一種中山杉品種118的組織培養(yǎng)繁殖方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種中山杉品種118的組織培養(yǎng)繁殖方法，該方法包括以下步驟：(1)外植體選取及消毒的過程；(2)將1/2MS培養(yǎng)基進行改良；(3)將處理后的外植體切割并進行莖段初代誘導培養(yǎng)，高壓靜電場HVEF處理；(4)將步驟(3)中所得不定芽進行繼代增殖培養(yǎng)；(5)將步驟(4)中所得無根試管苗進行生根誘導培養(yǎng)；(6)對步驟(5)中得到的無菌苗進行馴化煉苗并移栽。采用該發(fā)明的組織培養(yǎng)繁殖方法對中山杉118進行育苗，育苗時間短，且增殖率為89-92倍，生根率為90％，平均生根數(shù)為4.0-4.1條，煉苗成活率達到95％，能夠高效的得到中山杉118種苗，很大程度滿足了市場對中山杉118種苗的需求。
【專利說明】-種中山杉品種118的組織培養(yǎng)繁殖方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種中山杉品種 118 (Taxodium hybrids 'zhongshanshall8'）的組織 培養(yǎng)的繁殖方法，屬于木本植物種苗繁殖的【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 中山杉（Taxodium hybrids 'zhongshansha，）為杉科（Taxodiaceae)落 羽杉屬（Taxodium)。中山杉為半常綠高大喬木，樹體高大雄偉，樹型優(yōu)美，是落羽杉 (T.distichum)、池杉（T.ascendens)、墨西哥落羽杉（T.mucronatum)三個樹種的優(yōu)良種間 雜交種，由江蘇省中國科學院植物研究所多年選育而成。中山杉具有生長速度快，耐水濕， 耐鹽堿，病蟲害少，抗風性強等優(yōu)點，因此是優(yōu)良的灘涂鹽堿地的綠化樹種。
[0003] 由于中山杉的樹干紋理直，結構細致，材質輕柔，耐腐防蛀，因此廣泛用于建筑，橋 梁，造船，家具等方面，所以杉樹在中國的建材市場占據廣闊的市場。
[0004] 通過對中山杉302(早）與墨西哥落羽杉（(5 )回交一代苗期生長的篩選，選出了 具有潛在推廣價值的新無性系：BCFJ18。同時通過外部形態(tài)，同工酶和RAPD這3種方法對 雜交后代進行雜交鑒定，確定他們是中山杉302與墨西哥落羽杉的雜交種。BCFJ18無性系 的株高和地徑的生長量大于母本中山302,同時具有耐鹽堿特性，是優(yōu)良的無性系，作為速 生用材樹種潛力更大。2004年"中山杉118"通過江蘇省林業(yè)局林木新品種審定委員會認 定，目前已分別在江蘇和浙江建立中山杉良種苗木生產基地，得到了林業(yè)園林和公路等綠 化部門的廣泛關注。
[0005] 目前，絕大多數(shù)杉科樹種以種子繁殖和扦插育苗為主，但往往面臨種子缺乏，發(fā)芽 率偏低等困難，而且實生苗變異大，母株優(yōu)良性狀得不到保持；扦插生根情況不穩(wěn)定，早期 造林成活率低。
[0006] 中山杉118是落羽杉屬BCFi代雜交種，如果采用種子播種繁殖，后代植株表型易 產生分離，導致中山杉118的優(yōu)良性狀無法保存；扦插繁殖需要中山杉118提供大量的插 條，因此繁殖材料受到極大的限制；嫁接繁殖需要大量砧木且技術要求高，人工成本高。利 用組織培養(yǎng)方法培養(yǎng)繁育中山杉118幼苗，僅需要少量的帶芽莖段為外植體，其優(yōu)點擴繁 速度快，成本低，能夠在短時間內提供大量優(yōu)質的幼苗。發(fā)明專利CN 102283126 B公開了 中山杉302 (中山杉118的母本）組織培養(yǎng)增殖方法，但是由于中山杉118是落羽杉屬F2代 雜交種與中山杉302的基因型及植株的代謝產物存在不同，因此不能通過簡單地照搬用于 中山杉118。
[0007] 針對以上的現(xiàn)狀，本發(fā)明提供了一種中山杉118的組織培養(yǎng)繁殖方法，其操作簡 單易行，大大提高了增殖率和增殖速度，從而獲得優(yōu)質的中山杉種苗，從而解決了中山杉 118在城市園林綠化，公路綠化，生態(tài)建設等方面的需求。


