一種冠耳霉th130914及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種冠耳霉(Conidiobolus?coronatus)TH130914及其應(yīng)用，該冠耳霉TH130914于2014年4月8日保藏于中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC?No.9019。本發(fā)明是初次從家蠅體上分離得到的菌株，培養(yǎng)比較簡單，生長快速，產(chǎn)孢量大，孢子萌發(fā)率高。其分生孢子對家蠅成蟲致病力強(qiáng)，環(huán)保無污染、不易產(chǎn)生抗藥性，可以廣泛地用于家蠅的防治。
【專利說明】-種冠耳霉TH130914及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種冠耳霉TH130914及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 家蠅Musca domestica是重要的衛(wèi)生害蟲，它不僅能污染食物使食品變質(zhì)，而且還 能通過其機(jī)體攜帶病原微生物傳播疾病。對家蠅的防治，殺蟲劑的研制也從第一代有機(jī)氯 開發(fā)到了第四代擬除蟲菊酯衛(wèi)生殺蟲劑?；瘜W(xué)殺蟲劑雖然具有見效快、成本低的優(yōu)點(diǎn)，但蠅 類的生活周期短（15?18天），分布范圍廣，繁殖能力強(qiáng)，無滯育現(xiàn)象。若常年用藥防治次 數(shù)過多，不僅會造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，而且易殺死蠅類的天敵，并使目標(biāo)害蟲產(chǎn)生抗藥性。 這些負(fù)面影響使人們在防治中更加關(guān)注起生物防治。生物防治對人、畜、植物安全，害蟲極 少或不產(chǎn)生抗性，有利于環(huán)境保護(hù)。因此，研究蠅類的生物防治，避免或減少因不合理使用 化學(xué)農(nóng)藥所帶來的抗藥性問題，已成為蠅類科學(xué)治理和可持續(xù)控制的重要課題。
[0003] 冠耳霉Conidiobolus coronatus (Cost. ) Batko屬于接合菌亞門蟲霉目新月霉科 耳霉屬。據(jù)記載，冠耳霉可侵染扁豆姆Aphis craccivora (Koch.)(同翅目：姆科）、桃蟲牙 Myzus persicae (Sulzer)(同翅目：蟲牙科）、大青葉[ll單 Tettigella viridis (Linn.)、蟻、舞毒 蛾幼蟲、毛蠓Psychoda sp等，而家蠅的侵染還未見報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種冠耳霉TH130914及其應(yīng)用，旨在克服現(xiàn)有冠耳霉未 發(fā)現(xiàn)能寄生家蠅的不足，通過生物技術(shù)手段防治蠅類，避免或減少因不合理使用化學(xué)農(nóng)藥 所帶來的抗藥性問題。
[0005] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種冠耳霉（Conidiobolus coronatus)TH130914,于 2014 年4月8日保藏于中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 9019， 保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。
[0006] 本發(fā)明的進(jìn)一步的目的在于提供上述冠耳霉TH130914在家蠅防治方面的應(yīng)用。 本發(fā)明于2012年9月，在云南省玉溪市通?？h田間調(diào)查時發(fā)現(xiàn)冠耳霉在家蠅中大量發(fā)生流 行，引起大量家蠅感染死亡。因此，該菌株是目前國內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)的寄生家蠅、流行性很強(qiáng)的 蟲生真菌，在防治家蠅中具有很大的開發(fā)應(yīng)用前景。
