專(zhuān)利名稱：赤紅球菌zjb－064及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從土壤中篩選到的微生物新菌株赤紅球菌ZJB-064(Rhodococcus ruber ZJB-064)，及其在制備對(duì)羥基苯乙酰胺中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1990年，丹麥的Novo Industri A/S報(bào)道了能水合非環(huán)式、環(huán)式和雜環(huán)腈以及能水合含酸性或堿性基團(tuán)腈的水合酶。其中該酶能轉(zhuǎn)化的底物包括對(duì)羥基苯乙腈，同時(shí)證明苯環(huán)上對(duì)位吸電子基團(tuán)取代能促進(jìn)酶的水合作用，相反吸電子基團(tuán)取代會(huì)抑制酶的水合作用。但目前國(guó)內(nèi)外并沒(méi)有直接報(bào)道以對(duì)羥基苯乙腈為底物，用微生物法合成對(duì)羥基苯乙酰胺。
對(duì)羥基苯乙腈，英文名為p-hydroxylacetonitrile，簡(jiǎn)稱PHN，分子式為C8H7NO，重要的基團(tuán)有一個(gè)乙氰基(-CH2CN)，一個(gè)羥基(-OH)。黃色晶體熔點(diǎn)67～71℃，沸點(diǎn)756mmHg下為330℃，有刺激性及毒性。
對(duì)羥基苯乙酰胺，英文名為p-hydroxyphenylacetaminde，簡(jiǎn)稱PHAD，分子式為C8H9NO2，重要的基團(tuán)有一個(gè)乙酰胺基(-CH2CONH2)，一個(gè)羥基(-OH)。通常是白色或黃色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)為151～153℃。
對(duì)羥基苯乙酰胺為合成阿替洛爾(Atenolol)的重要中間體。阿替洛爾又叫氨酰心胺，是一種新的β1-腎上腺素能受體阻滯劑，對(duì)心臟的β1受體有選擇的阻滯作用。ASIST研究比較了β1受體阻滯劑阿替洛爾對(duì)缺血性心臟病人的長(zhǎng)期預(yù)后影響，與安慰劑比較阿替洛爾可明顯降低死亡、心肌梗死、心臟病發(fā)作次數(shù)及入院率，突然減少β1受體阻滯劑用量使病人病情惡化。
臨床研究結(jié)果表明β1受體阻滯劑阿替洛爾能有效預(yù)防心臟X綜合征患者的心絞痛癥狀，優(yōu)于硝酸酯、二氫吡啶類(lèi)。對(duì)一組應(yīng)用β受體阻滯劑治療心肌梗死的薈萃分析顯示，于心肌梗死后3～4天加用β受體阻滯劑，無(wú)內(nèi)在擬交感活性的β受體阻滯劑可使心肌梗死的死亡率降低30％，優(yōu)于有內(nèi)在擬交感活性的β受體阻滯劑，預(yù)防作用源于對(duì)β受體阻滯劑。通常，冠心病或心肌梗死后發(fā)生的心力衰竭病人仍有心肌缺血存在，60％以上的心力衰竭由心肌缺血引起，β受體阻滯劑治療也同樣有效。
45年前β受體阻滯劑用于臨床，至今重要性有增無(wú)減，并且獲得了令人振奮的證據(jù)。β受體阻滯劑治療心絞痛，通過(guò)降低心肌耗氧量、控制心肌缺血而預(yù)防冠心病發(fā)作、改善預(yù)后。阿替洛爾已成為臨床最受重視的β1受體阻滯劑，是專(zhuān)科醫(yī)院治療心血管疾病的常用藥物。因此，對(duì)羥基苯酰胺作為合成阿替洛爾的重要中間體同時(shí)也具有很好的市場(chǎng)應(yīng)用前景，目前國(guó)內(nèi)外主要采用化學(xué)法合成對(duì)羥基苯乙酰胺，化學(xué)法合成通常存在周期長(zhǎng)，處理步驟繁復(fù)，原材料消耗大，污染嚴(yán)重等問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供利用水合作用將對(duì)羥基苯乙腈轉(zhuǎn)化為對(duì)羥基苯乙酰胺的赤紅球菌屬新菌株及其在制備對(duì)羥基苯乙酰胺中的應(yīng)用。
為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是赤紅球菌ZJB-064(Rhodococcus ruber ZJB-064)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NoM206040，保藏日期2006年4月14日，提議的分類(lèi)命名為赤紅球菌ZJB-064。
所述赤紅球菌ZJB-064由以下途徑篩選得到富集培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件葡萄糖10g/L，K2HPO40.8g/L，KH2PO43.3g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，NaCl 1g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 10mg/L，CaCl215mg/L，對(duì)羥基苯乙腈1g/L，pH 7.0～7.2。1.0×105Pa滅菌20min。培養(yǎng)條件28℃，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，每批土樣通過(guò)三次富集，每次富集時(shí)間3～4d。
