抗草銨膦紫花苜蓿植株的培養(yǎng)基和土壤篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明主要涉及抗草銨膦紫花苜蓿植株的篩選方法。具體涉及抗草銨膦種質(zhì)篩選方法。一種抗草銨膦紫花苜蓿植株的培養(yǎng)基篩選方法，其主要特點在于包括如下步驟：(1)MS培養(yǎng)基萌發(fā)種子；(2)劑量篩選；(3)甲基磺酸乙酯半致死劑量誘變紫花苜蓿種子；(4)抗草銨膦紫花苜蓿植株篩選；(5)抗性植株再次篩選。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果：本發(fā)明簡便易行，見效快捷，在短期內(nèi)可以獲得抗除草劑紫花苜蓿的單株。本發(fā)明采用的是誘變手段。利用化學誘變劑EMS誘變紫花苜蓿種子產(chǎn)生點突變，通過培養(yǎng)基和土壤篩選兩種途徑篩選抗除草劑紫花苜蓿單株，不但為常規(guī)育種提供了新的種質(zhì)資源，對其他植物的抗除草劑選育也提供了一定的參考。
【專利說明】抗草銨滕紫花苜蓿植株的培養(yǎng)基和土壤篩選方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明主要涉及抗草銨膦紫花苜蓿植株的篩選方法。具體涉及抗草銨膦種質(zhì)篩選 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 紫花苜猜（Medicago sativa L.)具有優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、飼用價值高（粗蛋白含量 21%)、適口性好、用途廣泛等特點，被世界譽為"牧草之王"，有著很好的固氮、保肥、保持 水土的作用，具有食用價值，產(chǎn)業(yè)化發(fā)展前景良好。而苜蓿地雜草種類繁多，雙子葉雜草和 單子葉雜草兼具，其中以雙子葉雜草的危害最為嚴重。雜草與苜蓿爭奪陽光、水分、養(yǎng)分和 空間，還會將病蟲害傳播給苜蓿，對苜蓿品質(zhì)和產(chǎn)量造成了嚴重的不良影響，聯(lián)合國糧農(nóng)組 織近年來的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，全世界每年由草害造成的作物減產(chǎn)率平均達9. 7%，減產(chǎn)值高達 204億美元（張殿京和陳仁霖，1992)。人工除草成本又高，這為除草劑的研發(fā)開拓了市場， 草銨膦為滅生性除草劑，但滅生性除草劑在殺死雜草的同時也傷害了苜蓿，選育并發(fā)展抗 除草劑作物勢在必行，這遠比研制新型除草劑更加經(jīng)濟實惠，可節(jié)省20到100倍的成本，所 以獲得抗草銨膦苜蓿品種顯得尤為重要。
[0003] 對除草劑抗性的研究，早期是直接從自然界中篩選抗除草劑作物，接著是采用傳 統(tǒng)雜交育種手段將具有抗性的基因轉(zhuǎn)入目標作物中，隨后是細胞培養(yǎng)、突變等方法，當前獲 取抗除草劑作物的技術(shù)主要分為轉(zhuǎn)基因、非轉(zhuǎn)基因兩大類。在外源基因的不可預知性漸漸 變?yōu)檗D(zhuǎn)基因作物發(fā)展的阻礙時，非轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物的發(fā)展愈來愈受重視，誘變育種為 其中一種手段。目前，通過非轉(zhuǎn)基因手段培育的抗除草劑作物有玉米、大豆、菜豆和煙草等 20余種，抗除草劑種類包括ALS類（如咪唑啉酮類、磺酰脲類）、ACCase類（如環(huán)己烯二酮 類）、草甘膦類、草銨膦類和合成生長素類等。然而目前鮮有抗除草劑牧草的相關(guān)報道。因 此，篩選抗草銨膦除草劑的紫花苜蓿對于我國牧草產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有十分重要意義。然而，在本 發(fā)明申請之前，國內(nèi)還沒有公開或發(fā)表過抗草銨膦紫花苜蓿植株的篩選方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是避免現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種抗草銨膦紫花苜蓿植株的培養(yǎng)基 篩選方法。
[0005] 本發(fā)明的又一目的提出一種抗草銨膦紫花苜蓿植株的土壤篩選方法。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種抗草銨膦紫花苜蓿植株的培養(yǎng) 基篩選方法，其主要特點在于包括如下步驟：
[0007] (1)MS培養(yǎng)基萌發(fā)種子
[0008] 精選紫花苜蓿種子；配制MS培養(yǎng)基培養(yǎng)板備用；無菌條件下進行種子消毒： 60-100%酒精浸洗種子2-0.511^11 ;2%次氯酸鈉溶液浸洗5-151^11;(1(1!120清洗種子3-10 次；鋪板，用鑷子將消過毒的種子均勻鋪于MS培養(yǎng)基上，封口膜封口后置于人工培養(yǎng)箱， 22-18°C，0_18h光照，24-6h黑暗發(fā)芽；胚根突破種皮視為萌發(fā)，第3-6天，平均發(fā)芽率達到 50%以上，待用；
[0009] (2)劑量篩選
[0010] 草銨膦設(shè)置多個處理，濃度分別為〇mg/L至15mg/L，配置以上不同濃度的草銨膦 培養(yǎng)基，每個濃度3個重復，設(shè)與濃度相匹配的多個培養(yǎng)板；
[0011] 無菌條件下，將MS培養(yǎng)基中發(fā)芽的健康種子轉(zhuǎn)入不同濃度草銨膦培養(yǎng)基，封口膜 封口后置于22-18°C人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18天，18天后統(tǒng)計致死率，篩選出用 于培養(yǎng)基篩選的草銨膦致死劑量為8mg/L ;
[0012] (3)甲基磺酸乙酯半致死劑量誘變紫花苜蓿種子
