一種大鱗副泥鰍良種選育方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種大鱗副泥鰍良種選育方法。具體而言，該方法包括如下步驟：1）提供12個(gè)與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的微衛(wèi)星分子標(biāo)記；2）選擇親本群體1進(jìn)行電子標(biāo)記并提取DNA；3）采用分子標(biāo)記對(duì)親本群體1進(jìn)行基因型篩選并選定親本群體2；4）采用分子標(biāo)記對(duì)親本群體2進(jìn)行基因型篩選，分別建立具有不同純合基因型的親本群體3和4；5）以親本群體3和4為繁殖群體，分別進(jìn)行人工繁殖獲得親本群體5和6；6）親本群體5和6之間進(jìn)行雜交并進(jìn)行規(guī)?；敝?。與傳統(tǒng)育種相比，該方法具有迅速、穩(wěn)定、可靠的特點(diǎn)，實(shí)用性強(qiáng)、成本低、準(zhǔn)確性高、不受環(huán)境等因素的影響，可擺脫對(duì)表型性狀鑒定的依賴，縮短了育種年限，提高了育種效率，極具應(yīng)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】一種大鱗副泥鰍良種選育方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于魚類育種學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種大鱗副泥鰍良種選育方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 大鱗副泥鰍)屬鰍科、花鰍亞科、副泥鰍屬，是一種分 布于東南亞地區(qū)的小型淡水底棲魚類，國(guó)內(nèi)多分布于四川、浙江、臺(tái)灣、遼寧、黑龍江等地。 體近圓筒形，頭較短?？谙挛唬R蹄形，下唇中央有一小缺口。鼻孔靠近眼，眼下無(wú)刺，鰓孔 小。頭部無(wú)鱗，體鱗較泥鰍為大。須5對(duì)，其中吻須2對(duì)，口角須1對(duì)，頦須2對(duì)，各須均長(zhǎng)， 口角須后伸可達(dá)鰓蓋后緣。眼被皮膜覆蓋。尾柄處皮褶棱發(fā)達(dá)，與尾鰭相連。尾柄長(zhǎng)與高 約相等。尾鰭圓形。肛門近臀鰭起點(diǎn)。體背部及體側(cè)上半部灰褐色，腹面白色。體側(cè)具有 許多不規(guī)則的黑色褐色斑點(diǎn)。背鰭、尾鰭具黑色小點(diǎn)，其他各鰭灰白色。大鱗副泥鰍肉質(zhì)鮮 美，營(yíng)養(yǎng)豐富，富含鈣、維生素A、維生素D以及多種蛋白質(zhì)、氨基酸和礦物質(zhì)，素有"水中人 參"之美譽(yù)，具有較高的食用、藥用及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，已發(fā)展成為我國(guó)重要的養(yǎng)殖對(duì)象，也是我國(guó) 出口韓國(guó)的主要水產(chǎn)品之一。
[0003] 中國(guó)已成為全世界大鱗副泥鰍養(yǎng)殖規(guī)模最大的國(guó)家,江蘇省大鱗副泥鰍養(yǎng)殖規(guī)模 又占居了全國(guó)的70%以上。然而，目前用于大鱗副泥鰍養(yǎng)殖的魚種主要捕撈自天然水域，野 生苗種的質(zhì)量難以保證，生長(zhǎng)性能與養(yǎng)殖效果也極不穩(wěn)定。眾所周知，種質(zhì)是水產(chǎn)養(yǎng)殖的物 質(zhì)基礎(chǔ)，良種在我國(guó)水產(chǎn)業(yè)從捕撈為主的產(chǎn)業(yè)向以養(yǎng)殖為主的產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)變過(guò)程中起到的作 用不容小覷。傳統(tǒng)良種培育技術(shù)基本上分為兩類：遺傳操作和選擇操作，遺傳操作技術(shù)最為 成功的是雜交育種技術(shù)，選擇操作技術(shù)則主要有家系和群體選育。雜交選育面臨引入不良 性狀尚需多代回交的問(wèn)題；傳統(tǒng)選育要想建成目標(biāo)品種，至少需要經(jīng)過(guò)多代（4-5代）人工 選擇才能育成優(yōu)良品種(遺傳穩(wěn)定、在生物學(xué)、形態(tài)學(xué)和經(jīng)濟(jì)性狀基本一致的有一定數(shù)量的 群體)。傳統(tǒng)選擇操作的弊端在于對(duì)基因型富集的解釋和控制近親繁殖的方法尚處于經(jīng)驗(yàn) 階段，僅間接利用現(xiàn)代遺傳學(xué)理論，概念模糊，操作和理論間缺乏等價(jià)關(guān)系，以致育種過(guò)程 出現(xiàn)優(yōu)良品種雜合度低，有害基因通過(guò)純合而表現(xiàn)出來(lái)，雜合度和多態(tài)性下降，有綜合經(jīng)濟(jì) 性狀下降的隱患。