【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于解決中山杉118種苗的來源，并提供一種繁殖速度快，種苗優(yōu) 質的中山杉118組織培養(yǎng)繁殖方法。
[0009] 為達到上述目的，本發(fā)明提供了一種中山杉118組織培養(yǎng)的繁殖方法，具體步驟 如下所述：
[0010] (1)外植體選取與消毒：選取春季中山杉118帶有腋芽剛萌動的枝條作為外植 體，用自來水沖洗枝條，以去除枝條表面的污垢，然后去除多余的葉片，并進行消毒：①用 中性洗衣粉洗滌，再流水沖洗2h，濾紙吸干表面水分；②在超凈工作臺上先用70%酒精 浸泡20?30s，無菌水沖洗3次，每次振蕩3?5min ;③立即轉入1%。的升汞溶液中消毒 7-10min，最后用無菌水洗漆3?5次，每次振蕩3?5min。
[0011] (2)改良1/2MS培養(yǎng)基的制備：用Ca(N03)2· 4H20 228mg/L代替原1/2MS培養(yǎng)基中 的CaCl2. 2H20,用K2S04730mg/L代替原1/2MS培養(yǎng)基中的ΚΝ0 3，同時加入活性炭，濃度為： 1500mg/L，其他組分均無變化。
[0012] (3)不定芽的誘導：取步驟（1)中消毒后的外植體，切割成0.6-0. 8cm長的莖段， 每個莖段至少帶一腋芽，接種于誘導培養(yǎng)基，進行不定芽的誘導，培養(yǎng)溫度為23±3°C，首先 暗培養(yǎng)24h，然后光照培養(yǎng)20-25天（光照時間為14小時/天，光照強度為1500-20001X)， 濕度為50%?65%。不定芽誘導培養(yǎng)基為改良的1/2MS培養(yǎng)基，添加的激素劑量為：所述 改良 1/2MS+6-BA l.Omg/L+IBA 0.2mg/L+KT 300.8mg/L。
[0013] (4)高壓靜電場HVEF處理，利用高壓靜電場儀器，進行靜電場處理，強度為15KV/ cm，時間25分鐘；
[0014] (5)繼代增殖：將經高壓靜電場處理的不定芽接入繼代增殖培養(yǎng)基，進行繼代培 養(yǎng)25-30天，培養(yǎng)溫度為23±3°C，光照時間為14小時/天，光照強度為1500-20001x，濕 度為50%?65%。繼代增殖培養(yǎng)基為改良的1/2MS培養(yǎng)基，添加的激素劑量為：所述改良 1/2MS+6-BA 4. Omg/L+IBA 0. 5mg/L+ZT 0. 3mg/L+GA30. 5mg/L ；
[0015] (6)生根培養(yǎng)：將步驟（5)獲得的中山杉無根試管苗進行切繁（每株均有一個不 定芽），接入生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)15-20天，培養(yǎng)溫度為23±3°C，光照時間為14小 時/天，光照強度為1500-20001X ;所述的生根培養(yǎng)基為改良1/2MS培養(yǎng)基并添加激素 NAA 和 IBA :改良 1/2MS+NAA 0· 5mg/L+IBA 0· 5mg/L。
[0016] (7)無菌苗的煉苗：將步驟（6)產生的中山杉118帶根無菌苗的培養(yǎng)瓶瓶蓋打開， 室內培養(yǎng)5-7天，然后移入采用多菌靈消毒的基質中，組培苗上方使用帶孔PVC膜覆蓋保 濕，煉苗容器采用50孔的穴盤，放在通風陰涼處培養(yǎng)25-30天，培養(yǎng)到第15天將PVC膜移 除，換用遮光率75%-80%的遮陽網；所述的基質成分為體積比2 : 1 : 1的泥炭土、蛭石、 珍珠巖。
[0017] 根長l-2cm、苗高3-4cm的組培苗經室內煉苗7天后移栽，成活率達95%。
[0018] 上述誘導培養(yǎng)基，繼代增殖培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基中菌含有瓊脂7. 0-8. Og/L，蔗糖 30g/L，PH 值為：5· 8-6. 0。
[0019] 本發(fā)明中山杉118組織培養(yǎng)的繁殖方法具有以下優(yōu)點：
[0020] 1.選取外植體時間
[0021] 木本植物外植體本身的生理狀況、休眠深度與植株再生能力是密切相關的。根據 我們的試驗，選取春季中山杉118帶有剛萌動的腋芽枝條作為外植體利于腋芽的萌動，t匕 其他時間容易得到成活率較高的外植體。
[0022] 2、MS 改良