[0013] 紫花苜蓿種子用98 %濃硫酸處理3-10min先打破硬實，蒸餾水沖洗3-10次；種子 在磷酸緩沖液（l〇〇mM，PH7. 0)，于4°C下預浸種6-18h，用磷酸緩沖液配置濃度為0. 2-2. 0 % (v/v)的甲基磺酸乙酯（EMS)溶液，在室溫黑暗條件下用EMS處理種子，處理時長12-24h， 置于低溫搖床，120rpm/min，18-22°C不斷搖晃，再用自來水沖洗2-5h以去除殘留的EMS，每 25-35min放置10-20min ;之后鋪于干凈的濾紙上將種子晾干待用；挑選誘變后飽滿完好的 紫花苜蓿種子，分裝于離心管中；配制MS基本培養(yǎng)基培養(yǎng)板備用；在MS培養(yǎng)基萌發(fā)誘變后 的種子，封口膜封口后置于人工培養(yǎng)箱，22-18°C，0_18h光照，24-6h黑暗發(fā)芽；
[0014] (4)抗草銨膦紫花苜蓿植株篩選
[0015] 配置添加了致死劑量（8mg/L)草銨膦的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)板備用；無菌條件下，將步 驟（3)中MS培養(yǎng)基萌發(fā)第3-6天的健康種子轉(zhuǎn)入添加了致死劑量的草銨膦培養(yǎng)基中，封口 膜封口后置于18_22°C人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-20d，每天觀察統(tǒng)計，10-20d后 篩選出抗性植株；
[0016] 配置1/2MS培養(yǎng)基，將篩選出的存活植株轉(zhuǎn)入1/2MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每2-3天 更換一次1/2MS培養(yǎng)基，待存活株長出復葉移栽到花盆繼續(xù)生長；
[0017] (5)抗性植株再次篩選
[0018] 將1/2MS培養(yǎng)基中長出一片復葉的幼苗移栽至土壤繼續(xù)培養(yǎng)，待幼苗長至2-3葉 期開始用80mg/L的草銨膦溶液進行噴施，每隔4-8d噴一次，噴施2次。
[0019] 一種抗草銨膦紫花苜蓿植株的土壤篩選方法，其主要特點在于包括如下步驟：
[0020] (1) 土壤萌發(fā)種子
[0021] 將挑選出的健康飽滿的紫花苜蓿種子播種于花盆，盆栽土壤為草炭土與蛭石1:1 比例混合，pH為8. 7,植物生長室培養(yǎng)，25-15°C，14-18h光照，10-6h黑暗；每盆均勻撒播種 子，覆土厚度約〇. 5-2cm，澆水200-500mL后用保鮮膜覆蓋，保鮮膜覆蓋生長2-5天，出苗后 揭掉保鮮膜；
[0022] (2)劑量篩選
[0023] 草銨膦設(shè)置多個處理，濃度分別為Omg/L至120mg/L，配置以上不同濃度的草銨膦 溶液裝于噴壺；每個濃度多個重復；
[0024] 待幼苗長至第一復葉期，在生長至第14-16天時，開始噴施除草劑；每隔4-8天噴 施1次，連續(xù)12-24d，噴施3次；噴施除草劑時一來一回掃過葉面算作一次，保證除草劑均 勻撒施到葉面上，第3次噴施后的第7天統(tǒng)計致死率，篩選出用于土壤篩選的草銨膦致死劑 量為 80mg/L ;
[0025] (3)甲基磺酸乙酯半致死劑量誘變紫花苜蓿種子
[0026] 紫花苜蓿種子用98 %濃硫酸處理3-10min先打破硬實，蒸餾水沖洗3-10次； 種子在磷酸緩沖液中，l〇〇mM，PH7. 0,于4°C下預浸種6-18h，用磷酸緩沖液配置濃度為 0. 2-2.0% (v/v)的甲基磺酸乙酯（EMS)溶液，在室溫黑暗條件下用EMS處理種子，處理時 長12-24h，置于低溫搖床，120rpm/min，18-22°C不斷搖晃，再用自來水沖洗2-5h以去除殘 留的EMS，每25-35min放置10-20min ;之后鋪于干凈的濾紙上將種子晾干待用；挑選誘變 后飽滿完好的種子，分裝于離心管中；將誘變后的紫花苜蓿種子均勻播種于土壤表面，覆土 厚度約0. 5-2cm，澆水200-500mL后用保鮮膜覆蓋，保鮮膜覆蓋生長2-5天，出苗后揭掉保鮮 膜；
[0027] (4)抗草銨膦紫花苜蓿植株篩選
[0028] 待幼苗長至第一復葉期，剔除生長不一致的植株，用篩選出的草銨膦的致死劑量 開始噴施，每隔4-8天噴施1次，連續(xù)12-24d，噴施3次；噴施草銨膦時一來一回掃過葉面 算作一次，保證草銨膦均勻撒施到葉面上；3次噴施結(jié)束后的一周左右選取存活植株?；?待用；
[0029] (5)抗性植株再次篩選
[0030] 篩選出的可能具有草銨膦抗性的植株通過再次噴施草銨膦進行鑒定。盆中存活單 株繼續(xù)在土壤中生長，待苜蓿長至2-3葉期開始用80mg/L的草銨膦溶液進行噴施，噴施草 銨膦時一來一回掃過葉面算作一次；每隔4-8天噴一次，噴施2次。
[0031] 本發(fā)明一是將EMS誘變后的紫花苜蓿種子在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)，然后在附加最佳篩 選劑量的草銨膦培養(yǎng)基上進行篩選，對篩選存活的幼苗進行恢復培養(yǎng)，之后轉(zhuǎn)入1/2MS培 養(yǎng)基上分化成苗，小苗生根長大后移栽，檢測其抗草銨膦的效能；二是將EMS誘變后的種子 在土壤中萌發(fā)，然后用最佳篩選劑量的草銨膦對幼苗進行噴施，保留存活幼苗恢復培養(yǎng)。
[0032] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果：本發(fā)明簡便易行，見效快捷，在短 期內(nèi)可以獲得抗除草劑紫花苜蓿的單株。本發(fā)明采用的是誘變手段。利用化學誘變劑EMS 誘變紫花苜蓿種子產(chǎn)生點突變，通過培養(yǎng)基和土壤篩選兩種途徑篩選抗除草劑紫花苜蓿單 株，不但為常規(guī)育種提供了新的種質(zhì)資源，對其他植物的抗除草劑選育也提供了一定的參 考。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033] 圖1.不同濃度草銨膦下紫花苜蓿單株生長情況（10d);
[0034] 圖中：從左至右為紫花苜蓿種子在0、l、2、3、5、8、10、12、15mg/L草銨膦培養(yǎng)基中 培養(yǎng)l〇d的單株生長狀況；