[0004] 隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)在水產(chǎn)遺傳育種上的應(yīng)用，多種分子標(biāo)記(如SSR/SNP 等)出現(xiàn)及應(yīng)用有效地解決了上述問(wèn)題。然而，國(guó)內(nèi)外目前尚未開(kāi)始大鱗副泥鰍的系統(tǒng)遺傳 選育工作，特別是分子標(biāo)記輔助選育，優(yōu)質(zhì)苗種的缺乏已嚴(yán)重制約了大鱗副泥鰍養(yǎng)殖業(yè)的 發(fā)展，因此亟待開(kāi)發(fā)出一種大鱗副泥鰍的良種選育方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種大鱗副泥鰍良種選育方法，從而可以 快速選育出質(zhì)量可靠、生長(zhǎng)性能與養(yǎng)殖效果穩(wěn)定的大鱗副泥鰍優(yōu)良品種，此項(xiàng)技術(shù)適用于 有較大規(guī)模的良種場(chǎng)或國(guó)家良種基地進(jìn)行大鱗副泥鰍的良種選育。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)： 一種大鱗副泥鰍良種選育方法，其包括以下步驟： 1) 提供12個(gè)與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，其各自對(duì)應(yīng)的引物如下所示： 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Pda48 的引物：L:5' -TGAGGCACITTGTTTACGCTC-3' ； R:5, -GCTCATGGGACACAAGATGG-3,； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Pda66 的引物：L:5' -TACCCTGTGCTAAGGAGGC-3' ； R:5' -AGAGGGAACGGCCAACAG-3,； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Pdal74 的引物：L:5' -GTCGGACCTGAAGAGGCAC-3' ； R:5' -TGCCGTCTGTCATCCATGC-3' ； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Pda242 的引物：L:5' -TGCCAGCAAITGACATAAAGGG-3' ； R:5' -GATTTCTCAAGCCCAGCGG-3' ； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Pda247 的引物：L:5' -ATAGTGCCCGITTCCTGCC-3' ； R:5' -TGGTGAAAGAGTGAAACAATTACC-3' ；微衛(wèi)星分子標(biāo)記Pda260 的引物：L: 5' -GCTCTGCTCCGAACATTCC-3' ； R:5' -CTTTCCGTCGCACCTTTCC-3' ； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Pda288 的引物：L:5' -AGGTGTGGITTCAGGITGC-3' ； R:5, -ACAGAGGAAACCGGTGAGG-3,； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Pda301 的引物：L:5' -CCTGTAGirGACCCAITTCGC-3' ； R:5' -AGAAGGGTGACTTGTCCAAAC-3' ； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Pda310 的引物：L:5' -GGGTCTCCACAGTGACGC-3' ； R:5, -CGCTGTCTGAGTGATCCCG-3,； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Pda315 的引物：L:5' -ACATCCTGCCTGAGGITCC-3' ； R:5, -TCTTAATGATGACGGCAGAGC-3,； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Pda316 