菌種初篩將各地采集的土樣各稱取1g分別均勻分散與10mL蒸餾水中。然后取以上土樣的懸濁液3mL加入到30mL滅好菌的富集培養(yǎng)基中，放于搖床中培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)3次富集的土樣進(jìn)行稀釋?zhuān)⑻荻葹?0-8、10-9、10-10涂布于分離平板，放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3d，然后挑取生長(zhǎng)形態(tài)不同的菌株于斜面中培養(yǎng)進(jìn)行編號(hào)，作為復(fù)篩的對(duì)象。
菌種復(fù)篩將初篩菌種接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床振蕩培養(yǎng)2d后，加入0.3g/L的對(duì)羥基苯乙腈做為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)培養(yǎng)48h。誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌種通過(guò)離心，再用生理鹽水洗滌2次，得到菌體在pH7.0的磷酸鹽緩沖液中轉(zhuǎn)化，底物濃度為1g/L，轉(zhuǎn)化液通過(guò)液相檢測(cè)，能水合對(duì)羥基苯乙腈為對(duì)羥基酰胺的菌株為目的菌株。
用于篩選微生物的土樣來(lái)自各種可分離到微生物的樣品，如果園、農(nóng)田、污水處理站等。
所述的赤紅球菌ZJB-064細(xì)胞形態(tài)為圓形、紅色、表面有花紋，芽孢中生，革蘭氏染色陽(yáng)性，所述的赤紅球菌ZJB-064生化實(shí)驗(yàn)過(guò)氧化氫酶陰性，兼好氧，氧化鎂試驗(yàn)陰性，淀粉水解陰性，V.P.試驗(yàn)陰性，M.R.試驗(yàn)陰性，酪素水解陽(yáng)性，硝酸鹽還原陽(yáng)性，脲酶試驗(yàn)陰性。以上為對(duì)赤紅球菌ZJB-064的細(xì)胞形態(tài)與生理生化特征的部分描述，詳細(xì)描述見(jiàn)表1表1赤紅球菌ZJB-064菌株生理生化特征的科學(xué)描述
注表中+表示陽(yáng)性，-表示陰性，++表示非常明顯。
以提取到的細(xì)胞總DNA為模板，利用引物p16S-85′-aga gttt gat cctggc tca g-3′和p16S-15415′-aag gag gtg atc cag ccg ca-3′擴(kuò)增菌株的16SrDNA基因，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)PCR擴(kuò)增成功獲得了一長(zhǎng)約為1.5kb的片段，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)該片段實(shí)際長(zhǎng)度為1463bp，其序列如下TGGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCAGCTTGCTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCTCGGGATGCATGTTCCGGGGTGGAAAGGTTTTCCGGTGCAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGTACCGACGAAGCGCAAGTGACGGTAGGTACAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGTCTGTGAAAACCCGCAGCTCAACTGCGGGCTTGCAGGCGATACGGGCAGACTTGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTGTGGGTTTCCTTCCACGGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATACACCGGACCGCCCCAGAGATGGGGTTTCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGGACTCGCAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTCGTGGGAGGGAGCCGTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAAGTCGTAA。
