一種竹節(jié)參e-香樹素合酶基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種竹節(jié)參e-香樹素合酶基因及其應(yīng)用，利用正向引物P1:5’ATGTGGAAGCTTAAGATAGCGGA3’；反向引物P2:5’TTAGGTGCCMGGGACGGTGAT3’，以竹節(jié)參cDNA文庫為模板擴(kuò)增，可獲得竹節(jié)參P-香樹素合酶基因，其序列為SEQIDN0.1所示。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將其導(dǎo)入到竹節(jié)參中，提高竹節(jié)參中齊墩果烷型皂苷的含量。
【專利說明】一種竹節(jié)參β-香樹素合酶基因及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，主要涉及竹節(jié)參中β -香樹素合酶（β -amyrin synthase)基因的克隆和應(yīng)用，

【背景技術(shù)】
[0002] 竹節(jié)參（Panax japonicus C. A. Mey)屬于五加科人參屬（Panax L.)植物是傳統(tǒng)的 名貴中藥材之一，具有較高的藥用價值，如增強人體免疫力、抗腫瘤、抗病毒、抗疲勞以及保 護(hù)心肌等作用，其主要有效成分為皂苷類化合物，其中以齊墩果烷型五環(huán)三萜類皂苷為主， 同時含有少量達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷。
[0003] 竹節(jié)參是中國藥典收載品種，具有廣闊的應(yīng)用前景和可觀的經(jīng)濟(jì)價值，目前中國 竹節(jié)參的野生資源近于瀕危，人工栽培藥材生長周期長，造成目前市場供不應(yīng)求的現(xiàn)狀。通 過研究竹節(jié)參中活性成分三萜皂苷生物合成的途徑及其調(diào)控的分子機(jī)制，找出其中的關(guān)鍵 酶，實現(xiàn)其基因的定位、克隆及高效表達(dá)，在分子水平上對三萜皂苷生物合成進(jìn)行人工調(diào) 控，進(jìn)一步實現(xiàn)三萜皂苷類化合物的規(guī)模生產(chǎn)，以提供醫(yī)藥市場的需求。
[0004] β -香樹素合酶（β-amyrin synthase, β AS)基因在三廠類阜苷的生物合成途徑 中起著重要的作用。β AS催化2, 3-氧化角鯊烯生成β -香樹素 ，β -香樹素再經(jīng)一系列生 化反應(yīng)生成齊墩果烷型皂苷。β AS被公認(rèn)為是控制2, 3-氧化角鯊烯流向齊墩果烷型皂苷 合成途徑的關(guān)鍵酶。
[0005] 本研究首次利用第二代Solexa HiSeq2000進(jìn)行竹節(jié)參全株的轉(zhuǎn)錄組測序及De novo拼接。分析找到竹節(jié)參中編碼香樹素合酶的候選基因并進(jìn)行體外克隆表達(dá)，驗證 其功能，為竹節(jié)參齊墩果烷型皂苷化合物的生物合成提供理論基礎(chǔ)。
[0006] 在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開報道過本專利申請中所提及的竹節(jié)參 β -香樹素合酶基因及其氨基酸序列，此基因編碼的酶在竹節(jié)參中齊墩果烷型皂苷化合物 的生物合成的過程中有重要的作用，本研究認(rèn)為體外克隆該基因是利用基因工程方法和技 術(shù)來調(diào)控竹節(jié)參中齊墩果烷型皂苷化合物生物合成的關(guān)鍵點。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種竹節(jié)參β-香樹素合酶（PJPAS)基因，其序列為SEQ ID NO. 1所示。該基因編碼的酶是直接催化2,3_氧化角鯊烯行成β-香樹素，而β-香樹 素為齊墩果烷型皂苷的前體，進(jìn)而為人參屬植物中齊墩果烷型皂苷含量的積累提供技術(shù)手 段。
[0008] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種竹節(jié)參β_香樹素合酶（PJPAS)基因編碼的蛋 白質(zhì)，其序列為SEQ ID NO. 2所示。
[0009] 本發(fā)明的最后一個目的在于提供一種竹節(jié)參β_香樹素合酶（PJPAS)基因在提 高竹節(jié)參中齊墩果烷型皂苷含量的應(yīng)用，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將其導(dǎo)入到竹節(jié)參 中，提高竹節(jié)參中齊墩果烷型皂苷的含量。
[0010] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：