的引物：L:5' -TGAGTGGCACGCTCCAAG-3' ； R:5, -CGAGGCCAAACTAACTGCG-3,； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記Pda371 的引物：L:5' -CTGGITTCAACGGTGGACG-3' ； R:5' -GTGCGTGTCCCTGAACTTG-3' ； 2) 選擇體型、體色正常，無(wú)病無(wú)傷的大鱗副泥鰍個(gè)體作為備選親本群體1，對(duì)備選親本 群體1中的所有個(gè)體進(jìn)行電子標(biāo)記，并提取DNA; 3) 采用Pda66、Pdal74、Pda242、Pda247、Pda260、Pda288、Pda310、Pda316、Pda371 對(duì)備 選親本群體1進(jìn)行基因型篩選，選取基因型為AA(對(duì)應(yīng)Pda66)、FF(對(duì)應(yīng)Pdal74)、EE(對(duì)應(yīng) Pda242)、NN(對(duì)應(yīng)Pda247)、CC(對(duì)應(yīng)Pda260)、CC或DD(對(duì)應(yīng)Pda288)、CC(對(duì)應(yīng)Pda310)、 BB或AA(對(duì)應(yīng)Pda316)、AA或BB(對(duì)應(yīng)Pda371)的個(gè)體作為備選親本群體2 ; 4) 采用Pda48、Pda301、Pda315對(duì)備選親本群體2進(jìn)行基因型篩選，獲得基因型分別為 AA或FF(對(duì)應(yīng)Pda48)、AA或BB(對(duì)應(yīng)Pda301)、BB或CC(對(duì)應(yīng)Pda315)的個(gè)體，將同一基 因位點(diǎn)具有相同基因型的個(gè)體進(jìn)行單獨(dú)培育，分別建立備選親本群體3和備選親本群體4 ; 5) 以備選親本群體3為繁殖群體，進(jìn)行人工繁殖一代獲得后備親本群體5 ;以備選親本 群體4為繁殖群體，進(jìn)行人工繁殖一代獲得后備親本群體6 ; 6) 按照親本群體5中的雌性個(gè)體X親本群體6中的雄性個(gè)體或親本群體5中的雄性 個(gè)體X親本群體6中的雌性個(gè)體的配對(duì)方式進(jìn)行規(guī)?；敝?，即可獲得大鱗副泥鰍良種， 完成選育過(guò)程。
[0007] 在實(shí)際生產(chǎn)操作中，當(dāng)步驟6)完成之后，可以重復(fù)步驟2)至步驟6)的操作，并監(jiān) 控選育系遺傳背景，防止近親交配。
[0008] 優(yōu)選的，在上述方案中，步驟1)中所述微衛(wèi)星分子標(biāo)記依下法獲得： a) 選取不同年齡及性別的大鱗副泥鰍，采集多種組織并提取RNA，等量移取并混合成 總RNA，分離出mRNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA文庫(kù)，PCR擴(kuò)增富集后回收目的片段，定量后采用第 二代高通量測(cè)序平臺(tái)（IlluminaHiseq2000平臺(tái)）進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序后采用序列組裝軟件 (Trinity軟件）組裝測(cè)序片段，得到轉(zhuǎn)錄本序列； b) 采用微衛(wèi)星分子標(biāo)記捕獲軟件(Msatco_ander軟件）掃描步驟a)中獲得的轉(zhuǎn)錄本 序列，篩選出核心序列長(zhǎng)度為10-360bp的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，對(duì)側(cè)翼序列長(zhǎng)度為50bp以上 的微衛(wèi)星分子標(biāo)記進(jìn)行引物設(shè)計(jì)； c) 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組GO功能注釋的結(jié)果，選取分類到生長(zhǎng)過(guò)程條目的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，加之 隨機(jī)選取的其他微衛(wèi)星分子標(biāo)記，共計(jì)合成微衛(wèi)星引物400對(duì)； d) 收集不同地域的大鱗副泥鰍野生群體，觀察并比較其形狀差異，選取差異最大的群 體進(jìn)行雜交，人工催產(chǎn)獲得全同胞家系群體； e) 隨機(jī)采用步驟b)中的微衛(wèi)星分子標(biāo)記對(duì)步驟d)中獲得的大鱗副泥鰍全同胞家系群 體中的個(gè)體進(jìn)行掃描，進(jìn)行微衛(wèi)星分子標(biāo)記與家系群體的生長(zhǎng)性狀之間的相關(guān)分析，篩選 出12個(gè)與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的微衛(wèi)星分子標(biāo)記。