將該序列(已提交GenBank，GenBank登記號(hào)為No.DQ468352)與GenBank中相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行相似性分析發(fā)現(xiàn)，與赤紅球菌的同源性最高(homology，100％/1463bps，based on 16S rDNA)。同已知的細(xì)菌16SrDNA序列進(jìn)行比對(duì)，利用Phylips(version 3.572)軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(如圖1)，確定菌株ZJB-064的進(jìn)化地位，生理生化鑒定結(jié)合分子鑒定，可確認(rèn)該菌株為赤紅球菌，擬命名為Rhodococcus ruber ZJB-064。
對(duì)羥基苯乙腈(簡(jiǎn)稱PHN)通過(guò)水合作用生成對(duì)羥基苯乙酰胺(簡(jiǎn)稱PHAD)的反應(yīng)式如下 所述的赤紅球菌ZJB-064通過(guò)水合作用轉(zhuǎn)化對(duì)羥基苯乙腈制備對(duì)羥基苯乙酰胺。所述的應(yīng)用是將赤紅球菌ZJB-064菌種接種到適用于赤紅球菌的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，然后離心或過(guò)濾，得到菌體，將菌體細(xì)胞或處理過(guò)的菌體細(xì)胞添加到對(duì)羥基苯乙腈溶液中進(jìn)行水合反應(yīng)，最后對(duì)轉(zhuǎn)化液進(jìn)行分離，即得所述的對(duì)羥基苯乙酰胺。所述處理過(guò)的菌體細(xì)胞是指經(jīng)處理后得到的粗酶、固定化細(xì)胞、固定化酶。
用于本發(fā)明赤紅球菌ZJB-064菌種的產(chǎn)酶培養(yǎng)基含有可以被所述菌株利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)基中合理配入上述微生物能利用的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等?？勺鳛樘荚吹挠衅咸烟?、乳糖、麥芽糖、糊精、淀粉、甘油、甘露醇、山梨醇、油脂類(lèi)(豆油、豬油等)；可作為氮源的有肉汁、酵母膏、干酵母、大豆粉、玉米漿、蛋白胨、尿素、氨鹽(硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、醋酸胺等)，肽類(lèi)(二肽、三肽等)；無(wú)機(jī)鹽類(lèi)有Na、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn、Co、Ni等金屬鹽類(lèi)和磷酸鹽、醋酸鹽等有機(jī)酸鹽類(lèi)；另可加有氨基酸類(lèi)(如谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸等)、微生素(VB1、VB2、VB12、VC、VE、煙酸等)、核酸類(lèi)(如嘌呤、嘧啶及其衍生物等)。用無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸、堿類(lèi)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值。
本發(fā)明所用產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，尿素7.5g/L，谷氨酸鈉0.75g/L，K2HPO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，Mg2SO40.5g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 10mg/L，CoCl210mg/L，pH7.0～7.2，余量為去離子水；培養(yǎng)條件為pH6～8、溫度20～35℃下培養(yǎng)1～3天。優(yōu)選在pH6.5～7.5、溫度28～32℃條件下培養(yǎng)2天。
酶活力單位在一定條件下，1min轉(zhuǎn)化底物得到1μmol對(duì)羥基苯乙酰胺所需的酶量為1個(gè)酶活力單位U，單位為μmol/min。
所述水合反應(yīng)的反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度5～50℃，反應(yīng)pH 5～10，反應(yīng)2～4小時(shí)。優(yōu)選反應(yīng)條件溫度45℃，pH6.0～7.0下反應(yīng)2小時(shí)。將細(xì)胞或固定化處理過(guò)的細(xì)胞(粗酶、固定化細(xì)胞、固定化酶等)懸浮在水、或緩沖液、也可以是生理鹽水中，然后加入底物對(duì)羥基苯乙腈。加入底物對(duì)羥基苯乙腈的方式有多種，可以一次性加入，也可以逐漸地，以可控制的方式連續(xù)加入腈化合物，底物濃度最大達(dá)到20g/L。
本發(fā)明中作為生物催化劑的微生物細(xì)胞或處理過(guò)的細(xì)胞(粗酶、固定化細(xì)胞、固定化酶等)可以重復(fù)利用。
所述轉(zhuǎn)化液分離方法為將轉(zhuǎn)化液離心或過(guò)濾除去菌體細(xì)胞，上清夜或?yàn)V液置于4℃冰箱中結(jié)晶得到所述對(duì)羥基苯乙酰胺的晶體。
如果適當(dāng)?shù)乜刂品磻?yīng)和產(chǎn)物分離條件，對(duì)羥基苯乙酰胺的產(chǎn)率達(dá)到98％以上，產(chǎn)品純度達(dá)到99％以上。
