一種小麥幼穗遺傳轉(zhuǎn)化受體的培養(yǎng)方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小麥幼穗遺傳轉(zhuǎn)化受體的培養(yǎng)方法及應(yīng)用，涉及轉(zhuǎn)基因【技術(shù)領(lǐng)域】。所述方法主要包括以下幾個(gè)步驟：1、幼穗的取材。2、幼穗的接種前處理。3、幼穗的接種及培養(yǎng)。4、將獲得胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至出苗。5、將所得的2-4cm高的幼苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)至獲得健壯的組培苗。6、根據(jù)小麥的類型，將獲得冬性小麥組培苗在4℃進(jìn)行春化處理，春小麥組培苗不進(jìn)行春化處理，最后將組培苗煉苗后移栽于土中。整個(gè)培養(yǎng)過程涉及三種培養(yǎng)基，分別是誘導(dǎo)培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基及生根壯苗培養(yǎng)基。
【專利說明】一種小麥幼穗遺傳轉(zhuǎn)化受體的培養(yǎng)方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種小麥幼穗遺傳轉(zhuǎn)化受體的培養(yǎng)方法及 應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 小麥?zhǔn)鞘澜缟系闹饕Z食作物之一，培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆新品種對(duì)發(fā)展國(guó)民經(jīng)濟(jì) 至關(guān)重要。目前小麥新品種的培育依然主要靠常規(guī)育種。由于常規(guī)雜交育種費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而 且預(yù)見性差，致使小麥育種水平難有突破性提高，育種進(jìn)展緩慢。近年來，利用現(xiàn)代基因工 程技術(shù)，將特定的外源基因?qū)胄←溨卸ㄏ蚋牧夹←溒贩N，為小麥遺傳育種提供了一條新 途徑。轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為雜交育種的主要補(bǔ)充手段，已經(jīng)在水稻、玉米、大豆、棉花和油菜等作 物中取得了巨大成功，然而小麥轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展比較緩慢。影響小麥基因工程育種速度緩 慢的主要原因有，小麥屬于異源六倍體植物，基因組龐大，重復(fù)序列多，植株再生能力差，遺 傳轉(zhuǎn)化比較困難等。
[0003]自1992年以來人們嘗試?yán)枚喾N轉(zhuǎn)化方法和多種外植體轉(zhuǎn)化小麥，轉(zhuǎn)化 方法包括基因槍、農(nóng)桿菌、花粉管通道、超聲波法、離子束注入法、激光微束穿刺法和 PEG(Polyethylene glycol)法等，外植體包括幼胚、成熟胚、幼穗、盾片和花藥愈傷組織 等，探討了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植株水平轉(zhuǎn)化，取得了一定進(jìn)展，促進(jìn)了功能基因向小麥中的轉(zhuǎn) 化。目前小麥的轉(zhuǎn)化方法雖然眾多但轉(zhuǎn)化效率卻并不樂觀，其首要問題在于穩(wěn)定的小麥再 生體系的建立較困難。雖然通過小麥根、莖、葉、花藥、胚、穗等各種外植體均可實(shí)現(xiàn)植株再 生，但實(shí)踐證明，相同外植體的誘導(dǎo)分化效果既受外植體類型和基因型的影響，也因培養(yǎng)基 的成分與濃度的不同而有變化。小麥成熟胚由于具有量大、生長(zhǎng)一致、取材方便且不受取材 季節(jié)和環(huán)境條件限制等優(yōu)點(diǎn)是開展小麥遺傳轉(zhuǎn)化較為方便的外植體。然而，愈傷組織質(zhì)量 差、易發(fā)芽等問題，其愈傷組織誘導(dǎo)率和植株的再生能力遠(yuǎn)不及幼胚和幼穗，限制了成熟胚 在小麥遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。目前幼穗和幼胚是小麥遺傳轉(zhuǎn)化中使用最多的外植體。盡管幼 胚的植株再生能力很強(qiáng)，但具有很強(qiáng)的基因型依賴性，在很大程度上限制了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在 小麥上的應(yīng)用。