[0009] 此外，本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)在上述大鱗副泥鰍良種選育方法中使用的12個(gè)微衛(wèi)星 分子標(biāo)記的引物。
[0010] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的大鱗副泥鰍良種選育方法具有如下有益效果：分子標(biāo) 記輔助育種（marker-assistantselection,簡(jiǎn)稱MAS)利用分子標(biāo)記從DNA水平上對(duì)育種 材料進(jìn)行選擇，從而加快進(jìn)程獲得具有目的性狀的后代。與傳統(tǒng)育種相比，MS方法具有迅 速、穩(wěn)定、可靠的特點(diǎn)，實(shí)用性強(qiáng)、成本低、準(zhǔn)確性高、不受環(huán)境等因素的影響，可擺脫對(duì)表型 性狀鑒定的依賴，在早世代進(jìn)行選擇，從而大大縮短育種年限(理論上經(jīng)過(guò)3代就可以選擇 出理想的優(yōu)質(zhì)種群)，提高育種效率，極具應(yīng)用價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1為從不同性別的大鱗副泥鰍體內(nèi)各組織中采集的RNA樣品的電泳圖。
[0012] 圖2為轉(zhuǎn)錄本序列長(zhǎng)度分布圖。
[0013] 圖3為轉(zhuǎn)錄組GO功能注釋(生物過(guò)程水平）結(jié)果示意圖。
[0014] 圖4為12個(gè)微衛(wèi)星分子標(biāo)記在大鱗副泥鰍群體中的部分電泳圖，其中每個(gè)泳道 代表一個(gè)大鱗副泥鰍個(gè)體，M代表DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，條帶由上到下依次為1000bp，700bp， 500bp，400bp，300bp，200bp和100bp，由圖可知12個(gè)分子標(biāo)記在群體中不同個(gè)體的帶型(基 因型）有明顯差異。

【具體實(shí)施方式】
[0015] 除非有相反陳述，下列用在說(shuō)明書和權(quán)利要求書中的術(shù)語(yǔ)具有下述含義。
[0016] "良種"是指與養(yǎng)殖業(yè)中正在使用的同物種的多數(shù)養(yǎng)殖群體相比，具有比較優(yōu)勢(shì)的 一個(gè)或多個(gè)經(jīng)濟(jì)性狀的品種，其中養(yǎng)殖魚類的經(jīng)濟(jì)性狀一般為生長(zhǎng)性、出肉率、抗逆性等。
[0017] "良種選育"是指通過(guò)直接或間接篩選方法對(duì)基礎(chǔ)群體的一個(gè)或多個(gè)優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性 狀進(jìn)行世代選擇以獲得良種的過(guò)程。
[0018] "微衛(wèi)星分子標(biāo)記（MicrosatelliteMolecularMarker，MMM)" 是指一種遺傳標(biāo) 記，又稱短串聯(lián)重復(fù)（ShortTandemRepeats，STR)或簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SimpleSequence R印eats，SSR)，是以1-6個(gè)堿基的序列串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，長(zhǎng)度一般在幾十到幾百個(gè) 喊基。
[0019] "高通量測(cè)序平臺(tái)"包括三種主流的第二代測(cè)序技術(shù)，分別為Roche/454焦磷酸測(cè) 序、Illumina/Solexa聚合酶合成測(cè)序和ABI/SOLiD連接酶測(cè)序技術(shù)，三種測(cè)序技術(shù)共有的 突出特征是單次運(yùn)行產(chǎn)出序列數(shù)據(jù)量大，故而又被通稱為"高通量測(cè)序技術(shù)"。
[0020] "轉(zhuǎn)錄組GO功能注釋"是基于基因本體（GeneOntology,G0)對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行的 基因功能注釋和分類方法，其包括生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組件三個(gè)分支，屬生物信息學(xué) 范疇。