[0011] 一種竹節(jié)參香樹素合酶（PJPAS)基因（以下稱為PJ PAS基因），其制備方法 如下：
[0012] 利用正向引物 P1:5'ATGTGGAAGCTTAAGATAGCGGA3' ；反向引物 P2:5' TTAGGTGCCAAGGGACGGTGAT3'，以竹節(jié)參cDNA文庫為模板擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序為94°C預(yù) 變性5!1^11，941：變性4〇8,541：退火11^11，721：延伸9〇8,40個循環(huán)后，721：延伸1〇1^11。
[0013] 最終獲得了 PJP AS基因，其序列為SEQ ID NO. 1所示，編碼的蛋白質(zhì)為SEQ ID NO. 2所示。
[0014] 一種竹節(jié)參β -香樹素合酶（PJ β AS)基因在提高竹節(jié)參中齊墩果烷型皂苷含量 的應(yīng)用，其應(yīng)用過程如下：
[0015] 將竹節(jié)參β -香樹素合酶蛋白質(zhì)（SEQ ID NO. 2所示）對應(yīng)的PJ β AS基因（優(yōu)選 SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列）通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入珠子參，可獲得高齊墩果 烷型皂苷含量的的轉(zhuǎn)基因植株。
[0016] 本發(fā)明的所要保護(hù)的內(nèi)容還包括：
[0017] 編碼SEQ ID NO. 2所示氨基酸的核苷酸序列；優(yōu)選SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序 列。
[0018] 含有本發(fā)明的竹節(jié)參β-香樹素合酶（PJPAS)基因全序列或其ORF序列的重組 載體，如原核類載體，真核類表達(dá)載體及RNAi載體均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，包括但不限 于 pBI121，pCAMBIA1301。
[0019] 含有本發(fā)明的竹節(jié)參β-香樹素合酶（PJPAS)基因全序列或其ORF序列的宿主 細(xì)胞，如含有上述的重組載體的宿主細(xì)胞也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。包括但不限于煙草細(xì) 胞大腸桿菌細(xì)胞、農(nóng)桿菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、竹節(jié)參細(xì)胞或竹節(jié)參發(fā)根細(xì)胞。
[0020] 本發(fā)明的竹節(jié)參香樹素合酶（PJPAS)基因的應(yīng)用，包括用所述的重組載體， 如植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；或者用所述含有該基因的農(nóng)桿菌與植物細(xì)胞共培養(yǎng)，得到 轉(zhuǎn)基因的植物發(fā)根系；或者用所述的發(fā)根細(xì)胞再生植株；或者用所述的竹節(jié)參β -香樹素 合酶（PJPAS)基因全序列或其ORF序列的轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因生物體，包括但不限于煙草、酵 母、擬南芥、竹節(jié)參發(fā)根。
[0021] 本發(fā)明中宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞包括大腸桿 菌；常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、煙草細(xì)胞和其它植物細(xì)胞。
[0022] 利用本發(fā)明的竹節(jié)參香樹素合酶（PJi3AS)，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選 出與竹節(jié)參β_香樹素合酶（PJPAS)發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮抗劑等。
[0023] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0024] 本發(fā)明所提供的竹節(jié)參β -香樹素合酶（PJ β AS)基因是首次從竹節(jié)參植物中克 隆制備所得，利用本發(fā)明的技術(shù)可以對竹節(jié)參等含有同類化合物的藥用植物進(jìn)行基因工程 改造，通過轉(zhuǎn)基因來提高植物體內(nèi)的齊墩果烷型皂苷化合物的含量。竹節(jié)參β_香樹素合 酶（PJPAS)基因可參與竹節(jié)參齊墩果烷型皂苷化合物的生物合成，因此本專利為竹節(jié)參 齊墩果烷型皂苷生物合成的進(jìn)一步研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。