[0004] 一些研究表明，以小麥幼穗為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)一般比常用的幼胚外植體更理 想，可獲得較高的植株再生頻率。舒理慧等研究表明，在小麥護(hù)穎分化期，其幼穗離體培養(yǎng) 誘導(dǎo)率和分化率最高；鄭企成等也指出，用合適時(shí)期的幼穗作外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織，其 再生能力比常用的幼胚外植體更理想，不僅再生頻率高，而且在長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)過程中能保 持較高的再生能力；陳梁鴻等在比較幼穗和幼胚為受體的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中觀察到，幼穗的轉(zhuǎn)化 效果優(yōu)于幼胚，幼穗較幼胚更耐繼代，更形成再生植株；林剛等研究激素對(duì)小麥愈傷組織， 誘導(dǎo)和植株再生的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，幼穗的愈傷組織誘導(dǎo)率和植株再生頻率高于幼胚和成熟 胚；劉錄祥等（2001)統(tǒng)計(jì)分析了近90個(gè)基因型幼胚及幼穗愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生頻率 分布的資料，認(rèn)為以小麥幼穗為外植體將有可能克服或減輕小麥基因型障礙。
[0005] 小麥幼穗由于取材方便、消毒方法簡(jiǎn)便，只需常規(guī)的春化技術(shù)就能做到周年提供， 并且對(duì)小麥幼穗進(jìn)行離體培養(yǎng)可獲得較高的綠苗分化率，因此是很好的外植體。因此，為了 克服基因型的障礙，促進(jìn)轉(zhuǎn)基因小麥的規(guī)?；瘧?yīng)用，建立適于目的基因轉(zhuǎn)化的幼穗組織培 養(yǎng)體系是利用幼穗為外植體進(jìn)行小麥遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種小麥幼穗遺傳轉(zhuǎn)化受體的培養(yǎng)方法及應(yīng)用，該方法適用 于進(jìn)行小麥轉(zhuǎn)基因，可成功獲得小麥轉(zhuǎn)基因植株。
[0007] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的采用如下技術(shù)方案：
[0008] -種小麥幼穗遺傳轉(zhuǎn)化受體的培養(yǎng)方法，其過程包括以下主要步驟：1、幼穗的取 材：選取溫室或田間種植的生長(zhǎng)一致的小麥單莖，麥穗處在小穗分化期（幼穗生長(zhǎng)至長(zhǎng)度 為1. 0cm?1. 5cm左右時(shí)）。2、幼穗的接種前處理：徒手剝?nèi)√镩g采集的幼穗莖桿的外層葉 鞘，僅余內(nèi)層葉鞘包裹幼穗以防止污染，在超凈工作臺(tái)上，噴灑75%乙醇對(duì)幼穗進(jìn)行殺菌， 將處理后的幼穗用經(jīng)75%乙醇處理的紗布包裹，以確保殺菌效果。3、幼穗的接種及培養(yǎng)： 用已滅菌的鑷子沿著處理后幼穗的內(nèi)層葉鞘順時(shí)針方向剝出幼穗，露出生長(zhǎng)錐后，用鑷子 尖將幼穗夾斷為〇. 5cm左右的小段，接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，25°C恒溫暗培養(yǎng)，每15d繼代 一次。4、暗培養(yǎng)30天以后，將獲得胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中，置于25°C，光照強(qiáng)度 為4000-60001ux、光照時(shí)間為16h/d的條件下，培養(yǎng)至出苗。5、將所得的2-4cm高的幼苗轉(zhuǎn) 接到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)至獲得健壯的組培苗。6、根據(jù)小麥的類型，將獲得冬性小麥組培苗 在4°C進(jìn)行春化處理，春小麥組培苗不進(jìn)行春化處理；最后將組培苗煉苗后移栽于土中。
[0009] 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分及配比如下：MS基本培養(yǎng)基+2,4_二氯苯氧乙酸丁酯（2， 4-D)2mg ?L_1+鹿糖（Sucrose) 30g噸―1-瓊脂粉（Agar) 7g ?L-1 ;用蒸饋水將上述培養(yǎng)基定容 至1L ;滅菌前調(diào)該培養(yǎng)基的pH至5. 8 ;在121°C，即0. 1?0. 15MPa高壓蒸汽下滅菌20分 鐘；
[0010] 所述分化培養(yǎng)基成分及配比如下：MS基本培養(yǎng)基+萘乙酸（NAA)O. 2mg? 1^+激 動(dòng)素（KT)lmg? 1^+6-芐氨基腺嘌呤（6-BA)lmg? 1^+ 硝酸銀（AgN03) 10mg? 1^+ 蔗糖 (Sucrose) 30g?I71-瓊脂粉（Agar) 7g?I71 ;用蒸饋水將上述培養(yǎng)基定容至IL;滅菌前調(diào)該 培養(yǎng)基的pH至5. 8 ;在121 °C，即0. 1?0. 15MPa高壓蒸汽下滅菌20分鐘；