優(yōu)選的，所述對(duì)羥基苯乙酰胺制備方法如下(1)產(chǎn)酶培養(yǎng)葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，尿素7.5g/L，谷氨酸鈉0.75g/L，K2HPO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，Mg2SO40.5g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 10mg/L，CoCl210mg/L，pH7.0～7.2，余量為去離子水，滅菌，接種赤紅球菌ZJB-064菌種；培養(yǎng)條件為pH6.5～7.5、溫度28～32℃下培養(yǎng)2天，培養(yǎng)液離心收集菌體，用pH7.0，0.1mol/L的磷酸鈉緩沖液洗滌兩次后，離心收集菌體，冷藏備用；(2)水合反應(yīng)將步驟(1)所得菌體與底物對(duì)羥基苯乙腈均勻分散于pH7.0、0.1mol/L的磷酸鈉緩沖液中，配成含濕菌體0.01g/mL、含底物10g/L的反應(yīng)液，45℃水浴、pH6.0～7.0下反應(yīng)2小時(shí)；(3)產(chǎn)物分離將轉(zhuǎn)化液過(guò)濾除去菌體細(xì)胞，濾液置于4℃冰箱中結(jié)晶得到所述對(duì)羥基苯乙酰胺的晶體。
本發(fā)明中的檢測(cè)分析方法(1)薄層層析(TLC)轉(zhuǎn)化液通過(guò)離心，用毛細(xì)管點(diǎn)樣于硅膠板，在乙醇∶水＝95∶5(v/v)的展開(kāi)劑中展開(kāi)后，放入到典缸中顯色。對(duì)羥基苯乙腈Rf＝0.854對(duì)羥基苯乙酰胺Rf＝0.813。
(2)高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)轉(zhuǎn)化液通過(guò)離心、過(guò)濾后用HPLC檢測(cè)。流動(dòng)相為(v/v)甲醇∶水∶TNF∶乙酸＝35∶65∶1∶1，流速為1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為274nm，進(jìn)樣量為20μl。
本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在通過(guò)篩選得到一株新的菌種用于生物法合成對(duì)羥基苯乙酰胺，具有轉(zhuǎn)化率高，環(huán)境友好，過(guò)程綠色等優(yōu)點(diǎn)。該菌種可以將高毒性的腈類(lèi)化合物水解成危害較小的酰胺類(lèi)物質(zhì)，生物法是迄今處理工業(yè)廢水中高毒性腈化合物最經(jīng)濟(jì)、最有效的一種方法，所以本發(fā)明在環(huán)境治理上也具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。


圖1為赤紅球菌ZJB-064與相關(guān)菌株的進(jìn)化樹(shù)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1產(chǎn)酶培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，尿素7.5g/L，谷氨酸鈉0.75g/L，K2HPO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，Mg2SO40.5g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O10mg/L，CoCl210mg/L，余量為去離子水，pH7.0～7.2。121℃滅菌20min，接種赤紅球菌ZJB-064菌種，在pH6.5～7.5、溫度28～32℃條件下培養(yǎng)2天。
將培養(yǎng)液離心(12000rpm)，收集菌體，用pH7.0，0.1mol/L的磷酸鈉緩沖液洗滌兩次后，離心收集赤紅球菌ZJB-064菌體，冷凍保藏以備用。
將冷凍保藏于冰箱中的菌體均勻分散于pH7.0，0.1mol/L的磷酸鈉緩沖液中，配置成含濕菌體濃度約為0.05、0.1、0.15、0.2g/mL的菌懸液。
在4個(gè)磨口三角瓶中，分別加入18mL含底物濃度為2.222g/L的磷酸鈉緩沖液(pH7.0，0.1mol/L)，每個(gè)三角瓶中分別加入以上菌懸液2mL，測(cè)定對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)化液OD為2.042、4.084、6.126、8.168(稀釋到OD線性范圍測(cè)定)，底物濃度為2g/L，轉(zhuǎn)化液分別編號(hào)為1，2，3，4。在30℃的水浴搖床中轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)速為150rpm。轉(zhuǎn)化30、60min各取樣1mL，然后立即離心、過(guò)濾、HPLC檢測(cè)。
