一種能促進羅非魚生長激素表達的多肽pp2及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于多肽功能研究【技術領域】，具體公開了一種能促進羅非魚生長激素表達的多肽PP2及其應用，多肽PP2的氨基酸序列為PVKPENPGEDAPAEELAK。采用該多肽PP2的溶解液腹腔注射羅非魚，結果顯示PP2能夠顯著促進羅非魚腦垂體中生長激素的表達水平，具有生理活性。利用本發(fā)明的多肽PP2可以制備用以提高垂體GH mRNA表達的口服制劑或制備魚苗苗種促生長劑或添加劑。
【專利說明】一種能促進羅非魚生長激素表達的多肽PP2及其應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于多肽功能研究【技術領域】，具體涉及一種能促進羅非魚生長激素表達的多肽PP2及其應用，所述應用具體為多肽在促進羅非魚幼魚生長中的應用。

【背景技術】
[0002]羅非魚俗稱福壽魚，屬麗魚科(Cichlidae),羅非魚屬(Oreochromis)。羅非魚具有食性雜、耐低氧、繁殖力強等特點，目前已成為世界水產業(yè)重要的養(yǎng)殖魚類，被譽為未來動物性蛋白質的主要來源之一。
[0003]羅非魚在國際市場的需求量不斷增加，在全球魚類貿易中，羅非魚占第3位，僅次于鮭魚和鱒魚，具有極高的經濟價值。隨著養(yǎng)殖和出口規(guī)模的不斷擴大，對餌料配置的要求也不斷提高，由于飼料成本不斷增加，研究趨向于以植物蛋白代替魚粉來減少成本。但是魚類攝入植物蛋白飼料，會出現攝食量減少、體重減輕的現象。因此，近年來在羅非魚產業(yè)界的一個重要研究課題就是，如何采用分子生物學手段，深入研究羅非魚攝食、消化與營養(yǎng)吸收和生長的調控機制，根據研究的結果，研究開發(fā)生物功能性產品如多肽等，并進一步作為飼料添加劑產品應用于羅非魚養(yǎng)殖。這種產品對于促進羅非魚攝食，提高消化吸收效率，增強魚肉品質，調節(jié)生長速率，從而取得更大的經濟效益有著重要的意義。


【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是為了解決投喂羅非魚植物蛋白飼料時，會出現攝食量減少、體重減輕的問題，提供一種能促進羅非魚生長激素表達，從而促進羅非魚生長的多肽。
[0005]本發(fā)明的另一個目的是提供一種生物活性多肽產品在羅非魚養(yǎng)殖中的應用。
[0006]為了實現上述目的，本發(fā)明是通過以下方案予以實現的:
本發(fā)明的通過分析羅非魚消化系統(tǒng)中消化產物組分，對其中重要的多肽片段組分的生理功能進行研究，首次發(fā)現了一種可以促進羅非魚生長激素表達的多肽PP2，該多肽的氨基酸序列為 PVKPENPGEDAPAEELAK。
[0007]通過生物合成的方法可以制備大量的多肽產品，將多肽作為羅非魚魚苗的飼料添加劑去喂養(yǎng)羅非魚，從而研究多肽PP2的生物學功能，結果發(fā)現:多肽PP2可以顯著促進羅非魚生長激素表達，從而促進羅非魚的生長。
[0008]因此，本發(fā)明要求保護多肽PP2在制備提高羅非魚垂體GH mRNA表達制劑中的應用，以及多肽PP2在制備魚苗苗種促生長劑或添加劑中的應用。
[0009]與現有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明的通過分析羅非魚消化系統(tǒng)中消化產物組分，對其中重要的多肽片段組分的生理功能進行研究，首次發(fā)現了一種可以促進羅非魚生長激素表達的多肽PP2，將該多肽作為羅非魚幼苗的飼料添加劑，可以顯著促進羅非魚的生長，在羅非魚的養(yǎng)殖中具有很好的應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1是羅非魚神消化道酶解產物的總離子流圖。
