熒光假單胞菌及生物制劑和在防治甘蔗鞭黑穗病中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥領(lǐng)域，特別涉及一株熒光假單胞菌及其生物制劑和在防治甘 蔗鞭黑穗病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 甘鹿（Saccharumofficinarum)是我國南方地區(qū)重要的糖料作物，80%以上的食 糖是以甘蔗作為原料制成的，在國民經(jīng)濟(jì)中有著重要的地位和作用。甘蔗原產(chǎn)于高溫多濕 的熱帶亞熱帶地區(qū)，非常有利于甘蔗病蟲害的發(fā)生發(fā)展。迄今世界上已發(fā)現(xiàn)真菌病害約有 80多種，在華南地區(qū)，甘鹿鞭黑穗病（sugarcanesmut)是目前生產(chǎn)上發(fā)生最普遍、為害最 嚴(yán)重的真菌性病害，已給甘蔗生產(chǎn)及糖業(yè)的產(chǎn)量和品質(zhì)帶來了嚴(yán)重的損失。目前，生產(chǎn)上對 該病害的控制主要以化學(xué)藥劑防治為主。
[0003] 焚光假單胞菌（Pseudomonasfluorescens)是一種廣泛存在于土壤中的生防細(xì) 菌，產(chǎn)生胞外拮抗物質(zhì)及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性是其最主要的特征，因而在植物病害生物 防治中具有重要的地位。李愛榮等（2003)篩選到2株對稻瘟病菌有較好抑制作用的2株 生防熒光假單胞桿菌。王剛等（2004)研宄了熒光假單胞菌P2-5菌株對小麥全蝕病的抑 制作用。顧金剛等（2004)報(bào)道了 2株熒光假單胞桿菌菌株對煙草黑脛病病原菌的抑制作 用。李國俊等（2008)報(bào)道熒光假單胞桿菌菌株7-5對煙草炭疽病菌抑制作用。Hossain等 (2009)的研宄也表明熒光假單胞菌可抑制蘋果黑星病菌孢子的萌發(fā)。而對于甘蔗鞭黑穗病 的生防菌的篩選，廖詠梅等（2004)進(jìn)行過研宄，但只鑒定到假單胞菌屬。
[0004] 因此，熒光假單胞菌作為一類重要的生防自然資源，已引起國內(nèi)外研宄者的廣泛 關(guān)注，具有開發(fā)生物農(nóng)藥的潛力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)防治甘蔗鞭黑穗病的缺點(diǎn)與不足，開發(fā)熒光假單胞菌的應(yīng) 用，本發(fā)明的首要目的在于提供一株以甘蔗根際微生物為篩選對象，分離得到的對甘蔗鞭 黑穗病菌有抑制作用的熒光假單胞菌，命名為熒光假單胞菌（Pseudomonasfluorescens) HN58,為甘蔗鞭黑穗病的生物防治奠定基礎(chǔ)。另外，本發(fā)明從甘蔗根際篩選到的生防菌，將 其用于甘蔗病害的防治，其主要生防機(jī)制表現(xiàn)為抑制甘蔗鞭黑穗病菌+、_兩個單倍體菌 系的有性配合，因形成不了具有侵染致病力的雙核菌絲體，從而達(dá)到生防效果。同時又較少 或不影響病原菌的兩個無致病性單倍體菌絲本身的形態(tài)生長。這種生防機(jī)制具有較大的創(chuàng) 新意義。將其應(yīng)用到甘蔗病害的防治，對甘蔗的食用及其加工產(chǎn)品來說更加安全可靠。
[0006] 本發(fā)明另一目的在于提供一種基于上述熒光假單胞菌制備得到的生物制劑。
[0007] 本發(fā)明再一目的在于提供上述熒光假單胞菌在防治甘蔗鞭黑穗病中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明再一目的在于提供上述生物制劑在防治甘蔗鞭黑穗病中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的目的通過下述方案實(shí)現(xiàn)：
[0010] 一株熒光假單胞菌，將其命名為熒光假單胞菌（Pseudomonasfluorescens)HN58， 保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，地址：中國武漢武漢大學(xué)，保藏號為CCTCCNo:M2014511，保藏時間為2014年10月24日。
[0011] 所述的熒光假單胞菌在LB培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)，其單菌落為圓形，乳白色，表面光 滑，不透明，略隆起，粘質(zhì)，邊緣整齊無皺褶。
[0012] 所述的熒光假單胞菌從甘蔗根際土壤中分離、純化得到。
[0013] 一種生物制劑，基于上述熒光假單胞菌制備得到。
[0014] 所述的生物制劑由熒光假單胞菌經(jīng)液體發(fā)酵制備得到，優(yōu)選包含以下步驟：將熒 光假單胞菌接種至LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，即可獲得生物制劑。
[0015] 所述LB液體培養(yǎng)基的pH值優(yōu)選為7. 0。
[0016] 所述的培養(yǎng)指在28°C，搖床震蕩速率為180?200rpm下培養(yǎng)24h。
[0017] 上述生物制劑在防治甘蔗鞭黑穗病中的應(yīng)用。
[0018] 上述熒光假單胞菌在防治甘蔗鞭黑穗病中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果：
[0020] 1、本發(fā)明得到的熒光假單胞菌來源于本地甘蔗根際土壤，能適應(yīng)本地的自然環(huán) 境；另外，本發(fā)明從甘蔗根際篩選到的生防菌，將其用于甘蔗病害的防治，其主要生防機(jī)制 表現(xiàn)為僅抑制甘蔗鞭黑穗病菌+、_兩個單倍體菌系的有性配合，因形成不了能侵染致病 的雙核菌絲體，從而達(dá)到生防效果。同時又較少或不影響病原菌的兩個無致病性單倍體菌 絲本身的生長。這種生防機(jī)制具有較大的創(chuàng)新意義。將其應(yīng)用到甘蔗病害的防治，對甘蔗 的食用及其加工產(chǎn)品來說更加安全可靠。
[0021] 2、本發(fā)明的生物制劑對甘蔗鞭黑穗病菌具有強(qiáng)烈的抑制作用，而且該生物制劑來 源環(huán)保無毒性，對生態(tài)環(huán)境影響小。