[0035] 圖2.不同濃度草銨膦下紫花苜蓿在MS培養(yǎng)基的生長情況（10d);
[0036] 圖中：從左至右為紫花苜蓿種子在0、l、2、3、5、8、10、12、15mg/L草銨膦培養(yǎng)基中 培養(yǎng)l〇d的生長狀況；
[0037] 圖3.草銨膦培養(yǎng)基中不同天數(shù)紫花苜蓿的生長情況；
[0038] 圖中：從左至右為紫花苜蓿幼苗在8mg/L草銨膦培養(yǎng)基中生長0、6、8、10、12、15、 18d的狀況；
[0039] 圖4.培養(yǎng)基中篩選出的抗性植株與非抗性植株對比；
[0040] 圖中：左1為培養(yǎng)基中非抗性單株生長狀況，2-6株為培養(yǎng)基中篩選出來的抗性植 株生長狀況；
[0041] 圖5.不同濃度草銨膦下紫花苜蓿在土壤中的生長情況（出苗20d);
[0042] 圖中：左為對照，右兩列為紫花苜蓿品種在噴施10、30、50、80、100、120mg/L草銨 膦后的生長狀況；
[0043] 圖6. 80mg/L草銨膦篩選后存活的抗性植株；
[0044] 圖中：最佳篩選劑量80mg/L草銨膦噴施篩選后盆中植株生長狀況；
[0045] 圖7. 土壤中篩選出的抗性植株與非抗性植株對比；
[0046] 圖中：左為盆中非抗性單株生長狀況，右為盆中篩選出來的抗性植株生長狀況；
[0047] 圖8.篩選獲得的抗性植株生長情況；
[0048] 圖中：培養(yǎng)基和土壤兩種篩選途徑獲得的抗性植株生長狀況。

【具體實施方式】
[0049] 以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明， 并非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0050] 下述實施例與實驗例中的MS培養(yǎng)基：硝酸鉀（1900mg/L)，硝酸銨（1650mg/L)，七 水合硫酸鎂（370mg/L)，二水合氯化興（440mg/L)，磷酸二氫鉀（170mg/L)，四水合硫酸猛 (22. 3mg/L)，七水合硫酸鋅（8. 6mg/L)，硼酸（6. 2mg/L)，碘化鉀（0· 83mg/L)，二水合鑰酸鈉 (0.25mg/L)，五水合硫酸銅（0.025mg/L)，六水合氯化鈷（0.025mg/L)，肌醇（100mg/L)，甘 氨酸（2. Omg/L)，鹽酸卩比卩多醇（0. 5mg/L)，鹽酸硫胺素（0. lmg/L)，煙酸（0. 5mg/L)，乙二胺四 乙酸二鈉（37. 3mg/L)，七水合硫酸亞鐵（27. 8mg/L)，瓊脂（7g/L)，蔗糖（30g/L)。
[0051] 1/2MS培養(yǎng)基：硝酸鉀（950mg/L)，硝酸銨（825mg/L)，磷酸二氫鉀（85mg/L)，七水 合硫酸鎂（185mg/L)，二水合氯化鈣（220mg/L)，四水合硫酸錳（22. 3mg/L)，七水合硫酸鋅 (8. 6mg/L)，硼酸（6. 2mg/L)，碘化鉀（0. 83mg/L)，二水合鑰酸鈉（0. 25mg/L)，五水合硫酸銅 (0. 025mg/L)，六水合氯化鈷（0. 025mg/L)，肌醇（100mg/L)，甘氨酸（2. Omg/L)，鹽酸批卩多醇 (0· 5mg/L)，鹽酸硫胺素（0· lmg/L)，煙酸（0· 5mg/L)，乙二胺四乙酸二鈉（37. 3mg/L)，七水 合硫酸亞鐵（27.8mg/L)，瓊脂（7g/L)，蔗糖（30g/L)。
[0052] 實施例1 :一種抗草銨膦紫花苜蓿植株的培養(yǎng)基篩選方法，其特征在于包括如下 步驟：
[0053] (1)MS培養(yǎng)基萌發(fā)種子
[0054] 精選紫花苜蓿種子；配制MS培養(yǎng)板備用；無菌條件下進行種子消毒：100%酒精浸 洗種子0. 5min ;2%次氯酸鈉溶液浸洗15min ;ddH20清洗種子10次；鋪板，用鑷子將消過毒 的種子均勻鋪于MS培養(yǎng)基上，封口膜封口后置于人工培養(yǎng)箱，22°C，18h光照，6h黑暗發(fā)芽； 胚根突破種皮視為萌發(fā)，第6天，平均發(fā)芽率達到50%以上，待用；
[0055] (2)劑量篩選
[0056] 草銨膦設(shè)置 9 個處理，濃度分別為 0mg/L、lmg/L、2mg/L、3mg/L、5mg/L、8mg/L、 10mg/L、12mg/L、15mg/L，配置以上不同濃度的草銨膦培養(yǎng)基，每個濃度3個重復，共27個培 養(yǎng)板；
[0057] 無菌條件下，將MS培養(yǎng)基中發(fā)芽的健康種子轉(zhuǎn)入不同濃度草銨膦培養(yǎng)基，封口膜 封口后置于22°C人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18天，18天后統(tǒng)計致死率，篩選出用于 培養(yǎng)基篩選的草銨膦致死劑量為8mg/L ;
[0058] (3)甲基磺酸乙酯半致死劑量誘變紫花苜蓿種子
[0059] 紫花苜猜種子用濃硫酸（98% )處理lOmin先打破硬實，蒸饋水沖洗10次；種子 在磷酸緩沖液中（100mM，pH7.0)，于4°C下預浸種18h，用磷酸緩沖液配置濃度為2.0% (v/ v)的EMS (甲基磺酸乙酯）溶液，在室溫黑暗條件下用EMS處理種子，處理時長24h，置于低 溫搖床，120rpm/min，22°C不斷搖晃，再用自來水沖洗5h以去除殘留的EMS，每35min放置 20min ;之后鋪于干凈的濾紙上將種子晾干待用；挑選誘變后飽滿完好的種子，分裝于離心 管中；配制MS基本培養(yǎng)基培養(yǎng)板備用；在MS培養(yǎng)基萌發(fā)誘變后的種子，封口膜封口后置于 人工培養(yǎng)箱，22°C，18h光照，6h黑暗發(fā)芽；
[0060] (4)抗草銨膦紫花苜蓿植株篩選
[0061] 配置添加了致死劑量8mg/L草銨膦的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)板，備用；無菌條件下，將步驟 (3)中MS培養(yǎng)基中發(fā)芽第6天的健康種子轉(zhuǎn)入添加了致死劑量的草銨膦培養(yǎng)基中，封口膜 封口后置于22°C人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20d，每天觀察統(tǒng)計，20d后篩選出抗性 植株；
