索拉膠在防治土傳病原真菌方面的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種索拉膠在防治土傳病原真菌方面的應(yīng)用。將索拉膠置于土壤中，所述索拉膠占土壤質(zhì)量的0.002％-0.2％。本發(fā)明只需要將索拉膠直接拌入土壤，或是間接的混入肥料或農(nóng)藥中再加入到土壤中，索拉膠作為外源碳源，誘導(dǎo)土壤中能降解索拉膠的微生物數(shù)量增加，產(chǎn)生更多降解索拉膠的β-1,3葡聚糖酶，最終降解病原真菌；本發(fā)明方法更加經(jīng)濟(jì)，可行性更高，如果往土壤中直接加入降解真菌的葡聚糖酶，將提高成本；如果往土壤中加入生防微生物，微生物的繁殖和葡聚糖酶的產(chǎn)量受到土壤本身理化性質(zhì)的影響。
【專利說(shuō)明】索拉膠在防治土傳病原真菌方面的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)【技術(shù)領(lǐng)域】，本發(fā)明具體涉及β -葡聚糖索拉膠在防治土傳病原真菌方面的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]葡聚糖是自然合成的非淀粉多糖，作為細(xì)胞壁的重要組成成分廣泛存在于微生物、植物、動(dòng)物界中，也可由細(xì)菌分泌到胞外，成為胞外多糖。不同來(lái)源的葡聚糖其糖苷鍵結(jié)合方式和比例不同，主鏈主要由β-1，3糖苷鍵連接，通常還含有不同比例和大小的β-1，2、β-1，4、β-1，6糖苷鍵連接的支鏈。從裂褶菌，褐藻和酵母中提取的葡聚糖主要是帶β_1，6-分枝的β-1，3-葡聚糖，燕麥β-葡聚糖主要是β-1，3-1，4-葡聚糖。啤酒酵母細(xì)胞壁中的葡聚糖與纖維素一樣，極不容易溶于水，還有香菇多糖，可得然等都不易溶于水，因此都難以得到利用。
[0003]索拉膠是一種由土壤桿菌Agrobacterium sp.ΖΧ09分泌產(chǎn)生的胞外多糖，是一種新結(jié)構(gòu)的葡聚糖(已申請(qǐng)中國(guó)專利，201010146371.2)，經(jīng)過(guò)急性毒理學(xué)和慢性毒理學(xué)的評(píng)價(jià)，索拉膠無(wú)毒安全。索拉膠還能降低肝脂、血脂、體脂和體重(已申請(qǐng)中國(guó)專利，201010198223.5)，預(yù)防和治療便秘的作用(已申請(qǐng)中國(guó)專利，201110028483.2)，具有水溶性生物絮凝劑的作用(已申請(qǐng)中國(guó)專利，201210236587.7)，和預(yù)防和修復(fù)紫外線UVA對(duì)皮膚損傷的作用(已申請(qǐng)中國(guó)專利，201310730754.8)。
[0004]對(duì)土傳病害的防控主要集中在耕作防治、物理防控，化學(xué)防控和生物防控幾個(gè)方面。第一，耕作防治是通過(guò)一系列的農(nóng)業(yè)實(shí)踐和農(nóng)業(yè)技術(shù)減少害蟲和疾病對(duì)作物的影響以提高作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，主要包括輪作、去除已染病作物、休耕制、覆蓋、避免過(guò)度灌溉、株距、除草、播種抗病品種、過(guò)度耕種、移植、選擇最適的播種時(shí)間和收割時(shí)間等等。第二，物理防控主要是通過(guò)對(duì)土壤進(jìn)行處理以達(dá)到防控的目的。第三，化學(xué)防控主要是農(nóng)藥保護(hù)。其中包括咪鮮胺、敵力脫、噻苯咪唑、多菌靈、麥穗靈、苯菌靈和所有的苯并咪唑。目前仍尚無(wú)特效的化學(xué)藥劑可用于生產(chǎn)上防控所有的土傳病原菌。第四，生物防控就是利用微生物間的拮抗、競(jìng)爭(zhēng)、捕食、寄生等關(guān)系抑制病原菌的生長(zhǎng)發(fā)育與繁殖，從而減少病害的發(fā)生。這種防控方法是直接利用有益微生物或者其代謝產(chǎn)物防治植物土傳病害，具有對(duì)環(huán)境安全、無(wú)污染、不易引起病原菌產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)。