轉(zhuǎn)化液中濕菌體終濃度為0.005g/mL(OD＝2.042)時(shí)其比活力最高，比活力隨菌體量的增加反而降低。而轉(zhuǎn)化液中產(chǎn)物達(dá)到相同的收率所需的時(shí)間隨轉(zhuǎn)化液中菌體量的增加而減少，實(shí)驗(yàn)通過(guò)綜合考察轉(zhuǎn)化液中赤紅球菌ZJB-064靜息細(xì)胞的酶活力、比活力，選擇轉(zhuǎn)化液中濕菌體終濃度為0.01g/mL(OD＝4.084)。
實(shí)施例2制備赤紅球菌ZJB-064菌體與實(shí)施例1同。
用HAc-NaAc緩沖液配成pH分別為3.6，4.0，4.4，4.8，5.2，5.6的溶液，用NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液配成pH分別為6.2，6.6，7.0，7.4，7.8的溶液，用Gly-NaOH配成pH為8.6，9.0，9.4，9.8，10.4，10.6的溶液，三種緩沖液的濃度均為0.1mol/L。同時(shí)配制含濕菌體濃度約為0.1g/mL的菌懸液。
轉(zhuǎn)化液中分別加入各種pH值的緩沖液10mL，再加入8mL含底物濃度為12.5g/L的腈水溶液，然后再加入2mL菌體懸液，使轉(zhuǎn)化液的底物終濃度為5g/L，測(cè)定轉(zhuǎn)化液OD值為4.186。由于轉(zhuǎn)化液中的緩沖液被稀釋?zhuān)琾H值發(fā)生改變，用pH計(jì)測(cè)定重新確定轉(zhuǎn)化液的pH值。轉(zhuǎn)化液放于30℃水浴中轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)速為150rpm，轉(zhuǎn)化60min取樣、離心、過(guò)濾，HPLC檢測(cè)。
轉(zhuǎn)化液初始pH在接近6.0～7.0的范圍內(nèi)其酶活力最高，在pH值低于4.5的范圍內(nèi)其活性基本接近于0。同時(shí)不同的緩沖液體系對(duì)赤紅球菌ZJB-064靜息細(xì)胞酶活力的影響也較大，在HAc-NaAc緩沖液體系中，其酶活力較低，在NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液中其活力急劇上升。因此選擇NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液作為轉(zhuǎn)化液體系，最佳pH值為6.0～7.0。
實(shí)施例3制備赤紅球菌ZJB-064菌體與實(shí)施例1同。
用磷酸緩沖液(pH7.0，0.1mol/L)配制含PHN為5.555、11.111和22.222g/L的腈緩沖溶液，同時(shí)配置含菌體量為0.1g/mL的菌懸液。在50mL磨口三角瓶中分別加入18mL以上配置好的腈緩沖溶液，再用移液槍在每個(gè)三角瓶中同時(shí)加入2mL菌懸液，使轉(zhuǎn)化液中底物終濃度分別為5g/L、10g/L和20g/L，濕菌體終濃度為0.01g/mL，不同底物濃度的轉(zhuǎn)化液各做兩個(gè)平行。然后放入30℃的水浴搖床中轉(zhuǎn)化，搖床轉(zhuǎn)速為150rpm，每間隔20min取樣1mL，立即離心、過(guò)濾，用HPLC跟蹤轉(zhuǎn)化情況。
底物濃度為5g/L和10g/L時(shí)，分別轉(zhuǎn)化60和75min，底物完全轉(zhuǎn)化，生成PHAD。而底物濃度為20g/L時(shí)，赤紅球菌ZJB-064靜息細(xì)胞的活性基本都被抑制，轉(zhuǎn)化24h仍只有少量PHAD生成。底物濃度為10g/L生成的PHAD的收率約為95％。
實(shí)施例4制備菌體與實(shí)施例1同。
將PHN直接溶于磷酸緩沖液中(pH7.0，0.1mol/L)，配置成終濃度分別為6g/L，7g/L，8g/L，9g/L，10g/L，12g/L，14g/L，16g/L，20g/L的腈溶液。轉(zhuǎn)化時(shí)各加0.2g濕菌體均勻懸浮于20mL以上各種濃度的腈溶液中，在水浴搖床中轉(zhuǎn)化，t＝30℃，r＝150rpm。轉(zhuǎn)化100min取樣、離心、過(guò)濾，HPLC檢測(cè)。
底物終濃度在低于10g/L時(shí)其酶活力隨底物濃度的增加而增加，在底物終濃度為10g/L時(shí)其對(duì)應(yīng)的酶活力最高，隨著底物濃度繼續(xù)增加，酶活力下降較快，在底物終濃度為20g/L時(shí)，酶活力降為最高酶活力的1/13，說(shuō)明底物高于10g/L對(duì)赤紅球菌ZJB-064靜息細(xì)胞酶活力抑制比較明顯。低濃度下的底物抑制視為反競(jìng)爭(zhēng)性抑制，求出Km＝0.29mol/L和Vmax＝183.824μmol/min/g。
實(shí)施例5
制備菌體與實(shí)施例1同。
用磷酸緩沖液(pH7.0，0.1mol/L)配制含PHAD為10g/L的腈緩沖溶液，然后用該腈緩沖溶液配制分別含PHAD終濃度為5g/L、10g/L、12g/L、15g/L、17g/L、20g/L的混合溶液。取以上各種含PHAD不同終濃度的混合溶液20mL放于50mL磨口三角瓶中，然后每瓶加入0.2g濕菌體并均勻分散，再放入30℃水浴中轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)速為150rpm，間隔1h取樣、離心、過(guò)濾，HPLC檢測(cè)。