[0062] 配置1/2MS培養(yǎng)基，將篩選出的存活植株轉(zhuǎn)入1/2MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每3天更 換一次1/2MS培養(yǎng)基，待存活株長出復葉移栽到花盆繼續(xù)生長；
[0063] (5)抗性植株再次篩選
[0064] 將1/2MS培養(yǎng)基中長出一片復葉的幼苗移栽至土壤繼續(xù)培養(yǎng)，待幼苗長至2-3葉 期開始用80mg/L的草銨膦溶液進行噴施，每隔8d噴一次，噴施2次。
[0065] 實施例2 :-種抗草銨膦紫花苜蓿植株的培養(yǎng)基篩選方法，其特征在于包括如下 步驟：
[0066] (1)MS培養(yǎng)基萌發(fā)種子
[0067] 精選紫花苜蓿種子；配制MS培養(yǎng)基培養(yǎng)板備用；無菌條件下進行種子消毒：75% 酒精浸洗種子lmin ;2%次氯酸鈉溶液浸洗lOmin ;ddH20清洗種子5次；鋪板，用鑷子將消 過毒的種子均勻鋪于MS培養(yǎng)基上，封口膜封口后置于人工培養(yǎng)箱，20°C，16h光照，8h黑暗 發(fā)芽；胚根突破種皮視為萌發(fā)，第5天，平均發(fā)芽率達到50%以上，待用；
[0068] (2)劑量篩選
[0069] 草銨膦設(shè)置 9 個處理，濃度分別為 0mg/L、lmg/L、2mg/L、3mg/L、5mg/L、8mg/L、 10mg/L、12mg/L、15mg/L，配置以上不同濃度的草銨膦培養(yǎng)基，每個濃度3個重復，共27個培 養(yǎng)板；
[0070] 無菌條件下，將MS培養(yǎng)基中發(fā)芽的健康種子轉(zhuǎn)入不同濃度草銨膦培養(yǎng)基，封口膜 封口后置于20°C人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18天，18天后統(tǒng)計致死率，篩選出用于 培養(yǎng)基篩選的草銨膦致死劑量為8mg/L ;
[0071] (3)甲基磺酸乙酯半致死劑量誘變紫花苜蓿種子
[0072] 紫花苜蓿種子用濃硫酸（98% )處理5min先打破硬實，蒸餾水沖洗5次；種子在 磷酸緩沖液中（100mM，pH7.0)，于4°C下預浸種12h，用磷酸緩沖液配置濃度為0.8% (v/v) 的EMS (甲基磺酸乙酯）溶液，在室溫黑暗條件下用EMS處理種子，處理時長18h，置于低溫 搖床，120rpm/min，2(TC不斷搖晃，再用自來水沖洗4h以去除殘留的EMS，每30min放置片 亥IJ ;之后鋪于干凈的濾紙上將種子晾干待用；挑選誘變后飽滿完好的種子，分裝于離心管 中；配制MS基本培養(yǎng)基培養(yǎng)板備用；在MS培養(yǎng)基萌發(fā)誘變后的種子，封口膜封口后置于人 工培養(yǎng)箱，20°C，16h光照，8h黑暗發(fā)芽；
[0073] (4)抗草銨膦紫花苜蓿植株篩選
[0074] 配置添加了致死劑量8mg/L草銨膦的MS基本培養(yǎng)基培養(yǎng)板，備用；無菌條件下，將 步驟（3)中MS培養(yǎng)基萌發(fā)第5天的健康種子轉(zhuǎn)入添加了致死劑量的草銨膦培養(yǎng)基中，封口 膜封口后置于20°C人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18d，每天觀察統(tǒng)計，18d后篩選出抗 性植株；
[0075] 配置1/2MS培養(yǎng)基，將篩選出的存活植株轉(zhuǎn)入1/2MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每2天更 換一次1/2MS培養(yǎng)基，待存活株長出復葉移栽到花盆繼續(xù)生長；
[0076] (5)抗性植株再次篩選
[0077] 將1/2MS培養(yǎng)基中長出一片復葉的幼苗移栽至土壤繼續(xù)培養(yǎng)，待幼苗長至2-3葉 期開始用80mg/L的草銨膦溶液進行噴施，每隔6d噴一次，噴施2次。
[0078] 實施例3 :-種抗草銨膦紫花苜蓿植株的培養(yǎng)基篩選方法，其特征在于包括如下 步驟：
[0079] (1)MS培養(yǎng)基萌發(fā)種子
[0080] 精選紫花苜蓿種子；配制MS培養(yǎng)基培養(yǎng)板備用；無菌條件下進行種子消毒：60% 酒精浸洗種子2min ;2%次氯酸鈉溶液浸洗5min ;ddH20清洗種子3次；鋪板，用鑷子將消過 毒的種子均勻鋪于MS培養(yǎng)基上，封口膜封口后置于人工培養(yǎng)箱，18°C，0h光照，24h黑暗發(fā) 芽；胚根突破種皮視為萌發(fā)，第3天，平均發(fā)芽率達到50%以上，待用；
[0081] (2)劑量篩選
[0082] 草銨膦設(shè)置 9 個處理，濃度分別為 0mg/L、lmg/L、2mg/L、3mg/L、5mg/L、8mg/L、 10mg/L、12mg/L、15mg/L，配置以上不同濃度的草銨膦培養(yǎng)基，每個濃度3個重復，共27個培 養(yǎng)板；
[0083] 無菌條件下，將MS培養(yǎng)基中發(fā)芽的健康種子轉(zhuǎn)入不同濃度草銨膦培養(yǎng)基，封口膜 封口后置于18°C人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18天，18天后統(tǒng)計致死率，篩選出用于 培養(yǎng)基篩選的草銨膦致死劑量為8mg/L ;
[0084] (3)甲基磺酸乙酯半致死劑量誘變紫花苜蓿種子
[0085] 紫花苜蓿種子用濃硫酸（98% )處理3min先打破硬實，蒸餾水沖洗3次；種子在 磷酸緩沖液中（l〇〇mM，PH7.0)，于4°C下預浸種6h，用磷酸緩沖液配置濃度為0. 2% (v/v) 的EMS (甲基磺酸乙酯）溶液，在室溫黑暗條件下用EMS處理種子，處理時長12h，置于低 溫搖床，120rpm/min，18°C不斷搖晃，再用自來水沖洗2h以去除殘留的EMS，每25min放置 lOmin ;之后鋪于干凈的濾紙上將種子晾干待用；挑選誘變后飽滿完好的種子，分裝于離心 管中；配制MS基本培養(yǎng)基培養(yǎng)板備用；在MS培養(yǎng)基萌發(fā)誘變后的種子，封口膜封口后置于 人工培養(yǎng)箱，18°C，0h光照，24h黑暗發(fā)芽；