[0025] 本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了高含量齊墩果烷型皂苷類化合物的植株，為人參屬 植物中齊墩果烷型皂苷類活性成分的工業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)支撐。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為竹節(jié)參總RNA電泳圖。
[0027] 圖2為PJ β AS功能域預(yù)測分析。
[0028] 圖3為PJ β AS系統(tǒng)進(jìn)化樹。
[0029] 圖4為表達(dá)載體pYES2-PJ β AS構(gòu)建示意圖。
[0030] 圖5為酶活力檢測示意圖。

【具體實施方式】
[0031] 本發(fā)明所述方案如未特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方案，所用試劑如未特別說明， 均購自生物技術(shù)公司。
[0032] 實施例1 :
[0033] 竹節(jié)參轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)分析
[0034] 1、樣品采集
[0035] 竹節(jié)參植株來源于湖北恩施，分別取根莖、葉、花、果實置液氮中速凍后，在-80°C 冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0036] 2、竹節(jié)參總RNA的分離和檢測
[0037] 對_80°C保存的各類樣本于液氮中充分研磨，然后采用優(yōu)化的Trizol法對樣本進(jìn) 行總RNA的提取，全過程保證在低溫條件下進(jìn)行，加入一定濃度的PVP溶液（聚乙烯吡咯烷 酮），并適當(dāng)加大β -巰基乙醇的濃度，離心去除PVP和β -巰基乙醇后，采用高濃度NaAc 溶液析出RNA，DNase去除殘留DNA完成RNA的純化。用1. 0%瓊脂糖電泳檢測RNA的完整 性（圖1)，用Nanodrop2000核酸定量儀測定A260、A280比值和濃度，RNA樣本置于-80°C 冰箱備用。
[0038] 3、轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq)
[0039] 用 oligo (dT)的磁珠從總 RNA 中富集 mRNA，接加入 fragmentation buffer 將 mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物（random hexamers)合成第一條 cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二條cDNA鏈，在經(jīng) 過QiaQuick PCR試劑盒純化并被EB緩沖液洗脫之后進(jìn)行末端修復(fù)、加 poly (A)并連接測 序接頭，瓊脂糖凝膠電泳分離并選擇片段大小，PCR擴(kuò)增構(gòu)建測序文庫，利用第二代Solexa HiSeq2000進(jìn)行RNA測序，及De novo拼接。
[0040] 4、候選基因初步篩選
[0041] 通過GO注釋，Blast比對分析以及MEGA5. 0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3)等軟件分析 初步篩選到竹節(jié)參中編碼β-香樹素合酶的候選基因。
[0042] 實施例2 :
[0043] 竹節(jié)參β -香樹素合酶基因的克隆
[0044] 利用正向引物 P1:5'ATGTGGAAGCTTAAGATAGCGGA3' ；反向引物 P2:5' TTAGGTGCCAAGGGACGGTGAT3'，以竹節(jié)參根莖cDNA文庫為模板擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序 為941：預(yù)變性51^11，941：變性4〇8,541：退火11^11，721：延伸9〇8,40個循環(huán)后，721：延伸 IOmin克隆候選基因全長序列，鏈接到克隆載體pMDIS-T上并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 E. coli DH5a中，步驟如下：
[0045] a)從_80°C超低溫冰箱中取100 μ L感受態(tài)細(xì)胞懸液，解凍后置于冰上；
[0046] b)加入5 μ L連接產(chǎn)物，用移液器輕輕吹打混勻，冰浴30min ;