[0011]圖2是酶解片段PP2的質譜圖。
[0012]圖3是腹腔注射陽性對照蛋白后2h三種劑量對羅非魚垂體GH mRNA表達的影響；其中表示與對照組相比有顯著性差異，P < 0.05 ;NC代表陰性對照；P_L代表陽性對照蛋白低劑量組；P-M代表陽性對照蛋白中劑量組；P-H代表陽性對照蛋白高劑量組。
[0013]圖4是腹腔注射陽性對照蛋白后6h三種劑量對羅非魚垂體GH mRNA表達的影響；其中表示與對照組相比有顯著性差異，P < 0.05 ;NC代表陰性對照；P_L代表陽性對照蛋白低劑量組；P-M代表陽性對照蛋白中劑量組；P-H代表陽性對照蛋白高劑量組。
[0014]圖5是腹腔注射酶解片段PP2后2h三種劑量對羅非魚垂體GH mRNA表達的影響；其中表示與對照組相比有顯著性差異，P < 0.05 ；NC代表陰性對照；Y3-L代表PP2多肽低劑量組；Y3-M代表PP2多肽中劑量組；Y3-H代表PP2多肽高劑量組。
[0015]圖6是腹腔注射酶解片段PP2后6h三種劑量對羅非魚垂體GH mRNA表達的影響；其中表示與對照組相比有顯著性差異，P < 0.05 ；NC代表陰性對照；Y3-L代表PP2多肽低劑量組；Y3-M代表PP2多肽中劑量組；Y3-H代表PP2多肽高劑量組。
[0016]圖7是腹腔注射陽性對照蛋白后2h三種劑量對羅非魚垂體GH mRNA表達的影響；其中表示與對照組相比有顯著性差異，P < 0.05 ;NC代表陰性對照；P_L代表陽性對照蛋白低劑量組；P-M代表陽性對照蛋白中劑量組；P-H代表陽性對照蛋白高劑量組。
[0017]圖8是腹腔注射多肽PP2后a三種劑量對羅非魚垂體GH mRNA表達的影響；其中表示與對照組相比有顯著性差異，P < 0.05 ；NC代表陰性對照；Y3-L代表PP2多肽低劑量組；Y3-M代表PP2多肽中劑量組；Y3-H代表PP2多肽高劑量組。

【具體實施方式】
[0018]下面結合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明的保護范圍做任何形式的限定。除非特別說明，實施例中采用的試劑、方法和設備均為本【技術領域】常規(guī)試劑、方法和設備。
[0019]除非特別說明，以下實施例所用飼料、試劑和材料均為市購。
[0020]實施例1:羅非魚消化道酶解產物的分析
選擇體重50±2克體重均一的羅非魚分組進行投喂商品化配合飼料，適應期為7天，每天9:00飽食投喂，第4天進行提取樣品。投喂后分1.0、1.5、3.0、6.0、9.0、12.0、24.0小時6個時段，每個時段兩條魚，所有的樣品均將兩條魚的量混合在一起。每個時段先用注射器從魚的尾靜脈抽血,將血液全部抽提,注入按1/10用PBS溶解的3.8%(w / V)檸檬酸三鈉中。然后解剖羅非魚，取胃腸道，用生理鹽水沖洗，羅非魚胃分為賁門、幽門盲囊和幽門，腸道分為十二指腸(胃的幽門部到腸道螺旋部分)、前腸(腸道螺旋部分)，前腸每10厘米(依具體情況而定)為一段，后腸(螺旋末端到示瓣收縮區(qū))，按段用繩子扎緊各個部分，用剪刀剪開一個小口獲取各個部分的消化液。將消化液注入有一定結合緩沖液(0.5M NaCl, 20mMTris-Hcl，5mM咪唑，pH 7.9)的離心管中，立即插冰上。消化液取完之后渦旋混勻，每個時段樣品保存待處理。
[0021]消化液蛋白處理方法:預實驗:消化液離心(轉速2000rpm),看沉淀量，加大binding buffer的量,潤旋,靜置10分鐘,2000rpm離心,直到沉淀量不再減少為止(保證蛋白基本溶解)，摸索溶解消化液的結合緩沖液量。正式實驗:取樣時用結合緩沖液溶解蛋白，第二天12000g、10 min、4°C離心得上清。樣品保存于_20度。高效液相色譜質譜檢測羅非魚消化道酶解樣品。檢測通過先將樣品進行液相分離，然后對分離的樣品進行質譜檢測，結果如圖1，在9.82min時檢測到酶解片段PP2，酶解片段PP2進行質譜檢測確定氨基酸序列為 PVKPENPGEDAPAEELAK。