[0007] 本發(fā)明從罹病家蠅成蟲上分離獲得冠耳霉野生菌株，將野生菌株回接于家蠅成蟲 上復(fù)壯得到冠耳霉菌株，對該菌株采用按常規(guī)方法進(jìn)行單孢分離、培養(yǎng)得到純的、致病力強(qiáng) 的冠耳霉菌。在光學(xué)顯微鏡（400倍）可以看到在該菌株的分生孢子球形，具乳突。在SDAY 培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，生長旺盛，菌落表面白色像一層雪，少許腦折狀。背面褶皺。初生分生孢 子大小為（39. 42±3· 57) μπιΧ (32. 41±3· 04) μπι[(30· 40 ?45. 50) X (24. 76 ?40. 22)] μπι，L/D = (1.22±0. 10) [(1.01?1.38)]，次生分生孢子與初生分生孢子形狀相似，但 頂部無乳突，大小差異較大，大小為（23. 34±5. 24) μπιΧ(21.66±5. 45) μπι[(15. 87? 36. 38) X (13. 28?35. 56) ] μ m ;產(chǎn)生柔毛孢子和小分生孢子。在SDAY培養(yǎng)基上生長較快， 接種后24小時開始菌落直徑日增長0. 45cm。
[0008] 相比于現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明是初次從家蠅 體上分離得到的菌株，培養(yǎng)比較簡單，生長快速，產(chǎn)孢量大，孢子萌發(fā)率高。其分生孢子對家 蠅成蟲致病力強(qiáng)，環(huán)保無污染、不易產(chǎn)生抗藥性，可以廣泛地用于家蠅的防治。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009] 圖1是冠耳霉感染的家蠅及病原真菌的形態(tài)特征圖；其中，a圖為被冠耳霉 TH130914感染的家蠅；b圖為初生分生孢子；c.圖為次生分生孢子；d圖為小分生孢子；e圖 為柔毛孢子；f圖為分生孢子梗。

【具體實(shí)施方式】
[0010] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
[0011] 實(shí)施例一、病原菌的分離、鑒定
[0012] 1.1材料與方法
[0013] 1. 1. 1 材料
[0014] 在云南省通?？h采集到被一種蟲生真菌侵染后的摧病家蠅Boettcherisea peregrine (Diptera :Sarcophagidae)成蟲。
[0015] 薩氏培養(yǎng)基（SDAY) :1%蛋白胨+1%酵母粉+4%葡萄糖+1.5?2%瓊脂粉 +1000ml 水。
[0016] 無菌操作條件：所有的器皿和用具均經(jīng)高溫滅菌鍋（12rC，30min)，接種等操作 均在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行。
[0017] 培養(yǎng)條件：置于25°C光照（12L :12D)恒溫箱中培養(yǎng)，待菌落形成后，轉(zhuǎn)移到試管 SDAY斜面，培養(yǎng)2?3天，轉(zhuǎn)入4°C冰箱儲存。
[0018] 1. 1. 2病原菌的分離和純化
[0019] 分離：從罹病家蠅成蟲尸體上分離病原菌。將家蠅成蟲罹病蟲體帶回實(shí)驗(yàn)室，將處 理好的家蠅成蟲尸體用雙面膠粘于培養(yǎng)蓋上，再將該培養(yǎng)皿蓋蓋于含有SDAY培養(yǎng)基的培 養(yǎng)皿上。在溫度為25°C條件下培養(yǎng)，長出菌絲后按常規(guī)方法進(jìn)行單孢分離、培養(yǎng)得到純的、 產(chǎn)孢能力強(qiáng)的菌株冠耳霉C. coronatus(Cost. )Batko,轉(zhuǎn)移到SDAY斜面上生長3?4天，在 4 °C冰箱儲存。
[0020] 復(fù)壯：將分離到的菌株在SDAY上培養(yǎng)2?3天后，產(chǎn)生大量分生孢子，再將該分 生孢子挑入含1%吐溫-80的無菌水，用玻璃棒攪拌均勻，得到適當(dāng)濃度（10 8孢子/ml)的 孢子懸浮液，用小型噴霧器均勻噴于家蠅成蟲體表（以蟲體表面濕潤為度），保持相對濕度 80%以上。收集死蟲并保濕，得到的成蟲蟲尸再按以上方法分離得到致病力更強(qiáng)的菌株。
[0021] 純化：挑取培養(yǎng)基上分生孢子粉，再次接種在新的培養(yǎng)基上。如此培養(yǎng)2?3代， 菌株就被純化。
[0022] 1.1. 3病原菌的鑒定
[0023] 根據(jù)病原菌的培養(yǎng)性狀、菌絲和分生孢子的形態(tài)進(jìn)行鑒定。利用40X 10倍顯光學(xué) 微鏡，鏡檢菌絲、絨毛孢子和分生孢子的形態(tài)。
[0024] 1. 2 結(jié)果
[0025] 從被蟲生真菌自然侵染的家蠅成蟲蟲體上分離獲得野生菌株，在薩氏瓊脂培養(yǎng)基 (SDAY)上培養(yǎng)，并回接于家蠅成蟲復(fù)壯獲得一菌株，對該菌株進(jìn)行單菌絲分離獲得純化的 菌株，即冠耳霉TH130914。
[0026] 在光學(xué)顯微鏡（400倍）下，如圖1所示，可以看到初生分生孢子大小為 (39. 42±3· 57) μ mX (32. 41±3· 04) μ m[(30. 40 ?45. 50) X (24. 76 ?40. 22)] μ m， L/D = (1. 22±0. 10) [(1.01?1. 38)]，次生分生孢子與初生分生孢子形狀相似，但頂 部無乳突，大小差異較大，大小為（23. 34±5. 24) μπιΧ (21.66±5. 45) μπι[(15. 87? 36. 38) X (13. 28?35. 56) ] μ m ;具柔毛孢子和小分生孢子。