[0047] c) 42°C熱激90s，迅速置冰上5min ;
[0048] d)向EP管中加入ImL LB液體培養(yǎng)基（不含抗生素），37°C 200rpm45min ;
[0049] e)搖菌后取100 μ L菌液涂布于含抗生素的平板上，37°C培養(yǎng)箱過夜；
[0050] f)挑取單菌落于4mL含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)過夜選 取陽性克隆送樣測序。
[0051] 至此獲得了竹節(jié)參β -香樹素合酶基因，其序列為SEQ ID NO. 1所示。
[0052] 實施例3 :
[0053] PJ β AS基因的生物信息學(xué)分析
[0054] 本發(fā)明涉及的竹節(jié)參β-香樹素合酶（PJPAS)基因全長為2292bp，其序列為SEQ ID NO. 1所示，其中開放讀碼框位于1?2292bp，編碼的蛋白質(zhì)序列為SEQ ID NO. 2所示。 將拼接分析好的β_香樹素合酶全長序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast。該基因具有典型的 ISOP REN_C2_like superfamily 結(jié)構(gòu)域，如圖 2。
[0055] 實施例4 :
[0056] PJ β AS基因功能的研究
[0057] 1、表達(dá)載體的構(gòu)建
[0058] 依據(jù)竹節(jié)參PJ β AS基因全長序列（SEQ ID NO. 1)的0RF，設(shè)計擴(kuò)增完整開放閱讀 框的引物，分別在正、反向引物上分別引入限制性酶切位點KpnI和XhoI，利用正向引物P1 : 5' GGTACCATGTGGAAGCTTAAGATAGCGGA 反向引物 P2 :5' CTCGAGTTAGGTGCCAAGGGACGGTGAT3' 進(jìn) 行PCR反應(yīng)，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，30min后照相，觀察膠圖，擴(kuò)增片段為2304bp，TA克隆， 提取質(zhì)粒。以KpnI和XhoI酶切擴(kuò)增產(chǎn)物2h，利用回收試劑盒（Takara公司，中國）純化酶 切產(chǎn)物。同時利用KpnI和XhoI酶在37°C下酶切pYES2載體2h，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀 察膠圖，并利用試劑盒回收大小約5856bp的片段。
[0059] 二者經(jīng)連接酶在16°C連接過夜。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉 素的LB平板上篩選重組子。PCR檢測陽性菌斑，提取陽性克隆質(zhì)粒，進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切 電泳鑒定，保存且有正確目標(biāo)的重組質(zhì)粒PYES2-PJ β AS用于表達(dá)轉(zhuǎn)化。該表達(dá)載體命名為 PYES2-PJ β AS (圖 4)。
[0060] 2、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
[0061] 以PYES2-PJ β AS質(zhì)粒轉(zhuǎn)化突變酵母宿主菌GIL77,在缺少尿嘧啶的完全合成培養(yǎng) 基SC-U(20ug/ml麥角固醇，13ug/ml血紅素，5mg/mlTween80)上30°C震蕩培養(yǎng)2d，收集細(xì) 胞在不含葡萄糖的3〇11培養(yǎng)基（20即/1111麥角固醇，131^/1111血紅素，511^/111]^￥661180,2(%半 乳糖）上30°C培養(yǎng)IOh.收集細(xì)胞懸浮于0. 1Μ，ρΗ7. 0的磷酸鉀溶液中添加3%葡萄糖和血 紅素30°C培養(yǎng)24h。回收菌體，分離微粒體，純化蛋白。
[0062] 3、酶促反應(yīng)鑒定
[0063] 對表達(dá)純化的β -香樹素合酶進(jìn)行酶活力的檢測，加入2ug的純化表達(dá)蛋白到反 應(yīng)體系0.說磷酸鉀緩沖液（?!17.5)，2,3-環(huán)氧角鯊烯，11111的001'，111^/1111的以5,0.05% 的Triton X-100。2, 3-環(huán)氧角鯊烯作為反應(yīng)底物，底物濃度越高產(chǎn)生的β-香樹素含量越 高。反應(yīng)總體系在37°C下預(yù)孵20min。在100°C下加熱3min終止反應(yīng)，用氯仿提取反應(yīng)產(chǎn) 物。檢測β-香樹素的含量。如圖5所示當(dāng)添加的底物2,3_環(huán)氧角鯊烯濃度越高時產(chǎn)生 的β-香樹素含量越高，反應(yīng)速率隨著β-香樹素合酶的減少而逐漸減少。