產(chǎn)物對(duì)赤紅球菌ZJB-064靜息細(xì)胞的酶活力沒(méi)有很明顯的影響。轉(zhuǎn)化液中初始PHAD濃度為5g/L和20g/L時(shí)的酶活力分別為10.5121和8.1291U。
實(shí)施例6制備菌體與實(shí)施例1同。
量取30mL磷酸緩沖液(pH7.0，0.01mol/L)于50mL三角瓶中，同時(shí)三角瓶中加入一定量的玻璃珠。稱取冷凍保藏的濕菌體3g，加入到以上三角瓶中搖晃，使菌體均勻分散，菌懸液濃度為0.1g/rnL。
取兩個(gè)50mL磨口三角瓶，分別加入9mL含底物為11.111g/L的腈緩沖液，在測(cè)定溫度下保溫10min，使緩沖液溫度與水浴達(dá)到平衡，然后加入1mL菌懸液，使轉(zhuǎn)化液的底物終濃度為10g/L。測(cè)定的不同溫度分別為15、30、35、45、55、65、75℃，在相同的溫度下分別做兩個(gè)平行，水浴轉(zhuǎn)速為150rpm，轉(zhuǎn)化1h取樣、離心、過(guò)濾，用HPLC檢測(cè)。
溫度對(duì)ZJB-064靜息細(xì)胞活性的影響呈鐘罩形變化。在45℃附近赤紅球菌ZJB-064靜息細(xì)胞的活性達(dá)到高峰，酶活力為12.192U。溫度低于45℃，此靜息細(xì)胞的活性隨溫度的升高而增加，當(dāng)溫度高于45℃時(shí)，此靜息細(xì)胞的活性急速下降，在溫度為65℃時(shí)，基本失去酶活。
實(shí)施例7制備菌體與實(shí)施例1同。
準(zhǔn)備兩個(gè)50mL的三角瓶，分別量取20mL磷酸緩沖液(pH7.0，0.01mol/L)于兩個(gè)三角瓶中，同時(shí)加入一定量的玻璃珠。分別稱取冷凍保藏的菌體2g，加入到以上三角瓶中搖晃，使菌體均勻分散。
將菌懸液放置到溫度分別為50、55℃的水浴中，菌懸液與水浴溫度達(dá)到平衡后開(kāi)始計(jì)時(shí)，每間隔10min各取出保溫中菌懸液2mL。同時(shí)準(zhǔn)備4個(gè)50mL磨口三角瓶，分別加入9mL含底物為11.111g/L的腈緩沖液，并加入取出的保溫一定時(shí)間的菌懸液1mL，使轉(zhuǎn)化液的底物終濃度為10g/L，每個(gè)溫度各個(gè)保溫時(shí)間做兩個(gè)平行，然后放于30℃水浴中轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)速為150rpm，轉(zhuǎn)化1h取樣、離心、過(guò)濾，用HPLC檢測(cè)。
赤紅球菌ZJB-064靜息細(xì)胞的活性隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng)其活性降低，50℃時(shí)其活性降低相對(duì)比較平緩，在55℃的條件下其活性隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng)急劇下降，保溫時(shí)間為100min中時(shí)，其酶活力將為原來(lái)的1/7。
序列表.WorkFileApplication Project-------------------<120>Title赤紅球菌ZJB-064及其應(yīng)用<130>AppFileReference<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate____-__-__Sequence--------<213>OrganismName<400>PreSequenceStringtgggctcagg acgaacgctg gcggcgtgct taacacatgc aagtcgaacg atgaagccca60gcttgctggg tggattagtg gcgaacgggt gagtaacacg tgggtgatct gccctgcact120tcgggataag cctgggaaac tgggtctaat accggatagg acctcgggat gcatgttccg180gggtggaaag gttttccggt gcaggatggg cccgcggcct atcagcttgt tggtggggta240acggcccacc aaggcgacga cgggtagccg gcctgagagg gcgaccggcc acactgggac300tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac aatgggcgca360agcctgatgc agcgacgccg cgtgagggat gacggccttc gggttgtaaa cctctttcag420taccgacgaa gcgcaagtga cggtaggtac agaagaagca ccggccaact acgtgccagc480agccgcggta atacgtaggg tgcgagcgtt gtccggaatt actgggcgta aagagctcgt540aggcggtttg tcgcgtcgtc tgtgaaaacc cgcagctcaa ctgcgggctt gcaggcgata