[0023] 在原MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，外植體不定芽不易分化出枝梢，外植體上只爆芽而 不伸長，將MS培養(yǎng)基改良后，改變了 NPK比例，用Ca(N03)2.4H20代替原MS培養(yǎng)基中的 CaCl2. 2H20,用K2S04730mg/L代替原1/2MS培養(yǎng)基中的ΚΝ0 3，另外添加活性炭1500mg/L能 夠顯著促進不定芽的分化及生長（見表1)，其中改良WPM為按照CN201110200456,中山杉 302培養(yǎng)的方法進行改良（用Ca(N0 3)2· 4H20684mg/L和KN03380mg/L代替原WPM培養(yǎng)基中 的 K2S04 和 CaCl2. 2H20)
[0024] 表1基本培養(yǎng)基的篩選
[0025]

【權利要求】
1. 一種中山杉品種118組織培養(yǎng)的繁殖方法，其特征在于所述繁殖方法包括如下步 驟： (1) 外植體選取與消毒：選取春季中山杉118帶有腋芽的枝條作為外植體，進行消毒處 理； (2) 改良1/2MS培養(yǎng)基的制備：用Ca (N03) 2. 4H20 228mg/L代替原1/2MS培養(yǎng)基中 的CaCl2. 2H20,用K2S04730mg/L代替原1/2MS培養(yǎng)基中的ΚΝ0 3，同時加入活性炭，濃度為： 1500mg/L，其他組分均無變化； (3) 不定芽的誘導：取步驟（1)中消毒后的外植體，切割成0.6-0. 8cm長的莖段，每個 莖段至少帶一腋芽，接種于誘導培養(yǎng)基，進行不定芽的誘導，培養(yǎng)溫度為23±3°C，首先暗培 養(yǎng)24h，然后光照培養(yǎng)20-25天（光照時間為14小時/天，光照強度為1500-20001X)，濕度 為50%?65% ;其中，不定芽誘導培養(yǎng)基為：所述改良1/21^+6-84 1.〇11^/1+184 0.211^/ L+KT 300. 8mg/L ； (4) 高壓靜電場HVEF處理：利用高壓靜電場儀器，進行靜電場處理，強度為15KV/cm，時 間25分鐘； (5) 繼代增殖：將經高壓靜電場處理的不定芽接入繼代增殖培養(yǎng)基，進行繼代培養(yǎng) 25-30天，培養(yǎng)溫度為23±3°C，光照時間為14小時/天，光照強度為1500-20001x，濕度 為50%?65% ;所述繼代增殖培養(yǎng)基為：所述改良1/21^+6-84 4.011^/1+184 0.511^/1+2丁 0. 3mg/L+GA30. 5mg/L ； (6) 生根培養(yǎng)：接入生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)15-20天，培養(yǎng)溫度為23±3°C，光照 時間為14小時/天，光照強度為1500-20001x ;其中，生根培養(yǎng)基為：所述改良1/2MS+NAA 0. 5mg/L+IBA 0. 5mg/L〇 (7) 無菌苗的煉苗：將步驟（6)產生的中山杉118帶根無菌苗的培養(yǎng)瓶瓶蓋打開，室內 培養(yǎng)5-7天，然后移入采用多菌靈消毒的基質中；所述基質由體積比為2 : 1 : 1的泥炭 土、蛭石以及珍珠巖組成。
2. 根據權利要求1所述中山杉品種118組織培養(yǎng)的繁殖方法，其特征在于：所述步驟 (1)中外植體的消毒過程：①用中性洗衣粉洗滌，再流水沖洗2h，濾紙吸干表面水分；②在 超凈工作臺上先用70%酒精浸泡20?30s，無菌水沖洗3次，每次振蕩3?5min ;③立即 轉入1%。的升萊溶液中消毒7-10min，最后用無菌水洗漆3?5次，每次振蕩3?5min。
3. 根據權利要求1所述中山杉品種118組織培養(yǎng)的繁殖方法，其特征在于：所述誘導 培養(yǎng)基、繼代增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基中均含有瓊脂7g/L、蔗糖30g/L，且pH值為5. 8。
【文檔編號】A01H4/00GK104115752SQ201410384098
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年8月6日 優(yōu)先權日:2014年8月6日
【發(fā)明者】陳紅, 陸小清, 李乃偉, 李云龍, 王傳永, 蔡小龍 申請人:江蘇省中國科學院植物研究所