一種與奶山羊乳腺上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)的miRNA及其在奶山羊育種中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一種與奶山羊乳腺上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)的miRNA及其在奶山羊育種中的應(yīng)用，該小RNA分子miR-143可以通過(guò)延緩細(xì)胞周期進(jìn)程抑制乳腺上皮細(xì)胞的增殖，發(fā)明人利用該特性發(fā)現(xiàn)通過(guò)基因工程技術(shù)抑制miR-143或其前體表達(dá)，可間接抑制乳腺上皮細(xì)胞凋亡，以達(dá)到延緩乳腺退化、延長(zhǎng)泌乳期、提高乳用家畜泌乳量，具有極高的應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種與奶山羊乳腺上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)的miRNA及其在奶山 羊育種中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一種與奶山羊乳腺上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)的 miRNA及其在奶山羊育種中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 奶山羊乳腺發(fā)育、泌乳和退化過(guò)程具有一定規(guī)律性，其涉及乳腺細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、增 殖與凋亡，以及死亡。現(xiàn)在利用分子手段調(diào)控乳腺細(xì)胞凋亡過(guò)程、延緩乳腺退化過(guò)程，以延 長(zhǎng)奶山羊的泌乳期、提高泌乳量、改善奶山羊泌乳遺傳性能，為嶗山奶山羊的分子改良提供 新的思路和有益的線索，是現(xiàn)今技術(shù)發(fā)展的主要方向。
[0003] miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度約22nt (nucleotide)，存在于生物體內(nèi)的、單鏈的、非蛋白質(zhì)編 碼的、進(jìn)化上高度保守的一種調(diào)控型的小RNA分子，其通過(guò)調(diào)控靶基因表達(dá)廣泛參與了神 經(jīng)發(fā)育，細(xì)胞分化、增殖及凋亡，脂肪代謝（Xu et al，2003)，乳腺發(fā)育等生理過(guò)程，并作為 抑癌基因或癌基因而發(fā)揮重要的功能。
[0004] miRNA在動(dòng)物中的研宄首先發(fā)現(xiàn)于線蟲(chóng)中，被稱(chēng)為異時(shí)開(kāi)關(guān)基因的Lin-4,該基因 雖然不編碼蛋白但能使線蟲(chóng)發(fā)育事件延遲發(fā)生。后來(lái)Reinhart等研宄人員又發(fā)現(xiàn)了第二 個(gè)同樣的異時(shí)開(kāi)關(guān)基因 Let-7,其能調(diào)控線蟲(chóng)發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)變。后來(lái)研宄人員又發(fā)現(xiàn)Let-7 家族的很多miRNA，像miR-148、miR-84和miR-241也參與了線蟲(chóng)發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)變的調(diào)控。
[0005] 隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是隨著近幾年來(lái)第二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，研宄人 員可以大批量地鑒定和發(fā)現(xiàn)一些新的miRNA，使miRNA的發(fā)展日新月益，鑒定出來(lái)的新 miRNA成指數(shù)上升，miRNA以其獨(dú)特的調(diào)控方式和表達(dá)特性迅速成為生物學(xué)領(lǐng)域研宄的熱 點(diǎn)。
[0006] 乳腺發(fā)育、泌乳和退化過(guò)程中，激素、生長(zhǎng)因子和一些蛋白質(zhì)發(fā)揮著關(guān)鍵性作 用。microRNA被發(fā)現(xiàn)后，它在器官發(fā)育過(guò)程中所發(fā)揮的作用也逐漸引起了研宄者的關(guān)注。 2010年，來(lái)自哥廷根、法蘭克福和漢諾威的科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)激素和蛋白并非是乳腺發(fā)育的完 全決定因素，一些小的核糖核酸分子在此過(guò)程中亦發(fā)揮了關(guān)鍵性作用，實(shí)驗(yàn)所用的小鼠擁 有乳腺發(fā)育所必需的所有激素、生長(zhǎng)因子和蛋白質(zhì)，但由于缺乏miR-122和miR-132而導(dǎo) 致小鼠乳腺導(dǎo)管完全無(wú)法發(fā)育，研宄人員第一次在動(dòng)物模型中證實(shí)了小核糖核酸分子，即 microRNAs，在器官發(fā)育中發(fā)揮重要的功能。