[0064] 實施例5 :PJi3 AS在竹節(jié)參中進(jìn)行真核表達(dá)及轉(zhuǎn)基因竹節(jié)參發(fā)根中總皂苷含量的 測定
[0065] 轉(zhuǎn)基因用的受體材料采自湖北恩施。
[0066] 含目的基因（竹節(jié)參β -香素樹合酶基因）的表達(dá)載體的構(gòu)建：根據(jù)竹節(jié)參β -香 素樹合酶基因的全長cDNA序列（SEQ ID NO. 1)，在擴(kuò)增編碼區(qū)的正反方向引物上引入限制 性內(nèi)切酶位點（視選用的載體而定），以便構(gòu)建植物表達(dá)載體。
[0067] 具體步驟如下：
[0068] 以實施例2中獲得的含有PJ β AS基因編碼區(qū)的pMD18-T Vector的質(zhì)粒 為模版，在上述構(gòu)建的正向引物前引入BamH I酶切位點，在反向引物前引入Sac I 酶切位點，正向引物 Pl :5'GGATCCATGTGGAAGCTTAAGATAGCGGA3' ：反向引物 P2 : 5' GAGCTCTTAGGTGCCAAGGGACGGTGAT3' 講行 PCR 擴(kuò)增后，TA 克降，提取質(zhì)粒。以 BamH I 和 Sac I酶切擴(kuò)增產(chǎn)物4h，利用回收試劑盒（Takara公司，中國）純化酶切產(chǎn)物。同時利用BamH I和Sac I酶在37°C下酶切pBI121載體4h，在16°C下利用T4連接酶連接產(chǎn)物過夜在保證 閱讀框正確的前提下將竹節(jié)參PJPAS基因的編碼區(qū)克隆到植物表達(dá)載體pBI121上。將酶 切鑒定好的表達(dá)載體PBI121PJ β AS轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，遺傳轉(zhuǎn)化竹節(jié)參。
[0069] 利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的竹節(jié)參遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，所需的材料和操作步驟如下：
[0070] 1)發(fā)根農(nóng)桿菌A4,使用前自冰箱中取出，用YEB培養(yǎng)基傳代2次，菌種在使用前接 種于YEB液體培養(yǎng)基中，28 °C培養(yǎng)過夜。
[0071] 2)取竹節(jié)參細(xì)嫩腋芽，洗凈后置于70%酒精中浸泡lmin，棄酒精，加入2%次氯酸 鈉消毒lOmin，期間搖動數(shù)次，棄去消毒液，用無菌水漂洗4?5次，置于無菌濾紙上晾干，用 無菌刀片將竹節(jié)參腋芽切成5mmX 5mm小片，置于預(yù)培養(yǎng)固體培養(yǎng)基上，在（23±1) °C暗箱 培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)2d。
[0072] 3)經(jīng)過夜培養(yǎng)的發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌液離心后，菌體沉淀用1/2MS重懸，置于4°C中 2h后取出。將預(yù)培養(yǎng)過的竹節(jié)參腋芽浸泡于1/2MS重懸的菌液中5min，用無菌濾紙吸去多 余菌液，放入含250-500mg/L卡那霉素的1/2MS固體培養(yǎng)基中，（23±1) °C黑暗條件下培養(yǎng)， 每2周轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中1次，待長出毛狀根后分離毛狀根，轉(zhuǎn)移至含250-500mg/L卡那 霉素的無激素1/2MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每2周轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中至無菌為止，然后再轉(zhuǎn) 移至不含卡那霉素的無激素1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0073] 4)把在固體培養(yǎng)基上的毛狀根繼代培養(yǎng)物接種于裝有150ml無激素1/2MS液體 培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，培養(yǎng)溫度、光照、轉(zhuǎn)速等培養(yǎng)條件與愈傷組織液體懸浮培養(yǎng)條 件相同，培養(yǎng)20d后，將毛狀根從培養(yǎng)基中取出放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥，然后稱重，貯 存-80°C中備用。