[0022] 3、本發(fā)明得到的熒光假單胞菌，培養(yǎng)條件要求低，具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0023]圖1為熒光假單胞菌對甘蔗鞭黑穗病菌的抑制作用結(jié)果圖。
[0024] 圖2為熒光假單胞菌濾液對甘蔗鞭黑穗病菌的抑制作用結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0026] 實(shí)施例1 :焚光假單胞菌的分離、純化和保藏
[0027] (1)LB培養(yǎng)基的配置：LB培養(yǎng)基的配置：稱取胰蛋白胨（Tryptone，OxoidLTD LP0042,England) 10g，酵母提取物（Yeastextract，OxoidLTDLP0021，England) 5g，氯化 鈉（NaCl，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，10019318) 10g，加水lOOOmL攪拌均勾，再加15g瓊 月旨，充分加熱溶解后分裝，121°C滅菌20min后貯存?zhèn)溆谩?br>[0028] (2)熒光假單胞菌的分離、純化：
[0029] 稱取華南農(nóng)業(yè)大學(xué)躍進(jìn)農(nóng)場蔗田甘蔗根際土樣10g，加到裝有90mL無菌水的三角 瓶中，于28°C、200rpm振蕩lh，靜置1?2h后，吸取lmL的土壤浸漬上清液以濃度梯度法， 用0. 9%的生理鹽水依次稀釋至10_6的濃度，分別吸取100yL10 _4、10_5、10_6等3個濃度的 溶液均勻涂布在LB平板上以分離細(xì)菌，每個濃度涂3個平板。
[0030] 在無菌超凈臺上充分吹干后，于28°C、黑暗、倒置培養(yǎng)，1?2d后即有大量細(xì)菌菌 落長出。用滅菌牙簽挑取菌落特征不同的單菌落于LB平板上純化培養(yǎng)，得到多種不同生物 形態(tài)的菌株，將其中四種分別編號為Al、A2、A3、A4,并作為生防實(shí)驗(yàn)待測菌株保存?zhèn)溆茫瑢?其進(jìn)行生防活性檢測后，選取A1為本發(fā)明的新菌株。
[0031] 所述純化所得A1菌株經(jīng)16SrDNA序列分析，其序列（如下所示）與NCBI數(shù)據(jù) 庫進(jìn)行核苷酸序列同源性比對，結(jié)果顯示，在親緣關(guān)系相近的前100個序列中，76個為假 單胞菌屬（Pseudomonasspp.)的菌株，本菌株與它們都具有99%的同源性。再通過構(gòu)建 16SrDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，本菌株與P.fluorescensPf0-1(NC_007492. 2)菌株處于同 一分支，菌株間的相似性達(dá)到了 99. 4%，證實(shí)其分類命名為焚光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens)，命名為焚光假單胞菌（Pseudomonasfluorescens)HN58。16SrDNA序列片段 如下：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株熒光假單胞菌，其特征在于：將其命名為熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens)HN58,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，地址：中國武漢武漢大 學(xué)，保藏號為CCTCC No :M2014511，保藏時間為2014年10月24日。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光假單胞菌，其特征在于：從甘蔗根際土壤中分離、純化得 到。
3. -種生物制劑，其特征在于基于權(quán)利要求1?2任一項(xiàng)所述的熒光假單胞菌制備得 到。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物制劑，其特征在于通過包含以下步驟的方法制備得到： 將熒光假單胞菌接種至LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得生物制劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物制劑，其特征在于：所述LB液體培養(yǎng)基的pH值為7. 0 ; 所述的培養(yǎng)指在28°C，搖床震蕩速率為180?200rpm下培養(yǎng)24h。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3?5任一項(xiàng)所述的生物制劑在防治甘蔗鞭黑穗病中的應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1?2任一項(xiàng)所述的熒光假單胞菌在防治甘蔗鞭黑穗病中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥領(lǐng)域，公開了一株熒光假單胞菌及其生物制劑和在防治甘蔗鞭黑穗病中的應(yīng)用。將該株熒光假單胞菌命名為熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)HN58，于2014年10月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址：中國武漢武漢大學(xué)，保藏號為CCTCC No：M2014511。該菌株由甘蔗根際土壤分離得到，能適應(yīng)本地的自然環(huán)境；對甘蔗鞭黑穗病菌具有較好的抑制作用，而且來源環(huán)保無毒性，對生態(tài)環(huán)境影響小；培養(yǎng)條件要求低，具有很好的開發(fā)應(yīng)用前景。CCTCC No：M201451120141024
【IPC分類】A01P3-00, C12N1-20, A01N63-02, C12R1-39
【公開號】CN104531571
【申請?zhí)枴緾N201410777646
【發(fā)明人】習(xí)平根, 鄧華, 孫飛, 江立群, 孫霞, 袁玉花, 李敏慧, 古佳妍, 沈萬寬, 姜子德
【申請人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月15日