[0011] 所述生根培養(yǎng)基成分及配比如下：1/2MS培養(yǎng)基+萘乙酸（NAA)O. 2mg?1^+多效 唑0? 3mg ? 1^+鹿糖（Sucrose) 30g ? 1^+瓊脂粉（Agar) 7g ? I71 ;用蒸饋水將上述培養(yǎng)基定 容至IL;滅菌前調(diào)該培養(yǎng)基的pH至5.8 ;在121°C，即0. 1?0. 15MPa高壓蒸汽下滅菌20 分鐘。
[0012] 所述MS基本培養(yǎng)基成分如表1所示：
[0013] 表1 MS基本培養(yǎng)基成分附表
[0014]

【權(quán)利要求】
1. 一種小麥幼穗遺傳轉(zhuǎn)化受體的培養(yǎng)方法及應(yīng)用，其特征在于：幼穗的取材時(shí)期選在 麥穗處于小穗分化期（幼穗生長(zhǎng)至長(zhǎng)度為1. Ocm?1. 5cm左右時(shí)）。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所陳述的一種小麥幼穗遺傳轉(zhuǎn)化受體的培養(yǎng)方法及應(yīng)用，其特征在 于：幼穗在接種前要進(jìn)行消毒處理，具體過程是：徒手剝?nèi)√镩g采集的幼穗莖桿的外層葉 鞘，僅余內(nèi)層葉鞘包裹幼穗以防止污染，在超凈工作臺(tái)上，噴灑75%乙醇對(duì)幼穗進(jìn)行殺菌， 將處理后的幼穗用經(jīng)75%乙醇處理的紗布包裹，以確保殺菌效果。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1和2所陳述的一種小麥幼穗遺傳轉(zhuǎn)化受體的培養(yǎng)方法及應(yīng)用，其特 征在于：用已滅菌的鑷子沿著處理后幼穗的內(nèi)層葉鞘順時(shí)針方向剝出幼穗，露出生長(zhǎng)錐后， 用鑷子尖將幼穗夾斷為0. 5cm左右的小段，接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2和3所陳述的一種小麥幼穗遺傳轉(zhuǎn)化受體的培養(yǎng)方法及應(yīng)用，其 特征在于：幼穗的培養(yǎng)基分為誘導(dǎo)培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基及生根壯苗培養(yǎng)基。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所陳述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于：誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分是:MS基 本培養(yǎng)基+2,4-二氯苯氧乙酸丁酯（2,4-D)2mg 蔗糖（Sucrose) 瓊脂粉 (Agar)7g ? I71 ;用蒸餾水將上述培養(yǎng)基定容至IL ;滅菌前調(diào)該培養(yǎng)基的pH至5. 8 ;在 121°C，即0. 1?0. 15MPa高壓蒸汽下滅菌15分鐘。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所陳述的分化培養(yǎng)基，其特征在于：分化培養(yǎng)基的成分是:MS基本 培養(yǎng)基+萘乙酸（NAA)O. 2mg七1-激動(dòng)素（KT) lmg .1^+6-芐氨基腺嘌呤（6-BA) lmg噸-1+ 硝酸銀（AgN03) 10mg ? 1^+鹿糖（Sucrose) 30g ? 1^+瓊脂粉（Agar) 7g ? I71 ;用蒸饋水將上 述培養(yǎng)基定容至IL;滅菌前調(diào)該培養(yǎng)基的pH至5.8 ;在121°C，即0. 1?0. 15MPa高壓蒸汽 下滅菌20分鐘。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所陳述的生根培養(yǎng)基，其特征在于：生根培養(yǎng)基的成分是：1/2MS 培養(yǎng)基 + 萘乙酸（NAA) 0? 2mg ? 1^+ 多效唑 0? 3mg ? 1^+ 蔗糖（Sucrose) 30g ? 1^+ 瓊脂 粉（Agar) 7g ? I71 ;用蒸餾水將上述培養(yǎng)基定容至IL ;滅菌前調(diào)該培養(yǎng)基的pH至5. 8 ;在 121°C，即0. 1?0. 15MPa高壓蒸汽下滅菌15分鐘。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104429957SQ201410692788
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月26日
【發(fā)明者】吉萬全, 劉新倫, 田增榮, 栗聰, 李偉艷, 張磊 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)