[0086] (4)抗草銨膦紫花苜蓿植株篩選
[0087] 配置添加了致死劑量8mg/L草銨膦的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)板，備用；無菌條件下，將步驟 (3)中MS培養(yǎng)基中發(fā)芽第3天的健康種子轉(zhuǎn)入添加了致死劑量的草銨膦培養(yǎng)基中，封口膜 封口后置于18°C人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18d，每天觀察統(tǒng)計，10d后篩選出抗性 植株；
[0088] 配置1/2MS培養(yǎng)基，將篩選出的存活植株轉(zhuǎn)入1/2MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每2天更 換一次1/2MS培養(yǎng)基，待存活株長出復葉移栽到花盆繼續(xù)生長；
[0089] (5)抗性植株再次篩選
[0090] 將1/2MS培養(yǎng)基中長出一片復葉的幼苗移栽至土壤繼續(xù)培養(yǎng)，待幼苗長至2-3葉 期開始用80mg/L的草銨膦溶液進行噴施，每隔4d噴一次，噴施2-次。
[0091] 實施例4 :一種抗草銨膦紫花苜蓿植株的土壤篩選方法，其特征在于包括如下步 驟：
[0092] (1) 土壤萌發(fā)種子
[0093] 將挑選出的健康飽滿的紫花苜蓿種子播種于花盆，盆栽土壤為草炭土與蛭石1:1 比例混合，pH為8. 7,植物生長室適宜條件培養(yǎng)，25°C，18h光照，6h黑暗。每盆均勻撒播種 子，覆土厚度約2cm，澆水500mL后用保鮮膜覆蓋，保鮮膜覆蓋生長5天，出苗后揭掉保鮮 膜；
[0094] (2)劑量篩選
[0095] 草銨膦設(shè)置 7 個處理，濃度分別為 Omg/L、10mg/L、30mg/L、50mg/L、80mg/L、100mg/ L、120mg/L，配置以上不同濃度的草銨膦溶液裝于噴壺；每個濃度3個重復；
[0096] 待幼苗長至第一復葉期，在生長至第16天時，開始噴施除草劑；每隔8天噴施1 次，連續(xù)24d，噴施3次；噴施除草劑時一來一回掃過葉面算作一次，保證除草劑均勻撒施 到葉面上，第3次噴施后的第7天統(tǒng)計致死率，篩選出用于土壤篩選的草銨膦致死劑量為 80mg/L ；
[0097] (3)甲基磺酸乙酯半致死劑量誘變紫花苜蓿種子
[0098] 紫花苜蓿種子用濃硫酸（98% )處理lOmin先打破硬實，蒸餾水沖洗10次；種子 在磷酸緩沖液中（100mM，pH7.0)，于4°C下預浸種18h，用磷酸緩沖液配置濃度為2.0% (v/ v)的EMS (甲基磺酸乙酯）溶液，在室溫黑暗條件下用EMS處理種子，處理時長24h，置于低 溫搖床，120rpm/min，22°C不斷搖晃，再用自來水沖洗5h以去除殘留的EMS，每35min放置 20min ;之后鋪于干凈的濾紙上將種子晾干待用；挑選誘變后飽滿完好的種子，分裝于離心 管中；將誘變后的紫花苜蓿種子均勻播種于土壤表面，覆土厚度約2cm，澆水500mL后用保 鮮膜覆蓋，保鮮膜覆蓋生長5天，出苗后揭掉保鮮膜；
[0099] (4)抗草銨膦紫花苜蓿植株篩選
[0100] 待幼苗長至第一復葉期，剔除生長不一致的植株，用篩選出的草銨膦的致死劑量 開始噴施，每隔8天噴施1次，連續(xù)24d，噴施3次；噴施草銨膦時一來一回掃過葉面算作一 次，保證草銨膦均勻撒施到葉面上；3次噴施結(jié)束后的一周左右選取存活植株保活待用；
[0101] (5)抗性植株再次篩選
[0102] 篩選出的可能具有草銨膦抗性的植株通過再次噴施草銨膦進行鑒定。盆中存活單 株繼續(xù)在土壤中生長，待苜蓿長至2-3葉期開始用80mg/L的草銨膦溶液進行噴施，噴施草 銨膦時一來一回掃過葉面算作一次；每隔8天噴一次，噴施2次。
[0103] 實施例5 :-種抗草銨膦紫花苜蓿植株的土壤篩選方法，其特征在于包括如下步 驟：
[0104] (1) 土壤萌發(fā)種子
[0105] 將挑選出的健康飽滿的紫花苜蓿種子播種于花盆，盆栽土壤為草炭土與蛭石1:1 比例混合，pH為8. 7,植物生長室適宜條件培養(yǎng)（20°C，16h光照，8h黑暗）。每盆均勻撒播 種子，覆土厚度約lcm，澆適量水（200-500mL)后用保鮮膜覆蓋，保鮮膜覆蓋生長3天，出苗 后揭掉保鮮月吳；
[0106] (2)劑量篩選
[0107] 草銨膦設(shè)置 7 個處理，濃度分別為 Omg/L、10mg/L、30mg/L、50mg/L、80mg/L、100mg/ L、120mg/L，配置以上不同濃度的草銨膦溶液裝于噴壺；每個濃度3個重復；
[0108] 待幼苗長至第一復葉期，在生長至第15天時，開始噴施除草劑；每隔6天噴施1 次，連續(xù)18d，噴施3次；噴施除草劑時一來一回掃過葉面算作一次，保證除草劑均勻撒施 到葉面上，第3次噴施后的第7天統(tǒng)計致死率，篩選出用于土壤篩選的草銨膦致死劑量為 80mg/L ；
[0109] (3)甲基磺酸乙酯半致死劑量誘變紫花苜蓿種子
[0110] 紫花苜蓿種子用濃硫酸（98% )處理5min先打破硬實，蒸餾水沖洗5次；種子在磷 酸緩沖液中（100mM，pH7.0)，于4°C下預浸種12h，用磷酸緩沖液配置濃度為0.8% (v/v)的 EMS (甲基磺酸乙酯）溶液，在室溫黑暗條件下用EMS處理種子，處理時長18h，置于低溫搖 床，120rpm/min，20°C不斷搖晃，再用自來水沖洗4h以去除殘留的EMS，每30min放置片刻； 之后鋪于干凈的濾紙上將種子晾干待用；挑選誘變后飽滿完好的種子，分裝于離心管中； 將誘變后的紫花苜蓿種子均勻播種于土壤表面，覆土厚度約lcm，澆適量水（200-500mL)后 用保鮮膜覆蓋，保鮮膜覆蓋生長3天，出苗后揭掉保鮮膜；