[0007] 而miR-143作為一種全新的小RNA分子，現(xiàn)有報(bào)道中記載其可以實(shí)現(xiàn)對(duì)于癌細(xì)胞 的增殖抑制，進(jìn)而可以用來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)，但是由于癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的差異，這一作用 是否能夠應(yīng)用于正常細(xì)胞中還未可知，至今未見(jiàn)關(guān)于miR-143在乳腺細(xì)胞凋亡中的作用及 其育種應(yīng)用的任何報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的發(fā)明人針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，提供了一種與奶山羊乳腺上皮細(xì)胞凋 亡相關(guān)的miRNA及其在奶山羊育種中的應(yīng)用，該小RNA分子miR-143可以通過(guò)延緩細(xì)胞周 期進(jìn)程抑制乳腺上皮細(xì)胞的增殖，發(fā)明人利用該特性發(fā)現(xiàn)通過(guò)基因工程技術(shù)抑制miR-143 或其前體的表達(dá)，可間接抑制乳腺上皮細(xì)胞凋亡，以達(dá)到延緩乳腺退化、延長(zhǎng)泌乳期、提高 乳用家畜泌乳量，具有極高的應(yīng)用價(jià)值。
[0009] 發(fā)明人首先提供了一種與奶山羊乳腺上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)的miRNA，該miRNA為 miR-143,其基因序列如SEQ ID NO. 1所示，其前體基因序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0010] 為了驗(yàn)證該miRNA的相關(guān)作用，發(fā)明人采用MTT法、熒光Hoechst/PI雙染技術(shù)和 流式細(xì)胞術(shù)研宄了 miR-143對(duì)乳腺上皮細(xì)胞增殖與凋亡的影響，結(jié)果表明，miR-143通過(guò)延 緩細(xì)胞周期進(jìn)程，可抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡；具體過(guò)程如下：
[0011] 發(fā)明人首先將miR-143瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的原代乳腺上皮細(xì)胞，采用MTT法對(duì) 細(xì)胞增殖結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后48h和72h時(shí)，細(xì)胞活力在轉(zhuǎn)染組比色值顯著降 低，在48h時(shí)兩組間差異達(dá)到極顯著水平（P〈0. 01)，說(shuō)明miR-143抑制乳腺上皮細(xì)胞的增 殖；
[0012] 在此工作的基礎(chǔ)上，發(fā)明人進(jìn)一步采用熒光Hoechst/PI熒光雙染技術(shù)和流式細(xì) 胞術(shù)驗(yàn)證了 miR-143對(duì)乳腺上皮細(xì)胞凋亡的影響，并采用qRT-PCR檢測(cè)了凋亡標(biāo)志基因表 達(dá)：
[0013] 其熒光雙染技術(shù)表明，在空白組Hoechst33342染色細(xì)胞核呈正常狀態(tài)，對(duì)照組 Hoechst33342也呈正常狀態(tài)，而轉(zhuǎn)染組經(jīng)Hoechst33342染色后細(xì)胞核在熒光顯微鏡下則 形態(tài)不完整，呈出碎裂狀凋亡小體，表現(xiàn)出明顯的凋亡現(xiàn)象；
[0014] 流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)，miR-143通過(guò)使細(xì)胞周期阻滯在Gl期，延緩了細(xì)胞周期的 進(jìn)行，對(duì)照組只檢測(cè)到正常二倍體細(xì)胞DNA峰（Gl峰），轉(zhuǎn)染組的Gl峰前出現(xiàn)一小峰，即所 謂的凋亡峰（Ap峰），說(shuō)明miR-143促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的凋亡；