[0021] "基因型"是指決定物種特定性狀的遺傳物質(zhì)(基因）表現(xiàn)形式，例如AA基因型代 表紅色花色性狀，BB基因型代表白色花色性狀，AB基因型代表粉色花色性狀。
[0022] "生長(zhǎng)性狀"是指與生長(zhǎng)相關(guān)的性狀，如體長(zhǎng)、體高等，其中"全長(zhǎng)"是指魚吻端到尾 鰭末端的長(zhǎng)度；"體長(zhǎng)"是指魚吻端到尾鰭基部或末端椎骨的長(zhǎng)度；"體高"是指魚體的最大 高度；"體重"是指魚體的質(zhì)量；"空殼重"是指去除內(nèi)臟團(tuán)后魚體的質(zhì)量。
[0023] "基因型與生長(zhǎng)性狀相關(guān)分析"是指利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析基因型與生長(zhǎng)性狀(如體 長(zhǎng)）有無(wú)相關(guān)性及相關(guān)性顯著程度。
[0024] "家系群體"是指用于遺傳圖譜繪制的試驗(yàn)群體，包括全同胞家系(來(lái)源于相同父 母親的群體）和半同胞家系（同父異母或同母異父的群體)。
[0025] "備選親本群體"是指用于選擇人工繁殖用雌、雄親魚的性成熟群體。
[0026] "后備親本群體"是指將來(lái)用于選擇人工繁殖用雌、雄親本的群體，群體內(nèi)個(gè)體不 一定性成熟。
[0027] "電子標(biāo)記"又稱為電子標(biāo)簽、射頻標(biāo)簽、應(yīng)答器、數(shù)據(jù)載體，是指利用有別于傳統(tǒng) 物理標(biāo)記的，基于電子芯片的，可以通過(guò)注射器注射的標(biāo)簽來(lái)標(biāo)記不同受試動(dòng)物的方法。
[0028] 較佳實(shí)施例：大鱗副泥鰍的良種選育。
[0029] 1、大鱗副泥鰍轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建： 選大鱗副泥鰍家系群體的親本為實(shí)驗(yàn)材料，雄鰍、雌鰍分別來(lái)自洞庭湖和洪澤湖。用 100mg/L的間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽（MS-222)進(jìn)行麻醉后，采集雌雄泥鰍的多種組織 (雌、雄魚的肌肉、骨骼、鰭條、腦、脾臟、肝胰臟及雌魚的卵)，按說(shuō)明書（D311A試劑，寶生物 工程(中國(guó)）有限公司）的要求置于RNA保存液中，凍存?zhèn)溆谩＞唧w操作如下： 采用TRIzof試劑（100ml，生命科學(xué)（中國(guó)）公司）提取上述各種組織的RNA(其電泳 圖如圖1所示，圖中每個(gè)泳道包含兩到三條帶，說(shuō)明RNA質(zhì)量較好，滿足測(cè)序要求)，質(zhì)量檢 測(cè)合格后等量移取各種RNA最終混合成5iig總RNA，用帶有oligo(dT)的磁珠分離出具 有PolyA尾的mRNA，離子法打斷mRNA，然后用6堿基隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄得到一鏈cDNA，加入 dNTPs、RNaseH和DNA聚合酶I合成二鏈cDNA。得到雙鏈cDNA之后通過(guò)T4連接酶末端補(bǔ)平 并且連接"A"堿基，最后連接index接頭。以上構(gòu)建文庫(kù)的試劑盒是Truseq?RNAsample prepKit。對(duì)得到的文庫(kù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增富集，然后用2%的瓊脂糖膠回收目的片段。用TBS380 對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定量，在Hiseq2000測(cè)序平臺(tái)上測(cè)序。測(cè)序后經(jīng)過(guò)去冗余和低質(zhì)量片段過(guò)濾后， 剩余39, 751，380條序列片段，加之大鱗副泥鰍兩個(gè)肌肉轉(zhuǎn)錄組序列樣本共計(jì)105, 308, 078 個(gè)片段（10. 47Gb)，采用Trinity軟件組裝測(cè)序片段，組裝后得到71，887個(gè)轉(zhuǎn)錄組序列，均 長(zhǎng)1464. 58bp，總長(zhǎng)度105, 284, 263bp，序列均長(zhǎng)1464. 58bp，其中大于IOOObp的序列有 34, 603 (48. 1%)條，適于微衛(wèi)星分子標(biāo)記的批量挖掘(具體數(shù)據(jù)參見(jiàn)圖2)。