[0111] (4)抗草銨膦紫花苜蓿植株篩選
[0112] 待幼苗長至第一復葉期，剔除生長不一致的植株，用篩選出的草銨膦致死劑量開 始噴施，每隔6天噴施1次，連續(xù)18d，噴施3次；噴施草銨膦時一來一回掃過葉面算作一次， 保證草銨膦均勻撒施到葉面上；3次噴施結(jié)束后的一周左右選取存活植株?；畲茫?br> [0113] (5)抗性植株再次篩選
[0114] 篩選出的可能具有草銨膦抗性的植株通過再次噴施草銨膦進行鑒定。盆中存活單 株繼續(xù)在土壤中生長，待苜蓿長至2-3葉期開始用80mg/L的草銨膦溶液進行噴施，噴施草 銨膦時一來一回掃過葉面算作一次；每隔6天噴一次，噴施2次。
[0115] 實施例6 :-種抗草銨膦紫花苜蓿植株的土壤篩選方法，其特征在于包括如下步 驟：
[0116] (1) 土壤萌發(fā)種子
[0117] 將挑選出的健康飽滿的紫花苜蓿種子播種于花盆，盆栽土壤為草炭土與蛭石1:1 比例混合，pH為8. 7,植物生長室適宜條件培養(yǎng)（15°C，14h光照，10h黑暗）。每盆均勻撒播 種子，覆土厚度約〇. 5cm，澆水200mL后用保鮮膜覆蓋，保鮮膜覆蓋生長2天，出苗后揭掉保 鮮膜；
[0118] (2)劑量篩選
[0119] 草銨膦設(shè)置 7 個處理，濃度分別為 Omg/L、10mg/L、30mg/L、50mg/L、80mg/L、100mg/ L、120mg/L，配置以上不同濃度的草銨膦溶液裝于噴壺；每個濃度3個重復；
[0120] 待幼苗長至第一復葉期，在生長至第14天時，開始噴施除草劑；每隔4天噴施1 次，連續(xù)12d，噴施3次；噴施除草劑時一來一回掃過葉面算作一次，保證除草劑均勻撒施 到葉面上，第3次噴施后的第7天統(tǒng)計致死率，篩選出用于土壤篩選的草銨膦致死劑量為 80mg/L ；
[0121] (3)甲基磺酸乙酯半致死劑量誘變紫花苜蓿種子
[0122] 紫花苜蓿種子用濃硫酸（98% )處理3min先打破硬實，蒸餾水沖洗3次；種子在 磷酸緩沖液中（l〇〇mM，PH7.0)，于4°C下預浸種6h，用磷酸緩沖液配置濃度為0. 2% (v/v) 的EMS (甲基磺酸乙酯）溶液，在室溫黑暗條件下用EMS處理種子，處理時長12h，置于低 溫搖床，120rpm/min，18°C不斷搖晃，再用自來水沖洗2h以去除殘留的EMS，每25min放置 lOmin ;之后鋪于干凈的濾紙上將種子晾干待用；挑選誘變后飽滿完好的種子，分裝于離心 管中；將誘變后的紫花苜蓿種子均勻播種于土壤表面，覆土厚度約〇. 5cm，澆水200mL后用 保鮮膜覆蓋，保鮮膜覆蓋生長2天，出苗后揭掉保鮮膜；
[0123] (4)抗草銨膦紫花苜蓿植株篩選
[0124] 待幼苗長至第一復葉期，剔除生長不一致的植株，用篩選出的草銨膦的致死劑量 開始噴施，每隔4天噴施1次，連續(xù)12d，噴施3次；噴施草銨膦時一來一回掃過葉面算作一 次，保證草銨膦均勻撒施到葉面上；3次噴施結(jié)束后的一周左右選取存活植株?；畲茫?br> [0125] (5)抗性植株再次篩選
[0126] 篩選出的可能具有草銨膦抗性的植株通過再次噴施草銨膦進行鑒定。盆中存活單 株繼續(xù)在土壤中生長，待苜蓿長至2-3葉期開始用80mg/L的草銨膦溶液進行噴施，噴施草 銨膦時一來一回掃過葉面算作一次；每隔4天噴一次，噴施2次。
[0127] 實驗例1 : 一種抗草銨膦紫花苜蓿植株的培養(yǎng)基篩選方法
[0128] 1、MS培養(yǎng)基萌發(fā)種子
[0129] 精選6000粒紫花苜蓿種子。配制60個MS培養(yǎng)板備用。無菌條件下進行種子消 毒：（1) 75 %酒精浸洗種子lmin ; (2) 2 %次氯酸鈉溶液浸洗lOmin ; (3) ddH20清洗種子5次。 鋪板，用鑷子將消過毒的種子均勻鋪于MS培養(yǎng)基上，每皿100粒種子，共60皿，封口膜封口 后置于人工培養(yǎng)箱（20°C，16h光照，8h黑暗）發(fā)芽。胚根突破種皮視為萌發(fā)，第5d，平均發(fā) 芽率達到50 %以上，待用。
[0130] 2、劑量篩選
[0131] 草銨膦設(shè)置 9 個處理，濃度分別為 0mg/L、lmg/L、2mg/L、3mg/L、5mg/L、8mg/L、 10mg/L、12mg/L、15mg/L，配置以上不同濃度的草銨膦培養(yǎng)基，每個濃度3個重復，共27個培 養(yǎng)板。
[0132] 無菌條件下，將MS培養(yǎng)基中發(fā)芽的健康種子轉(zhuǎn)入不同濃度草銨膦培養(yǎng)基，每皿放 置50粒，封口膜封口后置于20°C人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)，共計27皿。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18d，18d后 統(tǒng)計致死率，篩選出用于培養(yǎng)基篩選的草銨膦致死劑量為8mg/L。
[0133] 見圖1和圖2,從左至右為紫花苜蓿在不同濃度草銨膦培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天的生長 情況，隨著草銨膦濃度的增加，幼苗死亡率逐漸增高，濃度達到8mg/L時，死亡率突增接近 100%，10mg/L以上濃度完全致死，致死作用明顯，說明高濃度的草銨膦對植株造成了很大 傷害。其中8mg/L是臨界值，從8mg/L開始植株生長嚴重受到抑制，葉片完全枯黃萎蔫。
[0134] 3、甲基磺酸乙酯半致死劑量誘變紫花苜蓿種子
[0135] 紫花苜蓿種子用濃硫酸（98% )處理5min先打破硬實，蒸餾水沖洗5次。種子于 4°C磷酸緩沖液中（100mM，pH7. 0)預浸種12h。用磷酸緩沖液配置濃度為0.8% (v/v)的 EMS (甲基磺酸乙酯）溶液，在室溫黑暗條件下用EMS處理種子，處理時長18h，置于低溫搖 床（120rpm/min，2(TC )不斷搖晃，再用自來水沖洗4h以去除殘留的EMS，每30min放置片 亥IJ。之后鋪于干凈的濾紙上將種子晾干待用。挑選誘變后飽滿完好的紫花苜蓿種子10000 粒，分裝于100個1. 5mL離心管中，每管100粒種子。配置MS培養(yǎng)基，高壓滅菌后于無菌條 件下分裝于100個培養(yǎng)皿中備用。同樣在MS培養(yǎng)基萌發(fā)誘變后的種子，每皿鋪100粒，封 口膜封口后置于人工培養(yǎng)箱（20°C，16h光照，8h黑暗）發(fā)芽。