[0027] 根據(jù)田間感染癥狀\采集罹病蟲體室內(nèi)分離觀察，并根據(jù)《中國真菌志第十三卷： 蟲霉目》（李增智，2000)有關(guān)冠耳霉感染癥狀、分生孢子及柔毛孢子和小分生孢子的形態(tài)特 征進(jìn)行鑒定，確定為冠耳霉。
[0028] 實(shí)施例二、冠耳霉純化菌株生物學(xué)特性
[0029] 2. 1材料與方法
[0030] 2. 1. 1供試菌株
[0031] 選擇純化后生長旺盛、生長均勻的一皿作為供試菌株。取菌絲再次接種到SDAY 上，于25°C的恒溫光照（12L:12D)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0032] 2. 1. 2菌落生長速率和產(chǎn)孢量的測定
[0033] 將事先培養(yǎng)好的冠耳霉取一皿用8mm的打孔器打孔，接種于另外一個培養(yǎng)基上， 做3個重復(fù)，置于25°C的恒溫光照（12L:12D)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天定時測定其直徑并記錄， 直到菌落長滿培養(yǎng)基為止。用直徑為8_的打孔器在培養(yǎng)基相同的位置取菌餅，加1 %吐 溫-80和15mL SDY (薩氏培養(yǎng)液）中，25°C、80r/min振蕩培養(yǎng)48h，再轉(zhuǎn)入40mL SDY (薩氏 培養(yǎng)液）中，恒溫箱中培養(yǎng)48h，所得菌液為初始接種液。初始接種液每10ml轉(zhuǎn)到含40mL 的SDY (薩氏培養(yǎng)液）中在20°C，80r/min振蕩培養(yǎng)72h，取菌液15ml均勻涂布于水瓊脂平 板（90_)上，用濾紙吸去多余水分，5點(diǎn)法放置5塊蓋玻片（15 X15mm)。產(chǎn)孢盛期將平板 倒置，使暴露在平板上主動彈落的分生孢子落下，每隔4h時更換蓋玻片，在顯微鏡下每個 蓋玻片上觀察3個視野，記數(shù)單位面積上孢子數(shù)量。同時，另取10mL菌絲液移至事先稱重 的濾紙上，用蒸餾水清洗3次后，在50°C下烘干3h后測定菌絲干重。
[0034] 單位菌絲體產(chǎn)孢量（孢子/mg)，C的計算公式為C = D π rV (VW)，其中D為累計產(chǎn) 孢濃度（孢子，mm2)，r為水瓊脂平板半徑，V為菌液體積，W為菌絲生物量（mg/mL) (Feng et al. , 1998) 〇
[0035] 2. 1. 3孢子萌發(fā)率的測定
[0036] 將菌株培養(yǎng)2?3天，分別用無菌水收集分生孢子，制成懸浮液，用帶凹槽的載玻 片測定孢子萌發(fā)率。將孢子懸浮液直接滴在無菌載玻片上，置于底鋪濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，滴加 幾滴無菌水保持濕度在100% RH，培養(yǎng)24小時后鏡檢，每個處理3次重復(fù)。
[0037] 2. 2 結(jié)果
[0038] 在SDAY培養(yǎng)上于25°C條件下生長良好，表1結(jié)果表明，培養(yǎng)前3天時菌落直徑 平均生長速度為0. 76cm/d，其中在培養(yǎng)24、32、36h時菌落生長速度分別為3. 34,4. 71和 6. 02cm/d。表2結(jié)果表明，該菌株產(chǎn)孢快、產(chǎn)孢量較高，培養(yǎng)至第2天時產(chǎn)孢量可達(dá)6. 7 X 105 孢子/mg。表3結(jié)果表明，24小時孢子的萌發(fā)率平均可以達(dá)到85%左右，表明該菌株的生長 情況較好，生物學(xué)活性較好。
[0039] 表1菌落直徑的生長速度
[0040]

【權(quán)利要求】
1. 一種冠耳霉（Conidiobolus coronatus) TH130914,于2014年4月8日保藏于中國微 生物保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 9019。
2. 權(quán)利要求1所述的冠耳霉TH130914在家蠅防治方面的應(yīng)用。
【文檔編號】A01N63/04GK104059856SQ201410279668
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月20日
【發(fā)明者】肖關(guān)麗, 杜廣祖, 陳斌, 李正躍, 桂富榮, 和淑琪, 嚴(yán)乃勝 申請人:肖關(guān)麗