一種秋水仙素誘導(dǎo)楸葉泡桐同源四倍體的培育方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于林木生物技術(shù)育種領(lǐng)域，尤其涉及一種秋水仙素誘導(dǎo)楸葉泡桐同源四 倍體的培育方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 泡桐)為玄參科泡桐屬植物，落葉喬木，現(xiàn)有9個(gè)種，2個(gè)變種，在我國 25個(gè)省(市)、自治區(qū)均有分布，是我國重要的速生用材林、防護(hù)林和平原綠化的主選樹種， 在改善生態(tài)環(huán)境和提高農(nóng)民收入等方面起著重要作用。但泡桐生產(chǎn)中還存在著大冠低干和 叢枝病嚴(yán)重等問題，由于泡桐種質(zhì)資源少，遺傳資源匱乏、滿足國民經(jīng)濟(jì)建設(shè)要求的泡桐新 品種嚴(yán)重不足，影響了農(nóng)民種植泡桐的積極性，極大阻礙了泡桐產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。種種事實(shí)表 明，利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段培育多倍體是解決目前泡桐新品種不足的有效途徑。
[0003] 多倍體植株具有生物量大，抗逆能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。隨著組織培養(yǎng)和分子生物學(xué)的飛 速發(fā)展，國內(nèi)外科技人員經(jīng)過長期不懈的努力，已誘導(dǎo)出多個(gè)林木的多倍體，如楊樹等樹種 培育成了林木新品種在生產(chǎn)中得以推廣應(yīng)用。對泡桐來說，二十世紀(jì)四十年代，日本學(xué)者利 用秋水仙素處理毛泡桐種子多倍體的研究工作，但沒有變異植株保存下來。二十世紀(jì)九十 年代，范國強(qiáng)等利用化學(xué)誘變結(jié)合組織培養(yǎng)技術(shù)分別對蘭考泡桐、白花泡桐、南方泡桐、豫 雜一號泡桐和毛泡桐等進(jìn)行了四倍體誘導(dǎo)，創(chuàng)制了其新種質(zhì)，經(jīng)過大量地繁育和區(qū)試工作， 已獲得'毛四桐1號'、'蘭四桐1號'、'白四桐1號'、'南四桐1號'和'雜四桐1號'五個(gè) 國家植物新品種權(quán)，并且在林業(yè)生產(chǎn)中推廣應(yīng)用，產(chǎn)生了顯著的經(jīng)濟(jì)、社會和生態(tài)效益。但 由于楸葉泡桐葉片細(xì)胞內(nèi)含物的種類和數(shù)量與其他泡桐存在一定差異，至今未見國內(nèi)外有 關(guān)四倍體楸葉泡桐成功誘導(dǎo)的報(bào)道。楸葉泡桐是泡桐屬中材質(zhì)較好的一種，利用秋水仙素 結(jié)合組織培養(yǎng)方法培育其四倍體，不僅對提高楸葉泡桐的生長速度，增強(qiáng)其抗逆性，克服目 前楸葉泡桐生產(chǎn)中存在的問題具有重要的實(shí)際意義，而且對擴(kuò)大泡桐的遺傳背景、豐富其 種質(zhì)資源也有一定的理論意義。此外，四倍體楸葉泡桐也是培育其三倍體的重要遺傳材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對目前泡桐研究和生產(chǎn)中存在的問題，提供一種操作簡單、方便高效、成 本低，誘導(dǎo)率高的楸葉泡桐同源四倍體的培育方法。