序列表.WorkFile600cgggcagact tgagtactgc aggggagact ggaattcctg gtgtagcggt gaaatgcgca660gatatcagga ggaacaccgg tggcgaaggc gggtctctgg gcagtaactg acgctgagga720gcgaaagcgt gggtagcgaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacggtgg780gcgctaggtg tgggtttcct tccacgggat ccgtgccgta gctaacgcat taagcgcccc840gcctggggag tacggccgca aggctaaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc900ggcggagcat gtggattaat tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctgggt ttgacataca960ccggaccgcc ccagagatgg ggtttccctt gtggtcggtg tacaggtggt gcatggctgt1020cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgtcctg1080tgttgccagc acgtaatggt ggggactcgc aggagactgc cggggtcaac tcggaggaag1140gtggggacga cgtcaagtca tcatgcccct tatgtccagg gcttcacaca tgctacaatg1200gccggtacag agggctgcga taccgcgagg tggagcgaat cccttaaagc cggtctcagt1260tcggatcggg gtctgcaact cgaccccgtg aagtcggagt cgctagtaat cgcagatcag1320caacgctgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcacg tcatgaaagt1380
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權(quán)利要求
1.赤紅球菌ZJB-064(Rhodococcus ruber ZJB-064)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NoM 206040，保藏日期2006年4月14日。
2.如權(quán)利要求1所述的赤紅球菌ZJB-064，其特征在于所述的赤紅球菌ZJB-064的16S rDNA部分核苷酸序列如下TGGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCAGCTTGCTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCTCGGGATGCATGTTCCGGGGTGGAAAGGTTTTCCGGTGCAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGTACCGACGAAGCGCAAGTGACGGTAGGTACAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGTCTGTGAAAACCCGCAGCTCAACTGCGGGCTTGCAGGCGATACGGGCAGACTTGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTGTGGGTTTCCTTCCACGGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATACACCGGACCGCCCCAGAGATGGGGTTTCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGGACTCGCAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTCGTGGGAGGGAGCCGTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAAGTCGTAA。
3.如權(quán)利要求1所述的赤紅球菌ZJB-064，其特征在于所述的赤紅球菌ZJB-064細(xì)胞形態(tài)為圓形、紅色、表面有花紋，芽孢中生，革蘭氏染色陽(yáng)性，所述的赤紅球菌ZJB-064生化實(shí)驗(yàn)過(guò)氧化氫酶陰性，兼好氧，氧化鎂試驗(yàn)陰性，淀粉水解陰性，V.P.試驗(yàn)陰性，M.R.試驗(yàn)陰性，酪素水解陽(yáng)性，硝酸鹽還原陽(yáng)性，脲酶試驗(yàn)陰性。