[0005]目前利用生物防控土傳病害主要集中在以下兩個(gè)方面，一、利用拮抗微生物防控土傳病害(此方法用得多)；二、利用無(wú)毒菌系或用弱毒株系和促生菌誘導(dǎo)作物產(chǎn)生抗病性來(lái)防控土傳病原菌的侵害。拮抗菌是通過(guò)抑制病原菌的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)植株的系統(tǒng)抗性起作用，又以前者居多。拮抗微生物由主要有三類:細(xì)菌，真菌和放線菌。研宄較多的拮抗細(xì)菌主要有芽孢桿菌(Bacillus spp)、焚光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)、黃單胞桿菌(Xanthomonas sp.)、棒狀桿菌(Corynebacterium sp.)等。其中數(shù)芽抱桿菌的研宄最為廣泛，芽孢桿菌可以產(chǎn)生桿菌肽、環(huán)脂肽、氨基酸等多類抗菌物質(zhì)，還能產(chǎn)生真菌細(xì)胞壁組成成分之一的葡聚糖酶。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是要提供一種索拉膠在防治土傳病原真菌方面的應(yīng)用，該索拉膠具有使用方便、防治土傳病原真菌的功能。
[0007]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案為:一種索拉膠在防治土傳病原真菌方面的應(yīng)用，將索拉膠置于土壤中，所述索拉膠占土壤質(zhì)量的0.002% -0.2%。
[0008]與現(xiàn)有生物防治的技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0009]1.本發(fā)明只需要將索拉膠直接拌入土壤，或是間接的混入肥料或農(nóng)藥中再加入到土壤中，索拉膠作為外源碳源，誘導(dǎo)土壤中能降解索拉膠的微生物數(shù)量增加，產(chǎn)生更多降解索拉膠的β-1，3葡聚糖酶，最終降解病原真菌。
[0010]2.本發(fā)明方法更加經(jīng)濟(jì)，可行性更高，如果往土壤中直接加入降解真菌的葡聚糖酶，將提高成本；如果往土壤中加入生防微生物，微生物的繁殖和葡聚糖酶的產(chǎn)量受到土壤本身理化性質(zhì)的影響。
[0011]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1索拉膠增加土壤中細(xì)菌的菌落數(shù)。
[0013]圖2是本發(fā)明實(shí)施例1索拉膠增加土壤中產(chǎn)β-1, 3葡聚糖酶細(xì)菌的菌落數(shù)。
[0014]圖3是本發(fā)明實(shí)施例1索拉膠增加了土壤β -1, 3葡聚糖酶活性。
[0015]圖4是本發(fā)明實(shí)施例1索拉膠減少土壤中真菌的菌落數(shù)。
[0016]圖5是本發(fā)明實(shí)施例1索拉膠減少土壤中土傳病原真菌的菌落數(shù)。

【具體實(shí)施方式】
[0017]下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0018]下述實(shí)施例中采用的索拉膠結(jié)構(gòu)通式為:
[0019]— {— 3) - β -D-Glcp-(I — 3) -[ β -D-Glcp- (I — 3) - β -D-Glcp-(I — 3) ] 3_ a -D-Glcp- (I 一 3) _ a -D-Glcp- (I 一)} η —
[0020]上述結(jié)構(gòu)中的η基指具有100-10000個(gè)葡萄糖基相連的聚合物。
[0021]利用土壤桿菌ΖΧ09生產(chǎn)索拉膠，其步驟如下:
[0022]a、配置培養(yǎng)液:磷酸二氫鈉lg，硝酸鉀3g，氯化鎂0.2g，無(wú)水氯化鈣0.07g，氯化亞鐵 0.0125g，硫酸錳 0.003g，氯化鋅 0.0075g，蔗糖 30g，水 1000ml，pH 7.0-7.2 ；
[0023]b、將培養(yǎng)液加熱到121°C滅菌15分鐘；
[0024]c、向冷卻至室溫的10mL培養(yǎng)液內(nèi)加入100 μ L平皿菌落液；
[0025]d、28°C發(fā)酵24h形成種子培養(yǎng)液；