[0005] 本發(fā)明采用以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的： 一種秋水仙素誘導(dǎo)楸葉泡桐同源四倍體的培育方法，該方法包括以下步驟：（1)葉片 預(yù)處理；（2)秋水仙素誘導(dǎo)處理；（3)芽誘導(dǎo)；（4)根誘導(dǎo)；（5)楸葉泡桐變異植株鑒定；（6) 四倍體楸葉泡桐幼苗的移栽。
[0006] 該方法具體步驟如下： (1)葉片預(yù)處理取楸葉泡桐靠近莖尖處的2~4對葉，將葉片剪成1. 0 X 1.0 cm2的 方形小塊，無菌條件下將其置于MS+0. 3 mg/LNAA+14 mg/L BA的固體培養(yǎng)基中，在溫度為 20±2°C的人工氣候箱內(nèi)黑暗條件下處理4~8d ; (2) 秋水仙素誘導(dǎo)處理無菌條件下將經(jīng)過步驟（1)預(yù)處理后的楸葉泡桐葉片置于含 15~45 mg/L秋水仙素和1%~5%二甲基亞砜的液體培養(yǎng)基中，然后將盛有液體培養(yǎng)基的培養(yǎng) 瓶置于振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，25 ± 2°C、黑暗條件下誘導(dǎo)處理24~52 h ; (3) 芽的誘導(dǎo)無菌條件下取出步驟（2)誘導(dǎo)處理過的楸葉泡桐葉片，用無菌水沖 洗:Γ5次，而后將其放置到步驟（1)中的MS固體培養(yǎng)基上，在溫度為25±2°C、光照強(qiáng)度 1300Lx、光照時(shí)間16 h/d的培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行芽的誘導(dǎo)，30d時(shí)統(tǒng)計(jì)其誘導(dǎo)率
(4) 根的誘導(dǎo)經(jīng)步驟（3)誘導(dǎo)出的芽長到1~3 cm時(shí)，無菌條件下將幼芽從靠近培養(yǎng) 基基部剪下，放入NAA濃度為(TO. 3 mg/L的1/2 MS生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)ΚΓ30 d，觀察其生 根率
(5) 楸葉泡桐變異植株鑒定取秋水仙素誘導(dǎo)變異植株長約2~3cm的芽在生根培養(yǎng)基 中繼代3~5次，待最后一次繼代幼芽根長至I. 0-3. 0 cm時(shí)，首先通過比較與未處理葉片誘 導(dǎo)幼苗的形態(tài)差異，初步篩選出變異植株，再用染色體計(jì)數(shù)法或流式細(xì)胞儀測定單細(xì)胞DNA 含量法對變異植株進(jìn)行倍性鑒定； (6) 四倍體楸葉泡桐幼苗的移栽挑選出生長健壯、長勢齊整，根系生長良好，根系在3 cm以上的組培苗，然后煉苗移栽。
[0007] 所述固體培養(yǎng)基中蔗糖濃度為20g/L，瓊脂粉濃度為3. 0 g/L。
[0008] 步驟（2)中振蕩培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)速為50~120 rpm。
[0009] 組培苗在移栽前，先在常溫下閉瓶煉苗3 d，再去掉瓶塞煉苗7 d，然后取出組培 苗，用清水洗去沾在根系上的培養(yǎng)基，之后在1%多菌靈溶液中浸泡I min，選擇少風(fēng)的陰雨 天移栽，將幼苗移栽到用1% KMnO4消毒處理過的泥炭土和珍珠巖以3:1混合的基質(zhì)中，21d 后，將幼苗栽植到營養(yǎng)盆中。