[0136] 4、抗草銨膦紫花苜蓿植株篩選
[0137] 配置添加了致死劑量8mg/L草銨膦的MS培養(yǎng)板100個，備用。無菌條件下，將步 驟3中MS培養(yǎng)基中發(fā)芽第5d的健康種子轉(zhuǎn)入添加了致死劑量的草銨膦培養(yǎng)基中，每皿50 株，封口膜封口后置于20°C人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)，共計100皿。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18d，每天觀察 統(tǒng)計，18d后篩選出抗性植株。
[0138] 配置1/2MS培養(yǎng)基，將篩選出的存活植株轉(zhuǎn)入1/2MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每2d更 換一次1/2MS培養(yǎng)基，待存活株長出復葉移栽到花盆繼續(xù)生長。
[0139] 見圖3,從左至右為誘變后的紫花苜蓿種子在8mg/L草銨膦培養(yǎng)基中生長不同天 數(shù)的狀況，致死數(shù)隨著培養(yǎng)時間的增加而增加，但部分誘變株在篩選18d后表現(xiàn)出了一定 的耐藥性，并無完全致死。
[0140] 見圖4,左1為培養(yǎng)基中非抗性紫花苜蓿生長狀況，右2-6株為培養(yǎng)基中篩選出來 的抗性植株生長狀況，培養(yǎng)基中培養(yǎng)18天后的非抗性和抗性植株相比，長勢明顯較好，根 系相對發(fā)達，生長速度較快；抗性植株多為兩片子葉，少有真葉伸出，生長受到抑制。
[0141] 5、抗性植株再次篩選
[0142] 將1/2MS培養(yǎng)基中長出一片復葉的紫花苜蓿移栽至土壤繼續(xù)培養(yǎng)，待苜蓿長至 2-3葉期開始用80mg/L的草銨膦溶液進行噴施，每隔6d噴一次，噴施兩次。
[0143] 見圖8,培養(yǎng)基和土壤兩種篩選途徑獲得的抗性植株生長狀況，抗性植株移栽至土 壤再次篩選后，仍具有抗性。
[0144] 實驗例2 : -種抗草銨膦紫花苜蓿植株的土壤篩選方法
[0145] 1、土壤萌發(fā)
[0146] 將挑選出的健康飽滿的紫花苜蓿種子播種于花盆，花盆規(guī)格250 X 160,盆栽土壤 為草炭土與蛭石1:1比例混合，pH為8. 7,植物生長室適宜條件培養(yǎng)。每盆均勻撒播100粒 種子，覆土厚度約lcm，澆適量水后用保鮮膜覆蓋，保鮮膜覆蓋生長3d左右，出苗后揭掉保 鮮膜?？傆?2盆。
[0147] 2、劑量篩選
[0148] 草銨膦設(shè)置 7 個處理，濃度分別為 Omg/L、10mg/L、30mg/L、50mg/L、80mg/L、100mg/ L、120mg/L，配置以上不同濃度的草銨膦溶液裝于噴壺。每個濃度3個重復，共21盆。
[0149] 待幼苗長至第一復葉期，約在生長至第15d時，開始噴施除草劑。每隔6d噴施1 次，連續(xù)18d，噴施3次。噴施除草劑時一來一回掃過葉面算作一次，保證除草劑均勻撒施 到葉面上。第3次噴施后的第7d統(tǒng)計致死率，篩選出用于土壤篩選的草銨膦致死劑量為 80mg/L。
[0150] 見圖5,左為對照，右兩列為紫花苜蓿在噴施不同濃度草銨膦后的生長狀況，隨著 草銨膦噴施濃度的加大，對紫花苜蓿幼苗的傷害愈大，植株漸漸枯黃萎蔫，到80mg/L時，植 株已基本致死。選此濃度為草銨膦土壤篩選的最佳劑量。
[0151] 3、甲基磺酸乙酯半致死劑量誘變紫花苜蓿種子
[0152] 紫花苜蓿種子用濃硫酸（98% )處理5min先打破硬實，蒸餾水沖洗5次。種子于 4°C磷酸緩沖液中（100mM，pH7. 0)預浸種12h。用磷酸緩沖液配置濃度為0.8% (v/v)的 EMS (甲基磺酸乙酯）溶液，在室溫黑暗條件下用EMS處理種子，處理時長18h，置于低溫搖 床（120rpm/min，20°C )不斷搖晃，再用自來水沖洗4h以去除殘留的EMS，每30min放置片 亥IJ。之后鋪于干凈的濾紙上將種子晾干待用。挑選誘變后飽滿完好的紫花苜蓿種子10000 粒，播種于土壤表面，共100盆，每盆均勻撒播100粒種子。覆土厚度約lcm，澆適量水后用 保鮮膜覆蓋，保鮮膜覆蓋生長3d左右，出苗后揭掉保鮮膜。
[0153] 4、抗草銨膦紫花苜蓿植株篩選
[0154] 待幼苗長至第一復葉期，剔除生長不一致的植株，用篩選出的草銨膦的致死劑量 開始噴施，每隔6d噴施1次，連續(xù)18d，噴施3次。噴施草銨膦時一來一回掃過葉面算作一 次，保證草銨膦均勻撒施到葉面上。3次噴施結(jié)束后的一周左右選取存活植株?；畲?。
[0155] 見圖6,為土壤中80mg/L草銨膦噴施篩選后盆中植株生長狀況，從圖中可以看出， 3次篩選后，盆中植株僅有極少數(shù)存活，可初步確定為抗性植株。
[0156] 見圖7,左為盆中非抗性單株生長狀況，右為盆中篩選出來的抗性植株生長狀況， 最終存活下來的抗性單株與非抗性的對比，同培養(yǎng)基篩選途徑結(jié)果一致，抗性單株長勢明 顯比對照弱，對照植株已5葉期，而抗性植株才至1葉期，葉色黃綠，根長明顯比對照短，有 明顯的生長滯后性。
[0157] 5、抗性植株再次篩選
[0158] 篩選出的可能具有抗草銨膦性的植株通過再次噴施草銨膦進行鑒定，盆中存活單 株繼續(xù)在土壤中生長，待苜蓿長至2-3葉期開始用80mg/L的草銨膦溶液進行噴施，每隔6d 噴一次，噴施兩次。
[0159] 見圖8,培養(yǎng)基和土壤兩種篩選途徑獲得的抗性植株生長狀況，隨著時間的增長， 抗性植株逐漸長大。
