一種提高秋水仙素誘導(dǎo)三倍體紫錐菊染色體加倍效率的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于作物生物技術(shù)和遺傳育種【技術(shù)領(lǐng)域】，具體公開了一種提高秋水仙素誘導(dǎo)三倍體紫錐菊染色體加倍效率的方法。即將三倍體紫錐菊根外植體轉(zhuǎn)移至含有120mg/L秋水仙素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)18～25d。由本發(fā)明所述根作為外植體成功獲得六倍體紫錐菊的比例達(dá)到64.71%，與現(xiàn)有技術(shù)中所獲得的紫錐菊加倍的成功率相比，至少提高了41.21%，本發(fā)明有效地克服了三倍體紫錐菊染色體加倍效果差，難以獲得六倍體株系的問題。
【專利說明】一種提高秋水仙素誘導(dǎo)三倍體紫錐菊染色體加倍效率的方 法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及作物生物技術(shù)和遺傳育種【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地，涉及一種提高秋水仙 素誘導(dǎo)三倍體紫錐菊染色體加倍效率的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 紫錐菊)為菊科多年生草本植物，是原產(chǎn)于美洲的一種野生 花卉，因其具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用已廣泛應(yīng)用于營養(yǎng)補(bǔ)充劑和保健食品。由于紫錐菊的 有效成分主要存在于根部，為提高根部產(chǎn)量，進(jìn)一步改善品質(zhì)，提高有效成分含量，增強(qiáng)其 抗病性，圍繞其展開的倍性育種研究發(fā)展迅猛，現(xiàn)有技術(shù)中已有利用紫錐菊葉柄外植體成 功培育出四倍體、八倍體的研究，但其誘導(dǎo)成功率較低。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中利用紫錐菊葉柄外植體誘導(dǎo)多倍 體誘導(dǎo)成功率低的缺陷，提供一種提高秋水仙素誘導(dǎo)三倍體紫錐菊染色體加倍效率的方 法。
[0004] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種秋水仙素處理三倍體紫錐菊加倍獲得六倍體的 方法。
[0005] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)： 一種提高秋水仙素誘導(dǎo)三倍體紫錐菊染色體加倍效率的方法，即將三倍體紫錐菊根外 植體轉(zhuǎn)移至含有120mg/L秋水仙素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)18?25 d，染色體數(shù)目由三組加倍到六 組。
[0006] 秋水仙素是一種生物堿，它能夠抑制有絲分裂，秋水仙素處理后的細(xì)胞，其染色體 雖然縱裂，但細(xì)胞并不分裂，不能形成兩個細(xì)胞，因此可以使細(xì)胞染色體加倍，秋水仙素經(jīng) 常被用來作為植物多倍體誘導(dǎo)的物質(zhì)，但因植物種類不同，針對不同的植物，其用秋水仙素 處理的條件顯著不同，需要研究者進(jìn)行多次實驗和分析。
[0007] 申請人:已在前期的研究中實現(xiàn)了利用秋水仙素處理紫錐菊葉柄外植體獲得四倍 體和八倍體，但其成功誘導(dǎo)率較低，本發(fā)明是將紫錐菊的根作為外植體進(jìn)行染色體加倍，其 紫錐菊染色體數(shù)目由三組加倍到六組的成功率高。
[0008] 優(yōu)選地，上述方法中，在將三倍體紫錐菊根外植體轉(zhuǎn)移至含有秋水仙素的培養(yǎng)基 中進(jìn)行培養(yǎng)之前，對三倍體紫錐菊根外植體進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)；所述預(yù)處理的步驟為將根外植體 轉(zhuǎn)移到含有BA 0.4 mg/L、NAA 0.01 mg/L、蔗糖30 g/L、瓊脂4.5 g/L的MS培養(yǎng)基上，在 23?27°C、冷白光光照密度600?1300 lx、光照周期12 h/d條件下培養(yǎng)。
[0009] 預(yù)培養(yǎng)的目的是啟動細(xì)胞分裂活動，提高外植體活力，減少外植體在之后的秋水 仙素處理階段被毒害、再生活力下降的幾率。預(yù)培養(yǎng)的時間如果偏長，就可能在預(yù)培養(yǎng)階段 產(chǎn)生不定芽。這不是我們希望的結(jié)果，因為這個階段產(chǎn)生的再生芽肯定是沒有加倍的芽，會 降低最后的加倍成功率。紫錐菊預(yù)培養(yǎng)過程中，狀態(tài)好的某些外植體，最早在第9天就有可 能看到再生芽點（這些芽點由于還沒有被秋水仙素處理，肯定就是沒有加倍的）。所以預(yù)培 養(yǎng)天數(shù)絕不能超過9天,優(yōu)選地,所述預(yù)培養(yǎng)的天數(shù)為4?6 d。
[0010] -種秋水仙素處理三倍體紫錐菊加倍獲得六倍體的方法，將如上所述方法獲得的 秋水仙素處理后的根外植體轉(zhuǎn)移至含0.7?1.4 mg/L BA的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽的再 生，不定芽再生后誘導(dǎo)不定芽生根，根據(jù)倍性鑒定獲得染色體成功加倍后的六倍體。具體 地，上述秋水仙素處理三倍體紫錐菊加倍獲得六倍體的方法包括以下步驟： 51. 選取生長良好的三倍體紫錐菊植株，截取植株的根作為外植體進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)； 52. 將預(yù)培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)移至含有120mg/L秋水仙素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)18?25 d ; 53. 將秋水仙素處理后的外植體轉(zhuǎn)移至含0.7?1.4 mg/L BA的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行不定 芽的再生；不定芽再生后誘導(dǎo)不定芽生根，根據(jù)倍性鑒定獲得染色體成功加倍后的六倍體。