[0010] 采用上述技術(shù)方案的本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明針對泡桐屬中楸葉泡桐目前國 內(nèi)外還沒有誘導(dǎo)出四倍體楸葉泡桐的問題，以楸葉泡桐為材料，通過用秋水仙素和二甲基 亞砜培養(yǎng)液浸泡、振蕩培養(yǎng)其外植體，成功獲得了楸葉泡桐的四倍體植株。與現(xiàn)有的毛泡 桐、白花泡桐、蘭考泡桐、豫雜一號泡桐和南方泡桐四倍體誘導(dǎo)相比，該方法操作方便、四倍 體泡桐誘導(dǎo)率高。與以泡桐花蕾胎座為誘導(dǎo)材料誘導(dǎo)出的愈傷組織進(jìn)行秋水仙素處理獲得 四倍體植株相比，本發(fā)明中的方法取材容易、廣泛，不受季節(jié)限制，并且四倍體泡桐誘導(dǎo)率 高；與以蘭考泡桐、白花泡桐、南方泡桐、豫雜一號泡桐和毛泡桐葉片為誘導(dǎo)材料，采用秋水 仙素固液雙層培養(yǎng)獲得四倍體植株的方法相比，該方法克服了固液雙層培養(yǎng)繁瑣的問題， 節(jié)省了誘導(dǎo)四倍體楸葉泡桐的時(shí)間和成本、提高了誘導(dǎo)效率?？傊景l(fā)明采用的四倍體泡 桐誘導(dǎo)方法，具有取材廣泛，操作簡單、方便，成本低，誘導(dǎo)率高等優(yōu)點(diǎn)，對不易獲得四倍體 的木本植物具有一定的指導(dǎo)意義。
【具體實(shí)施方式】 [0011] 實(shí)施例1 本發(fā)明公開的一種秋水仙素誘導(dǎo)楸葉泡桐同源四倍體的培育方法是通過如下步驟實(shí) 現(xiàn)的：（1)葉片預(yù)處理；（2)秋水仙素誘導(dǎo)處理；（3)芽誘導(dǎo)；（4)根誘導(dǎo)；（5)楸葉泡桐變 異植株鑒定；（6)四倍體楸葉泡桐幼苗的移栽。
[0012] 所述楸葉泡桐同源四倍體的培育方法具體步驟如下： (1) 葉片預(yù)處理取楸葉泡桐靠近莖尖處的2~4對葉，將葉片剪成1. 0 X 1.0 cm2的 方形小塊，無菌條件下將其置于MS+0. 3 mg/LNAA+14 mg/L BA的固體培養(yǎng)基中，在溫度為 20 ± 2°C的人工氣候箱內(nèi)黑暗條件下處理4~8d ;所述MS固體培養(yǎng)基中蔗糖濃度為20g/L，瓊 脂粉濃度為3. 0 g/L ; (2) 秋水仙素誘導(dǎo)處理無菌條件下將經(jīng)過步驟（1)預(yù)處理后的楸葉泡桐葉片置于含 15~45 mg/L秋水仙素和1%~5%二甲基亞砜的液體培養(yǎng)基中，然后將盛有液體培養(yǎng)基的培養(yǎng) 瓶置于5(T120 rpm振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，25±2°C、黑暗條件下誘導(dǎo)處理24~52 h; (3) 芽的誘導(dǎo)無菌條件下取出步驟（2)誘導(dǎo)處理過的楸葉泡桐葉片，用無菌水沖 洗:Γ5次，而后將其放置到步驟（1)中的MS固體培養(yǎng)基上，在溫度為25±2°C、光照強(qiáng)度 1300Lx、光照時(shí)間16 h/d的培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行芽的誘導(dǎo)，30d時(shí)統(tǒng)計(jì)其誘導(dǎo)率
(4) 根的誘導(dǎo)經(jīng)步驟（3)誘導(dǎo)出的芽長到1~3 cm時(shí)，無菌條件下將幼芽從靠近培養(yǎng) 基基部剪下，放入NAA濃度為(TO. 3 mg/L的1/2 MS生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)ΚΓ30 d，觀察其生 根率
(5) 楸葉泡桐變異植株鑒定取秋水仙素誘導(dǎo)變異植株長約2~3cm的芽在生根培養(yǎng)基 中繼代3~5次，待最后一次繼代幼芽根長至I. 0-3. 0 cm時(shí)，首先通過比較與未處理葉片誘 導(dǎo)幼苗的形態(tài)差異，初步篩選出變異植株，再用染色體計(jì)數(shù)法或流式細(xì)胞儀測定單細(xì)胞DNA 含量法對變異植株進(jìn)行倍性鑒定，楸葉泡桐四倍體誘變率4. 2%~1