[0022]實施例2:羅非魚酶解片段PP2的功能研究-腹腔注射羅非魚幼魚
根據質譜檢測所獲得的序列通過化學合成，制備了多肽PP2。用PBS緩沖液溶解PP2和陽性對照蛋白(NPY (神經肽Y))，對羅非魚幼魚進行腹腔注射。實驗分為陰性對照組(PBS緩沖液)，PP2和陽性對照蛋白高劑量組(0.24nmol/gbw),PP2和陽性對照蛋白中劑量組(0.12nmol/gbw)以及PP2和陽性對照蛋白低劑量組(0.024nmol/gbw),每組10尾魚。在注射后分別在2h、6h將魚用丁香酚麻醉，取垂體組織于液氮中，然后再轉入_80°C冰箱保存待用。按照invitrogen公司的Trizol reagent使用說明書提取RNA, Τ0Υ0Β0公司的ReverTraAce - a - TM First Strand cDNA Synthesis Kit 說明書進行反轉錄，TOYOBO 公司 KODSYBR?qPCR Mix的使用說明書進行熒光定量PCR檢測垂體GH mRNA表達水平的變化。然后使用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。結果見圖3、圖4與圖5、圖6，顯示腹腔注射陽性對照蛋白2h高劑量和6h低劑量均能顯著促進垂體GH mRNA表達，PP2在2h低劑量能顯著促進垂體GH mRNA表達，說明多肽PP2具有生理功能。
[0023]實施例3:多肽PP2的功能研究-重復腹腔注射羅非魚幼魚
根據第一次腹腔注射結果，PP2和陽性對照蛋白在注射后2h能夠較大程度的促進GHmRNA表達，因此重復進行注射實驗，重點關注注射2h取樣檢測對GH mRNA表達影響。實驗分別為陰性對照組，PP2和陽性對照蛋白高劑量組(0.24nmol/gbw), PP2和陽性對照蛋白中劑量組(0.12nmol/gbw)以及PP2和陽性對照蛋白低劑量組(0.024nmol/gbw),每組15尾魚。在注射后2h將魚用丁香酚麻醉，取垂體組織于液氮中，然后再轉入-80°C冰箱保存待用。按照invitrogen公司的Trizol reagent使用說明書提取RNA, Τ0Υ0Β0公司的ReverTraAce - a - TM First Strand cDNA Synthesis Kit 說明書進行反轉錄，TOYOBO 公司 KODSYBR?qPCR Mix的使用說明書進行熒光定量PCR檢測垂體GH mRNA表達水平的變化。然后使用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。結果見圖7和圖8，顯示腹腔注射陽性對照蛋白高劑量2h能顯著促進垂體GH mRNA表達，多肽PP2在2h低劑量能顯著促進垂體GH mRNA表達，兩次腹腔注射結果顯示實驗具有良好的重復性、可靠性，多肽PP2是有生理功能的多肽。
【權利要求】
1.一種人工合成多肽？?2，其特征在于，所述多肽？?2的氨基酸序列如3即10勵:1所0
2.權利要求1所述多肽？？2在制備提高羅非魚垂體⑶111^表達制劑中的應用。
3.權利要求1所述多肽在制備魚苗苗種促生長劑或添加劑中的應用。
【文檔編號】A23K1/18GK104447957SQ201410653306
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月14日 優(yōu)先權日:2014年11月14日
【發(fā)明者】李文笙, 吳阿敏 申請人:中山大學