[0011] 優(yōu)選地，Sl中外植體預(yù)培養(yǎng)的時間為4?6d。
[0012] 優(yōu)選地，S2所述培養(yǎng)天數(shù)為25 d。
[0013] 優(yōu)選地，S3所述BA的濃度為0· 7 mg/L。
[0014] 優(yōu)選地，S3所述不定芽在含BA的MS培養(yǎng)基上生長的天數(shù)大于50 d。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明提供了一種提高秋水仙素誘導(dǎo)三倍體紫錐菊染色體加倍效率的方法，即將三倍 體紫錐菊根外植體轉(zhuǎn)移至含有120mg/L秋水仙素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)18?25 d。由本發(fā)明所 述根作為外植體成功獲得六倍體的比例達(dá)到64. 71%，與現(xiàn)有技術(shù)中所獲得的紫錐菊加倍的 成功率相比，至少提高了 41. 21%，本發(fā)明有效地克服了三倍體紫錐菊染色體加倍效果差，難 以獲得六倍體株系的問題。

【具體實施方式】
[0016] 下面通過實施例對本發(fā)明進(jìn)一步具體描述。本發(fā)明的設(shè)計思想或同類物質(zhì)的簡 單替代屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。下述所使用的實驗方法若無特殊說明，均為本【技術(shù)領(lǐng)域】現(xiàn) 有常規(guī)的方法，所使用的配料或材料，如無特殊說明，均為通過商業(yè)途徑可得到的配料或材 料。
[0017] 本發(fā)明所采用染色體加倍的方法參考Nilanthi (2009)，基本流程為：取材一預(yù)培 養(yǎng)一不同類型外植體(葉、葉柄、根)進(jìn)行加倍處理不同天數(shù)（18天，25天）一MS培養(yǎng)基中添 加不同濃度（〇. 3、0. 7、I. 4 mg/L) BA進(jìn)行誘導(dǎo)不定芽再生一培養(yǎng)培養(yǎng)不同天數(shù)（?210天） -誘導(dǎo)不定根一倍性鑒定。倍性鑒定方法為根尖染色體壓片后鏡檢(卡寶品紅染色)。
[0018] 本發(fā)明所述含有秋水仙素的培養(yǎng)基為秋水仙素120 mg/L、BA 0. 4 mg/L、NAA 0. 01 mg/L、蔗糖30 g/L、瓊脂4.5 g/L的MS培養(yǎng)基。
[0019] 數(shù)據(jù)格式與處理：數(shù)據(jù)的分析采用美國IBM公司的SPSS (Statistical Product and Service Solutions)19.0軟件進(jìn)行，實驗處理各項平均數(shù)后列出的誤差項為各平均數(shù) 的標(biāo)準(zhǔn)誤差。各處理的平均數(shù)間差異顯著性分析：使用鄧肯式多重范圍比較（Duncan's New Multiple Range Test)進(jìn)行三組或以上數(shù)據(jù)的差異顯著性分析；用T檢驗進(jìn)行兩組數(shù)據(jù)的 差異顯著性分析。
[0020] 實施例1秋水仙素對不同類型外植體存活狀態(tài)的影響 本發(fā)明所用的紫錐菊的二倍體種子購自美國馬薩諸塞州諾頓的Plantation Products 園藝公司；四倍體通過 申請人:已有的方法對二倍體紫錐菊進(jìn)行秋水仙素處理使其染色體加 倍獲得（Nilanthi，2009);三倍體通過將二倍體和四倍體進(jìn)行雜交并栽培種子獲得。
[0021] 對獲得的三倍體紫錐菊分別取葉片、葉柄和根外植體在含有120 mg/L秋水仙素的 培養(yǎng)基中處理18 d后，轉(zhuǎn)移到含有BA 0.4 mg/L，NAA 0.01 mg/L，蔗糖30 g/L，瓊脂4.5 g/ L的MS再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)，22 d后統(tǒng)計外植體存活率。從表1可知，不同類型的三倍體外 植體對于120 mg/L秋水仙素處理后的培養(yǎng)反應(yīng)差異顯著，其中葉柄和根外植體均100%存 活，但葉片外植體只有77. 0%存活，其余的葉片外植體黃化死亡。

【權(quán)利要求】
1. 一種提高秋水仙素誘導(dǎo)三倍體紫錐菊染色體加倍效率的方法，其特征在于，將三倍 體紫錐菊根外植體轉(zhuǎn)移至含有120mg/L秋水仙素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)18?25 d，染色體數(shù)目由 三組加倍到六組。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述提高秋水仙素誘導(dǎo)三倍體紫錐菊染色體加倍效率的方法，其 特征在于，在將三倍體紫錐菊根外植體轉(zhuǎn)移至含有秋水仙素的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)之前，對 三倍體紫錐菊根外植體進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述提高秋水仙素誘導(dǎo)二倍體紫錐菊染色體加倍效率的方法，其 特征在于，所述預(yù)培養(yǎng)的天數(shù)為4?6 d。
4. 一種秋水仙素處理三倍體紫錐菊加倍獲得六倍體的方法，其特征在于，將權(quán)利要求 1至3任一項所述方法獲得的秋水仙素處理后的根外植體轉(zhuǎn)移至含0. 7?1. 4 mg/L BA的 MS培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽的再生，不定芽再生后誘導(dǎo)不定芽生根，根據(jù)倍性鑒定獲得染色體 成功加倍后的六倍體。
【文檔編號】A01H4/00GK104365481SQ201410639185
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月13日
【發(fā)明者】楊躍生, 陳曉鷺, 陳榮, 吳鴻, 李棟梁, 劉穎 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)