4.如權(quán)利要求1～3之一所述的赤紅球菌ZJB-064在制備對(duì)羥基苯乙酰胺中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的赤紅球菌ZJB-064在制備對(duì)羥基苯乙酰胺中的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用是將赤紅球菌ZJB-064菌種接種到適用于赤紅球菌的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，然后對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行離心或過(guò)濾，得到菌體，將菌體細(xì)胞或處理過(guò)的菌體細(xì)胞添加到對(duì)羥基苯乙腈溶液中進(jìn)行水合反應(yīng)，最后對(duì)轉(zhuǎn)化液進(jìn)行分離，即得所述的對(duì)羥基苯乙酰胺。
6.如權(quán)利要求5所述的赤紅球菌ZJB-064在制備對(duì)羥基苯乙酰胺中的應(yīng)用，其特征在于所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，尿素7.5g/L，谷氨酸鈉0.75g/L，K2HPO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，Mg2SO40.5g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 10mg/L，CoCl210mg/L，pH7.0～7.2，余量為去離子水；培養(yǎng)條件為pH6～8、溫度20～35℃下培養(yǎng)1～3天。
7.如權(quán)利要求5所述的赤紅球菌ZJB-064在制備對(duì)羥基苯乙酰胺中的應(yīng)用，其特征在于所述水合反應(yīng)的反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度5～50℃，反應(yīng)pH 5～10，反應(yīng)2～4小時(shí)。
8.如權(quán)利要求5所述的赤紅球菌ZJB-064在制備對(duì)羥基苯乙酰胺中的應(yīng)用，其特征在于所述轉(zhuǎn)化液分離方法為將轉(zhuǎn)化液離心或過(guò)濾除去菌體細(xì)胞，然后置于4℃冰箱中結(jié)晶得到所述對(duì)羥基苯乙酰胺的晶體。
9.如權(quán)利要求5所述的赤紅球菌ZJB-064在制備對(duì)羥基苯乙酰胺中的應(yīng)用，其特征在于所述對(duì)羥基苯乙酰胺制備方法如下(1)產(chǎn)酶培養(yǎng)葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，尿素7.5g/L，谷氨酸鈉0.75g/L，K2HPO40.5g/L，KH2PO40.5g/L，Mg2SO40.5g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 10mg/L，CoCl210mg/L，pH7.0～7.2，余量為去離子水，滅菌，接種赤紅球菌ZJB-064菌種；培養(yǎng)條件為pH6.5～7.5、溫度28～32℃下培養(yǎng)2天，培養(yǎng)液離心收集菌體，用pH7.0，0.1mol/L的磷酸鈉緩沖液洗滌兩次后，離心收集菌體，冷藏備用；(2)水合反應(yīng)將步驟(1)所得菌體與底物對(duì)羥基苯乙腈均勻分散于pH7.0、0.1mol/L的磷酸鈉緩沖液中，配成含濕菌體0.01g/mL、含底物10g/L的反應(yīng)液，45℃水浴、pH6.0～7.0下反應(yīng)2小時(shí)；(3)產(chǎn)物分離將轉(zhuǎn)化液過(guò)濾除去菌體細(xì)胞，濾液置于4℃冰箱中結(jié)晶得到所述對(duì)羥基苯乙酰胺的晶體。
全文摘要
本發(fā)明提供了從土壤中篩選到的微生物新菌株赤紅球菌ZJB－064(Rhodococcus ruber ZJB－064)，及其在制備對(duì)羥基苯乙酰胺中的應(yīng)用。所述赤紅球菌ZJB－064保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NoM 206040，保藏日期2006年4月14日。本發(fā)明篩選得到的菌株赤紅球菌ZJB－064(Rhodococcus ruber ZJB－064)可用于生物法合成對(duì)羥基苯乙酰胺。對(duì)羥基苯乙酰胺的產(chǎn)率達(dá)可到98％以上，具有產(chǎn)率高，環(huán)境友好，過(guò)程綠色等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/31GK101033454SQ20061005059
公開(kāi)日2007年9月12日 申請(qǐng)日期2006年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月29日
發(fā)明者鄭裕國(guó), 蔡謙, 薛亞平, 柳志強(qiáng), 沈寅初 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)