[0026]e、向冷卻至室溫的培養(yǎng)液內(nèi)加入10%的種子培養(yǎng)液；
[0027]f、在 28°C發(fā)酵 48h ;
[0028]h、向發(fā)酵液內(nèi)注入超過(guò)兩倍體積的乙醇或丙酮，60°C抽真空干燥得到索拉膠粗品O
[0029]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0030]實(shí)施例1:實(shí)驗(yàn)土壤來(lái)源:取南京郊區(qū)普通菜地的土壤(受到土傳病原真菌感染的土壤)兩份。索拉膠改變土壤微生物群落的條件:土壤中加入濃度為0.2%的索拉膠溶液，使土壤中索拉膠的含量分別為0.002%和0.2%。每隔10天取一次土壤樣品，一部分用于稀釋涂平板計(jì)數(shù)，另一部分用土壤總DNA提取試劑盒提取土壤總DNA，其實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下:
[0031]1.索拉膠對(duì)土壤細(xì)菌的影響:
[0032]I)稀釋涂平板計(jì)數(shù)法記錄土壤細(xì)菌的變化過(guò)程:取Ig 土壤樣品稀釋到1ml無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(15mM，pH 7.0)中，劇烈震蕩30min讓土壤完全均勻的溶解于緩沖液中，并按此方法和比例進(jìn)行梯度稀釋，最后選擇合適的濃度涂布到LB平板，30°C培養(yǎng)24h后計(jì)數(shù)。如圖1所示，土壤中加入0.002%的索拉膠60天后細(xì)菌數(shù)量增加為空白對(duì)照的1.2倍，而加入0.2%的索拉膠60天后細(xì)菌數(shù)量增加為空白對(duì)照的1.5倍。
[0033]2)變性梯度凝膠電泳檢測(cè)土壤中細(xì)菌群落的變化:以土壤整DNA為模板，16SrDNAV3引物357F-GC和518R為引物，以‘touchdown’PCR擴(kuò)增出16S rDNA V3片段，最后進(jìn)行變性梯度凝膠電泳。使用10%的聚丙烯酰胺凝膠，變性范圍40% -60%，PCR產(chǎn)物加上樣緩沖液后上樣，50 μ I/孔，電壓80V，溫度60°C，電泳時(shí)間15小時(shí)。如圖2 (a)所示，加入索拉膠后的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。將改變明顯的條帶切下來(lái)TA克隆后測(cè)序。如圖2(b)所示，有兩條帶B3和B4都是加入索拉膠后土壤中增加的條帶，且這兩條帶跟芽孢桿菌屬具有很近的親緣關(guān)系。
[0034]2.索拉膠對(duì)土壤β-1，3-葡聚糖酶活性的影響:
[0035]以5mg/ml的海帶多糖為底物，用二硝基水楊酸比色法測(cè)量水解得到的葡萄糖的含量來(lái)表征土壤β-1，3-葡聚糖酶活性。如圖3所示，在加入0.002%和0.2%的索拉膠60天時(shí)，β-1, 3-葡聚糖酶的活性分別為0.359mg/g soil/d和0.385mg/g soil/d，跟空白對(duì)照相比分別增加了 8%和15%。
[0036]3.索拉膠對(duì)土壤真菌的影響:
[0037]I)稀釋涂平板計(jì)數(shù)法記錄土壤真菌的變化過(guò)程:取Ig 土壤樣品稀釋到1ml無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(15mM，pH 7.0)中，劇烈震蕩30min讓土壤完全均勻的溶解于緩沖液中，并按此方法和比例進(jìn)行梯度稀釋，最后選擇合適的濃度涂布到PDA平板，30°C培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)。如圖4所示，土壤中加入0.2%的索拉膠60天后真菌數(shù)量從105CFU/g減少到104CFU/g，而加入0.02%的索拉膠60天后真菌數(shù)量也呈現(xiàn)明顯的減少。