[0030] 2、批量開(kāi)發(fā)大鱗副泥鰍微衛(wèi)星分子標(biāo)記： 采用Msatcommander軟件對(duì)所有轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行SSR篩選，參數(shù)設(shè)計(jì)為核心序列大于 12bp的，發(fā)現(xiàn)SSR位點(diǎn)有15106個(gè)，用Primer3. 0軟件對(duì)側(cè)翼序列>50bp的所有微衛(wèi)星分 子標(biāo)記進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，具體引物設(shè)計(jì)參數(shù)詳見(jiàn)表1。

【權(quán)利要求】
1. 一種大鱗副泥鰍良種選育方法，其包括以下步驟： 1) 提供12個(gè)微衛(wèi)星分子標(biāo)記，其各自對(duì)應(yīng)的引物如下所示： 微衛(wèi)星分子標(biāo)記 Pda48 的引物：L :5' -TGAGGCACITTGTTTACGCTC-3' ； R:5, -GCTCATGGGACACAAGATGG-3,； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記 Pda66 的引物：L :5' -TACCCTGTGCTAAGGAGGC-3' ； R :5' -AGAGGGAACGGCCAACAG-3,； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記 Pdal74 的引物：L :5' -GTCGGACCTGAAGAGGCAC-3' ； R:5' -TGCCGTCTGTCATCCATGC-3' ； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記 Pda242 的引物：L :5' -TGCCAGCAAITGACATAAAGGG-3' ； R:5' -GATTTCTCAAGCCCAGCGG-3' ； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記 Pda247 的引物：L :5' -ATAGTGCCCGITTCCTGCC-3' ； R :5' -TGGTGAAAGAGTGAAACAATTACC-3' ；微衛(wèi)星分子標(biāo)記 Pda260 的引物：L : 5' -GCTCTGCTCCGAACATTCC-3' ； R:5' -CTTTCCGTCGCACCTTTCC-3' ； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記 Pda288 的引物：L :5' -AGGTGTGGITTCAGGITGC-3' ； R :5, -ACAGAGGAAACCGGTGAGG-3,； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記 Pda301 的引物：L :5' -CCTGTAGirGACCCAITTCGC-3' ； R：5, -AGAAGGGTGACTTGTCCAAAC-3,； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記 Pda310 的引物：L :5' -GGGTCTCCACAGTGACGC-3' ； R:5, -CGCTGTCTGAGTGATCCCG-3,； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記 Pda315 的引物：L :5' -ACATCCTGCCTGAGGITCC-3' ； R:5, -TCTTAATGATGACGGCAGAGC-3,； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記 Pda316 的引物：L :5' -TGAGTGGCACGCTCCAAG-3' ； R:5, -CGAGGCCAAACTAACTGCG-3,； 微衛(wèi)星分子標(biāo)記 Pda371 的引物：L :5' -CTGGITTCAACGGTGGACG-3' ； R:5' -GTGCGTGTCCCTGAACTTG-3' ； 2) 選擇體型、體色正常，無(wú)病無(wú)傷的大鱗副泥鰍個(gè)體作為備選親本群體1，對(duì)備選親本 群體1中的所有個(gè)體進(jìn)行電子標(biāo)記，并提取DNA ; 3) 采用 Pda66、Pdal74、Pda242、Pda247、Pda260、Pda288、Pda310、Pda316、Pda371 對(duì)備 