[0074] 陽性株利用常規(guī)real-time PCR進(jìn)行進(jìn)一步的篩選驗證，本發(fā)明所用方法具體如 下：
[0075] 提取具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化珠節(jié)參植株的總RNA，利用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒 將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，半定量所用引物為珠節(jié)參β-香樹素合酶基因特異引物（正向引物 5' -CACTGTCGGATGGTTTAT-3' ；反向引物 5' -CAAGGGACGGTGATGG-3'），反應(yīng)程序為 94°C 時 3 分鐘，94°C變性30秒，61°C退火30秒，72°C延伸45秒，25個循環(huán)；循環(huán)完成后72°C延伸5 分鐘。用植物beta-actin基因做為內(nèi)參基因（正向引物5' -GGAAAAGATTTGGCATC-3'，反向 引物5' -GGGCGTAACCCTCATA-3'）。對竹節(jié)參的野生型和轉(zhuǎn)化系在相同生長狀態(tài)下進(jìn)行目的 基因表達(dá)水平的分析。最終選擇相對于野生型植株，基因表達(dá)量的Fold-change值高于4 倍以上（P〈0. 01)的轉(zhuǎn)化植株作為陽性株進(jìn)行后續(xù)實驗。
[0076] 5)含竹節(jié)參β -香素樹合酶基因的轉(zhuǎn)基因發(fā)根的齊墩果烷型皂苷含量測定
[0077] 根據(jù)2010版《中華人民共和國藥典》，人參屬植物中的皂苷都為三萜皂苷。
[0078] 轉(zhuǎn)基因竹節(jié)參發(fā)根中齊墩果烷型皂苷含量的檢測可使用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，本發(fā) 明具體采用以下步驟：
[0079] 參考袁丁等（華西藥學(xué)雜志，2008, 23 (6) :692-694)的齊墩果烷型皂苷待測溶液 處理方法及檢測方法，利用高效液相色譜法對過表達(dá)竹節(jié)參PJ β AS基因的轉(zhuǎn)基因竹節(jié)參 發(fā)根系和野生型對照組進(jìn)行齊墩果烷型皂苷的含量測定，每組各測20株，標(biāo)準(zhǔn)品為齊墩果 酸，購自中國藥品生物制品檢定所（批號：110709-200505)。
[0080] 測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在過表達(dá)竹節(jié)參PJ β AS基因的轉(zhuǎn)基因竹節(jié)參發(fā)根中齊墩果烷型 皂苷含量比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M平均提高了 2. 3倍（P〈0. 05)。由此證明，竹節(jié)參β -香素樹合 酶基因?qū)Υ龠M(jìn)齊墩果烷型化合物含量的提高有顯著作用，竹節(jié)參β-香素樹合酶基因可用 于利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高齊墩果酸型皂苷含量的研究和產(chǎn)業(yè)化中，具有很好的應(yīng)用前景。
【權(quán)利要求】
1. 一種分離的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示。
2. 編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的核苷酸序列，其序列為SEQ ID NO. 1所示。
4. 含有權(quán)利要求2所述核苷酸序列的植物表達(dá)載體。
5. 含有權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2所述的基因的轉(zhuǎn)基因植株。
6. 權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2所述的基因在提高植物齊墩果烷型皂苷含量中 的應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2所 述的基因在提高竹節(jié)參齊墩果烷型皂苷含量中的應(yīng)用。
【文檔編號】A01H5/00GK104212787SQ201410441707
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月1日
【發(fā)明者】黃璐琦, 陳平, 張紹鵬, 楊濤, 朱聞君, 宋佳, 孫巧, 伍羽中, 鄭用璉, 鄧琛 申請人:黃璐琦, 陳平, 張紹鵬, 楊濤, 朱聞君, 宋佳, 孫巧, 伍羽中, 鄭用璉, 王如峰, 鄧琛, 陳超