[0038]2)變性梯度凝膠電泳檢測(cè)土壤中真菌群落的變化:以土壤整DNA為模板，18SrDNA引物GC-Fung和NSl為引物，擴(kuò)增出18S rDNA片段，最后進(jìn)行變性梯度凝膠電泳。使用8%的聚丙烯酰胺凝膠，變性范圍25% -40%, PCR產(chǎn)物加上樣緩沖液后上樣，50 μ I/孔，電壓60V，溫度60°C，電泳時(shí)間16小時(shí)。如圖5(a)所示，加入索拉膠后的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。將改變明顯的條帶切下來(lái)TA克隆后測(cè)序。如圖5(b)所示，變化的條帶Fl和F3分別跟鐮刀菌屬和斑點(diǎn)小球腔菌具有很近的親緣關(guān)系。選擇枯萎病病原真菌尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)，黑腔病病原真菌斑點(diǎn)小球腔菌(Leptosphaeria)和紋枯病病原真菌立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)的特異性引物對(duì)土壤中三種病原真菌進(jìn)行定量檢測(cè)，相對(duì)DNA的量用2 — ΛΛ CT方法分析，以真菌整DNA作為內(nèi)參。如圖5(c)所示，加入0.002%索拉膠的土壤60天后尖孢鐮刀菌的相對(duì)量從0.99減到0.72，0.2%索拉膠的尖孢鐮刀菌的相對(duì)量從0.98減少到0.54 ;如圖5(d)所示，加入0.002%索拉膠的土壤60天后斑點(diǎn)小球腔菌的相對(duì)量從0.98減到0.81，0.2%索拉膠的斑點(diǎn)小球腔菌的相對(duì)量從0.97減少到0.64 ；;如圖5(e)所示，加入0.002%索拉膠的土壤60天后立枯絲核菌的相對(duì)量從
0.99減到0.72，0.2%索拉膠的立枯絲核菌的相對(duì)量從0.98減少到0.54。
[0039]實(shí)施例2:實(shí)驗(yàn)土壤來(lái)源:取南京郊區(qū)普通菜地的土壤(受到土傳病原真菌感染的土壤)兩份。索拉膠改變土壤微生物群落的條件:將索拉膠固體粉末加入土壤中，使土壤中索拉膠的含量分別為0.002%和0.2%。每隔10天取一次土壤樣品，一部分用于稀釋涂平板計(jì)數(shù)，另一部分用土壤總DNA提取試劑盒提取土壤總DNA。
[0040]1.索拉膠對(duì)土壤細(xì)菌的影響:
[0041 ] I)稀釋涂平板計(jì)數(shù)法記錄土壤細(xì)菌的變化過(guò)程。土壤中加入0.002%的索拉膠60天后細(xì)菌數(shù)量增加為空白對(duì)照的1.3倍，而加入0.2%的索拉膠60天后細(xì)菌數(shù)量增加為空白對(duì)照的1.5倍。
[0042]2)變性梯度凝膠電泳檢測(cè)土壤中細(xì)菌群落的變化。加入索拉膠后的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。將改變明顯的條帶切下來(lái)TA克隆后測(cè)序。有兩條帶是加入索拉膠后土壤中增加的條帶，且這兩條帶跟芽孢桿菌屬具有很近的親緣關(guān)系。
[0043]2.索拉膠對(duì)土壤β -1, 3-葡聚糖酶活性的影響。在加入0.002%和0.2%的索拉膠60天時(shí)，β-1，3-葡聚糖酶的活性分別為0.357mg/g soil/d和0.385mg/g soil/d，跟空白對(duì)照相比分別增加了 8%和15%。
[0044]3.索拉膠對(duì)土壤真菌的影響:
[0045]I)稀釋涂平板計(jì)數(shù)法記錄土壤真菌的變化過(guò)程。土壤中加入0.2 %的索拉膠60天后真菌數(shù)量從105CFU/g減少到104CFU/g，而加入0.002 %的索拉膠60天后真菌數(shù)量也呈現(xiàn)明顯的減少。
[0046]2)變性梯度凝膠電泳檢測(cè)土壤中真菌群落的變化。加入索拉膠后的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。將改變明顯的條帶切下來(lái)TA克隆后測(cè)序。變化的條帶Fl和F3分別跟鐮刀菌屬和斑點(diǎn)小球腔菌具有很近的親緣關(guān)系。加入0.002%索拉膠的土壤60天后尖孢鐮刀菌的相對(duì)量從0.99減到0.72，0.2%索拉膠的尖孢鐮刀菌的相對(duì)量從0.98減少到0.54 ；加入0.002%索拉膠的土壤60天后斑點(diǎn)小球腔菌的相對(duì)量從0.98減到0.82，0.2%索拉膠的斑點(diǎn)小球腔菌的相對(duì)量從0.97減少到0.64 ;加入0.002%索拉膠的土壤60天后立枯絲核菌的相對(duì)量從0.99減到0.74，0.2%索拉膠的立枯絲核菌的相對(duì)量從0.98減少到0.55。