選親本群體1進(jìn)行基因型篩選，選取基因型為Pda66對(duì)應(yīng)的AA、Pdal74對(duì)應(yīng)的FF、Pda242 對(duì)應(yīng)的EE、Pda247對(duì)應(yīng)的NN、Pda260對(duì)應(yīng)的CC、Pda288對(duì)應(yīng)的CC或DD、Pda310對(duì)應(yīng)的 CC、Pda316對(duì)應(yīng)的BB或AA、Pda371對(duì)應(yīng)的AA或BB的個(gè)體作為備選親本群體2 ; 4) 采用Pda48、Pda301、Pda315對(duì)備選親本群體2進(jìn)行基因型篩選，獲得基因型分別為 Pda48對(duì)應(yīng)的AA或FF、Pda301對(duì)應(yīng)的AA或BB、Pda315對(duì)應(yīng)的BB或CC的個(gè)體，將同一基 因位點(diǎn)具有相同基因型的個(gè)體進(jìn)行單獨(dú)培育，分別建立備選親本群體3和備選親本群體4 ; 5) 以備選親本群體3為繁殖群體，進(jìn)行人工繁殖一代獲得后備親本群體5 ;以備選親本 群體4為繁殖群體，進(jìn)行人工繁殖一代獲得后備親本群體6 ; 6) 按照親本群體5中的雌性個(gè)體X親本群體6中的雄性個(gè)體或親本群體5中的雄性 個(gè)體X親本群體6中的雌性個(gè)體的配對(duì)方式進(jìn)行規(guī)?；敝?，即可獲得大鱗副泥鰍良種， 完成選育過(guò)程。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大鱗副泥鰍良種選育方法，其特征在于，在步驟6)完成之后 重復(fù)步驟2)至步驟6)的操作。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的大鱗副泥鰍良種選育方法，其特征在于，步驟1)中所述微衛(wèi) 星分子標(biāo)記依下法獲得： a) 選取不同年齡及性別的大鱗副泥鰍，采集多種組織并提取RNA，等量移取并混合成 總RNA，分離出mRNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA文庫(kù)，PCR擴(kuò)增富集后回收目的片段，定量后采用 Illumina Hiseq 2000平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序后采用Trinity軟件組裝測(cè)序片段，得到轉(zhuǎn)錄本 序列； b) 采用Msatcommander軟件掃描步驟a)中獲得的轉(zhuǎn)錄本序列，篩選出核心序列長(zhǎng)度 為10-360 bp的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，對(duì)側(cè)翼序列長(zhǎng)度為50 bp以上的微衛(wèi)星分子標(biāo)記進(jìn)行引 物設(shè)計(jì)； c) 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組GO功能注釋的結(jié)果，選取分類到生長(zhǎng)過(guò)程條目的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，加之 隨機(jī)選取的其他微衛(wèi)星分子標(biāo)記，共計(jì)合成微衛(wèi)星引物400對(duì)； d) 收集不同地域的大鱗副泥鰍野生群體，觀察并比較其形狀差異，選取差異最大的群 體進(jìn)行雜交，人工催產(chǎn)獲得全同胞家系群體； e) 隨機(jī)采用步驟b)中的微衛(wèi)星分子標(biāo)記對(duì)步驟d)中獲得的大鱗副泥鰍全同胞家系群 體中的個(gè)體進(jìn)行掃描，進(jìn)行微衛(wèi)星分子標(biāo)記與家系群體的生長(zhǎng)性狀之間的相關(guān)分析，篩選 出12個(gè)與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的微衛(wèi)星分子標(biāo)記。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的大鱗副泥鰍良種選育方法中使用的12個(gè)微衛(wèi) 星分子標(biāo)記的引物。
【文檔編號(hào)】A01K61/00GK104351096SQ201410606181
【公開(kāi)日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月30日
【發(fā)明者】凌去非, 李彩娟 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)