[0160] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和 原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種抗草銨膦紫花苜蓿植株的培養(yǎng)基篩選方法，其特征在于包括如下步驟： (1) MS培養(yǎng)基萌發(fā)種子 精選紫花苜蓿種子；配制MS培養(yǎng)基培養(yǎng)板備用；無菌條件下進行種子消毒：60-100% 酒精浸洗種子2-0. 5min ;2%次氯酸鈉溶液浸洗5-15min ;ddH20清洗種子3-10次；鋪板， 用鑷子將消過毒的種子均勻鋪于MS培養(yǎng)基上，封口膜封口后置于人工培養(yǎng)箱，22-18°C， 〇_18h光照，24-6h黑暗發(fā)芽；胚根突破種皮視為萌發(fā)，第3-6天，平均發(fā)芽率達到50 %以 上，待用； (2) 劑量篩選 草銨膦設(shè)置多個處理，濃度分別為〇mg/L至15mg/L，配置以上不同濃度的草銨膦培養(yǎng) 基，每個濃度多個重復，設(shè)與濃度相匹配的多個培養(yǎng)板； 無菌條件下，將MS培養(yǎng)基中發(fā)芽的健康種子轉(zhuǎn)入不同濃度草銨膦培養(yǎng)基，封口膜封口 后置于18-22°C人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18天，18天后統(tǒng)計致死率，篩選出用于培 養(yǎng)基篩選的草銨膦致死劑量為8mg/L ; (3) 甲基磺酸乙酯半致死劑量誘變紫花苜蓿種子 紫花苜蓿種子用98 %濃硫酸處理3-10min先打破硬實，蒸餾水沖洗3-10次；種子在 100mM，pH7. 0的磷酸緩沖液中，于4°C下預浸種6-18h，用磷酸緩沖液配置濃度為0. 2-2. 0 % (v/v)的甲基磺酸乙酯溶液，在室溫黑暗條件下用甲基磺酸乙酯處理種子，處理時長 12-24h，置于低溫搖床，120rpm/min，18-22°C不斷搖晃，再用自來水沖洗2-5h以去除殘留 的甲基磺酸乙酯，每25-35min放置10-20min ;之后鋪于干凈的濾紙上將種子晾干待用；挑 選誘變后飽滿完好的種子，分裝于離心管中；配制MS基本培養(yǎng)基培養(yǎng)板備用；在MS培養(yǎng)基 萌發(fā)誘變后的種子，封口膜封口后置于人工培養(yǎng)箱，22-18°C，0_18h光照，24-6h黑暗發(fā)芽； (4) 抗草銨膦紫花苜蓿植株篩選 配置添加了致死劑量8mg/L草銨膦的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)板備用；無菌條件下，將步驟（3) 中MS培養(yǎng)基萌發(fā)第3-6天的健康種子轉(zhuǎn)入添加了致死劑量的草銨膦培養(yǎng)基中，封口膜封口 后置于22-18°C人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-20d，每天觀察統(tǒng)計，10-20d后篩選出 抗性植株； 配置1/2MS培養(yǎng)基，將篩選出的存活植株轉(zhuǎn)入1/2MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每2-3天更換 一次1/2MS培養(yǎng)基，待存活株長出復葉移栽到花盆繼續(xù)生長； (5) 抗性植株再次篩選 將1/2MS培養(yǎng)基中長出一片復葉的幼苗移栽至土壤繼續(xù)培養(yǎng)，待幼苗長至2-3葉期開 始用80mg/L的草銨膦溶液進行噴施，每隔4-8d噴一次，噴施2次。
2. -種抗草銨膦紫花苜蓿植株的土壤篩選方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 土壤萌發(fā)種子 將挑選出的健康飽滿的紫花苜蓿種子播種于花盆，盆栽土壤為草炭土與蛭石1:1比例 混合，pH為8. 7,植物生長室培養(yǎng)，25-15°C，14-18h光照，10-6h黑暗；每盆均勻撒播種子，覆 土厚度約〇. 5-2cm，澆水200-500mL后用保鮮膜覆蓋，保鮮膜覆蓋生長2-5天，出苗后揭掉保 鮮膜； (2) 劑量篩選 草銨膦設(shè)置多個處理，濃度分別為〇mg/L至120mg/L，配置以上不同濃度的草銨膦溶液 裝于噴壺；每個濃度多個重復； 待幼苗長至第一復葉期，在生長至第14-16天時，開始噴施除草劑；每隔4-8天噴施1 次，連續(xù)12-24d，噴施3次；噴施除草劑時一來一回掃過葉面算作一次，保證除草劑均勻撒 施到葉面上，第3次噴施后的第7天統(tǒng)計致死率，篩選出用于土壤篩選的草銨膦致死劑量為 80mg/L ； (3) 甲基磺酸乙酯半致死劑量誘變紫花苜蓿種子 紫花苜蓿種子用98 %濃硫酸處理3-10min先打破硬實，蒸餾水沖洗3-10次；種子在 100mM，pH7. 0的磷酸緩沖液中，于4°C下預浸種6-18h，用磷酸緩沖液配置濃度為0. 2-2. 0 % (v/v)的甲基磺酸乙酯溶液，在室溫黑暗條件下用甲基磺酸乙酯處理種子，處理時長 12-24h，置于低溫搖床，120rpm/min，18-22°C不斷搖晃，再用自來水沖洗2-5h以去除殘留 的甲基磺酸乙酯，每25-35min放置10-20min ;之后鋪于干凈的濾紙上將種子晾干待用；挑 選誘變后飽滿完好的種子，分裝于離心管中；將誘變后的紫花苜蓿種子均勻播種于土壤表 面，覆土厚度約〇. 5-2cm，澆水200-500mL后用保鮮膜覆蓋，保鮮膜覆蓋生長2-5天，出苗后 揭掉保鮮膜； (4) 抗草銨膦紫花苜蓿植株篩選 待幼苗長至第一復葉期，剔除生長不一致的植株，用篩選出的草銨膦致死劑量開始噴 施，每隔4-8天噴施1次，連續(xù)12-24d，噴施3次；噴施草銨膦時一來一回掃過葉面算作一 次，保證草銨膦均勻撒施到葉面上；3次噴施結(jié)束后的一周左右選取存活植株?；畲茫? (5) 抗性植株再次篩選 篩選出的可能具有草銨膦抗性的植株通過再次噴施草銨膦進行鑒定；盆中存活單株繼 續(xù)在土壤中生長，待幼苗長至2-3葉期開始用80mg/L的草銨膦溶液進行噴施，噴施草銨膦 時一來一回掃過葉面算作一次；每隔4-8天噴一次，噴施2次。
【文檔編號】A01H1/06GK104186308SQ201410429290
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月28日
【發(fā)明者】張吉宇, 霍雅馨, 段珍, 狄紅艷, 駱凱, 吳凡 申請人:蘭州大學