[0047]實(shí)施例3:實(shí)驗(yàn)土壤來(lái)源:取南京郊區(qū)普通菜地的土壤(受到土傳病原真菌感染的土壤)。索拉膠改變土壤微生物群落的條件:將索拉膠固體粉末加入土壤中，使土壤中索拉膠的含量為0.02%。每隔10天取一次土壤樣品，一部分用于稀釋涂平板計(jì)數(shù)，另一部分用土壤總DNA提取試劑盒提取土壤總DNA。
[0048]1.索拉膠對(duì)土壤細(xì)菌的影響:
[0049]I)稀釋涂平板計(jì)數(shù)法記錄土壤細(xì)菌的變化過(guò)程。土壤中加入0.02%的索拉膠60天后細(xì)菌數(shù)量增加為空白對(duì)照的1.3倍。
[0050]2)變性梯度凝膠電泳檢測(cè)土壤中細(xì)菌群落的變化。加入索拉膠后的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。將改變明顯的條帶切下來(lái)TA克隆后測(cè)序。有兩條帶是加入索拉膠后土壤中增加的條帶，且這兩條帶跟芽孢桿菌屬具有很近的親緣關(guān)系。
[0051]2.索拉膠對(duì)土壤β -1, 3-葡聚糖酶活性的影響。在土壤加入0.02%的索拉膠60天后，β-1，3-葡聚糖酶的活性分別為0.378mg/g soil/d，跟空白對(duì)照相比增加了 15%。
[0052]3.索拉膠對(duì)土壤真菌的影響:
[0053]I)稀釋涂平板計(jì)數(shù)法記錄土壤真菌的變化過(guò)程。，土壤中加入0.02%的索拉膠60天后真菌數(shù)量從105CFU/g減少到104CFU/g。
[0054]2)變性梯度凝膠電泳檢測(cè)土壤中真菌群落的變化。變化的條帶分別跟鐮刀菌屬和斑點(diǎn)小球腔菌具有很近的親緣關(guān)系。加入0.02%索拉膠的土壤60天后尖孢鐮刀菌的相對(duì)量從0.98減到0.66 ;斑點(diǎn)小球腔菌的相對(duì)量從0.98減到0.85 ;立枯絲核菌的相對(duì)量從0.99 減到 0.77。
[0055]本發(fā)明中的索拉膠也可以先加入肥料和農(nóng)藥中，再加入土壤。
【權(quán)利要求】
1.一種索拉膠在防治土傳病原真菌方面的應(yīng)用，其特征在于，將索拉膠置于土壤中，所述索拉膠占土壤質(zhì)量的0.002%-0.2%。
2.如權(quán)利要求1所述的索拉膠在防治土傳病原真菌方面的應(yīng)用，其特征在于，所述索拉膠具有如下通式卜 3) - β -D-Glcp- (I — 3) - [ β -D-Glcp- (I — 3) - β -D-Glcp- (1-3)]3- a -D-Glcp- (I 一 3) _ a -D-Glcp- (I 一)} η — 其中，η基為具有100-10000個(gè)葡萄糖基相連的聚合物。
3.如權(quán)利要求1所述的索拉膠在防治土傳病原真菌方面的應(yīng)用，其特征在于，所述索拉膠利用土壤桿菌ΖΧ09制備，其步驟如下: a、配置培養(yǎng)液:磷酸二氫鈉lg，硝酸鉀3g，氯化鎂0.28，無(wú)水氯化鈣0.078，氯化亞鐵 0.01258，硫酸錳0.0038，氯化鋅 0.00758，蔗糖3(^，水 1000 ml，pH 7.0-7.2 ； b、將培養(yǎng)液加熱到121°C滅菌15分鐘； C、向冷卻至室溫的10mL培養(yǎng)液內(nèi)加入10PL平皿菌落液； d、28°C發(fā)酵24h形成種子培養(yǎng)液； e、向冷卻至室溫的培養(yǎng)液內(nèi)加入10%的種子培養(yǎng)液；
f、在28°C 發(fā)酵 48h ； h、向發(fā)酵液內(nèi)注入超過(guò)兩倍體積的乙醇或丙酮，60°C抽真空干燥得到索拉膠粗品。
【文檔編號(hào)】A01N43/16GK104488867SQ201410579023
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月24日
【發(fā)明者】張建法, 王世明, 陳云美 申請(qǐng)人:南京理工大學(xué)