h，經(jīng)體積濃度為90%、體積濃度為80%乙醇梯度脫水最后轉(zhuǎn)入體積濃度為70%乙醇4°C下保存?zhèn)溆?；? N鹽酸60°C恒溫水浴花蕾約2-3min，蒸餾水沖洗3_4次，從花蕾中剝?nèi)』ㄋ?，用質(zhì)量濃度為I %醋酸洋紅染色常規(guī)染色、壓片，火焰拷片2s分色，在100倍油鏡下對花粉母細胞減數(shù)分裂期進行觀察，確定前期I時花蕾的長度；其中卡諾氏固定液是由無水乙醇與冰醋酸按體積比為3:1混合制得。
[0024](2)當花蕾長度為2.5-3.0mm時進行2n雄配子的誘導(dǎo)，得到的含有2n花粉的二倍體矮牽牛作為父本；其中父本2n花粉的染色體數(shù)為2x = 14 ;具體方法為:采用秋水仙素溶液處理花蕾時間為早晨8:00-10:00，處理溫度25°C _32°C，誘導(dǎo)二倍體矮牽牛產(chǎn)生2n花粉的秋水仙素溶液質(zhì)量濃度分別為0.1^^0.2^^0.3%,在二倍體矮牽牛花蕾(不包括萼片)長度為2.5-3.0mm時進行處理，采用微量注射法，將注射器針頭深入花蕾中注射9-1IL秋水仙素溶液，每天處理I次，分別進行1、2、3天處理，開花后套袋隔離，以未誘變處理二倍體植株為對照；然后取花粉粒于載玻片上質(zhì)量濃度為I %醋酸洋紅染色3min后，在40倍鏡下用顯微測微尺測量花粉的直徑并結(jié)合外觀特征確認2n花粉，統(tǒng)計2n花粉百分率，表1中9個處理中確定以濃度0.2%秋水仙素處理I次效果最好，2n花粉率可達29.3%，為對照1.3%的22.5倍。其中2n花粉百分率的計算公式為:
[0025]2n花粉百分率=2n花粉數(shù)/花粉總數(shù)X 100%。
[0026]表1 9種秋水仙素處理誘導(dǎo)2n花粉效果的比較
[0027]

【權(quán)利要求】
1.一種四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: (1)二倍體矮牽牛減數(shù)分裂前期I時花蕾大小的確定； (2)當花蕾長度為2.5-3.0mm時進行2η雄配子誘導(dǎo)，得到的含有2η花粉的二倍體矮牽牛作為父本；其中父本2η花粉的染色體數(shù)為2χ =14 ； (3)有性多倍化雜交:以四倍體矮牽牛為母本，并對母本進行去雄處理，去雄處理后的母本與步驟(2)中的父本進行授粉雜交得到F1 ； (4)雜交后代F1倍性的鑒定:第二年春季播種F1種子，成株后進行農(nóng)藝性狀、解剖學(xué)鑒定，鑒定后選取配子染色體數(shù)目2χ =14的植株即為通過有性多倍化途徑獲得的新四倍體種質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法，其特征在于，步驟(1)中，于晴天上午8:00至10:00取二倍體矮牽牛幼小花蕾，測量其長度后用卡諾氏固定液固定24 h，經(jīng)體積濃度為90%、體積濃度為80%乙醇梯度脫水最后轉(zhuǎn)入體積濃度為70%乙醇4°C下保存?zhèn)溆茫挥? N鹽酸60°C恒溫水浴花蕾約2-3 min，蒸餾水沖洗3_4次，從花蕾中剝?nèi)』ㄋ?，用質(zhì)量濃度為1%醋酸洋紅染色常規(guī)染色、壓片，火焰拷片2s分色，在100倍油鏡下對花粉母細胞減數(shù)分裂期進行觀察，確定前期I時花蕾的長度；其中卡諾氏固定液是由無水乙醇與冰醋酸按體積比為3:1混合制得。
3.根據(jù)權(quán)利 要求1所述的四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法，其特征在于，步驟(2)的操作方法為:采用秋水仙素溶液處理花蕾時間為早晨8:00-10:00，處理溫度25°C -32°C,誘導(dǎo)二倍體矮牽牛產(chǎn)生2n花粉的秋水仙素溶液質(zhì)量濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%，在二倍體矮牽?；ɡ?不包括萼片)為2.5-3.0 mm時進行處理，采用微量注射法，將注射器針頭深入花蕾中注射9-lluL秋水仙素溶液，每天處理I次，分別進行1、2、3天處理，開花后套袋隔離，以未誘變處理二倍體植株為對照；然后取花粉粒于載玻片上質(zhì)量濃度為1%醋酸洋紅染色3min后，在40倍鏡下用顯微測微尺測量花粉的直徑并結(jié)合外觀特征確認2n花粉，統(tǒng)計2n花粉百分率，其中2n花粉百分率的計算公式為: 2n花粉百分率=2n花粉數(shù)/花粉總數(shù)X 100%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法，其特征在于，步驟(2)中得到的父本2n花粉形態(tài)特征為圓形或近似四邊形，直徑3 40um，有4個萌發(fā)孔，染色體數(shù)為2x =14。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法，其特征在于，步驟(3)中所述的四倍體矮牽牛為‘紅霞’。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法，其特征在于，步驟(4)中解剖學(xué)鑒定方法為:于晴天上午8:00-10:00取的植株上長度為2.6-5.8 mm幼小花蕾(不包括萼片)，用卡諾氏固定液固定24 h后，經(jīng)體積濃度為90%、體積濃度為80%乙醇梯度脫水最后轉(zhuǎn)入體積濃度為70%乙醇4°C下保存?zhèn)溆?；用I N鹽酸60°C恒溫水浴花蕾約2-3 min,蒸餾水沖洗3-4次，從花蕾中剝?nèi)』ㄋ?，用質(zhì)量濃度為1%醋酸洋紅染色常規(guī)染色、壓片，火焰拷片2s分色，在100倍油鏡下對花粉母細胞減數(shù)分裂期染色體數(shù)目進行計數(shù)，選取配子染色體數(shù)目2x=14的雜交后代植株即為通過有性多倍化途徑獲得的新四倍體矮牽牛種質(zhì)。
【文檔編號】A01H1/04GK104067931SQ201410268727
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年6月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月16日
【發(fā)明者】魏躍, 王全智, 顏志明, 楊寶林, 董慧, 嵇怡, 賈思振, 史紅林 申請人:江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院