[0015] qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，凋亡基因 BAX在轉(zhuǎn)染組表達(dá)量極顯著升高 (P〈0. 01)，BCL2在轉(zhuǎn)染組其表達(dá)量變低，但差異不顯著，進(jìn)一步說(shuō)明miR-143促進(jìn)乳腺上皮 細(xì)胞的凋亡。
[0016] 基于上述的發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人進(jìn)一步通過(guò)基因工程技術(shù)抑制miR-143在奶山羊體內(nèi)的 表達(dá)，可間接抑制乳腺上皮細(xì)胞凋亡，以達(dá)到延緩乳腺退化、延長(zhǎng)泌乳期、提高乳用家畜泌 乳量，具有極高的應(yīng)用價(jià)值。除此之外還可以采用抑制基因序列如SEQ ID NO. 2所示的前 體序列在奶山羊體內(nèi)的表達(dá)，來(lái)實(shí)現(xiàn)上述的目的。
[0017] 綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人在充分試驗(yàn)的基礎(chǔ)上提供了一種與奶山羊乳腺上皮細(xì) 胞凋亡相關(guān)的miRNA及其在奶山羊育種中的應(yīng)用，該小RNA分子miR-143可以通過(guò)延緩 細(xì)胞周期進(jìn)程抑制乳腺上皮細(xì)胞的增殖，發(fā)明人利用該特性發(fā)現(xiàn)通過(guò)基因工程技術(shù)抑制 miR-143或其前體在奶山羊體內(nèi)的表達(dá)，可間接抑制乳腺上皮細(xì)胞凋亡，以達(dá)到延緩乳腺退 化、延長(zhǎng)泌乳期、提高乳用家畜泌乳量，具有極高的應(yīng)用價(jià)值。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為體外培養(yǎng)的原代乳腺上皮細(xì)胞免疫熒光鑒定結(jié)果灰度圖，
[0019] 圖中右下角深色區(qū)域是乳腺上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白角蛋白18的免疫熒光鑒定；可見(jiàn) 我們?cè)隗w外培養(yǎng)獲得的確實(shí)是乳腺上皮細(xì)胞；
[0020] 圖2為miR-143對(duì)細(xì)胞活力影響的MTT法檢測(cè)結(jié)果示意圖，
[0021] 圖中A為對(duì)照組與轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；B為對(duì)照組與轉(zhuǎn)染組MTT檢測(cè)結(jié)果；
[0022] 圖中A為通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)得到的對(duì)照組與轉(zhuǎn)染組間細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染 miR-143后，細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯減少，生長(zhǎng)受到抑制；圖中B為通過(guò)MTT法測(cè)得對(duì)照組與轉(zhuǎn)染組 間細(xì)胞吸光值結(jié)果，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在培養(yǎng)48h時(shí)，吸光值明顯降低；兩部分結(jié)果都說(shuō) 明miR-143對(duì)體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)具有一定抑制作用；
[0023] 圖3為miR-143對(duì)細(xì)胞凋亡影響的熒光Hoechst33342/PI雙染檢測(cè)結(jié)果灰度示意 圖，
[0024] 圖中 I 組（I -1，I -2，I -3)為陽(yáng)性對(duì)照；II組（II -1，II -2, II -3)為轉(zhuǎn)染 組；III組（III -1，III -2, III -3)為陰性對(duì)照；1 列（I -1，II -1，III -1)為正常細(xì)胞；2 列 (I -2，II -2, III -2)為 PI 染色；3 列（I -3，II -3, III -3)為 Hoechst33342 染色；
[0025] 經(jīng)PI染色后，在顯微鏡下可觀察到死亡細(xì)胞，經(jīng)Hoechst33342染色后，可觀察到 凋亡細(xì)胞，并呈現(xiàn)凋亡顆粒；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所有實(shí)驗(yàn)細(xì)胞經(jīng)PI染色后，僅發(fā)現(xiàn)有少量細(xì)胞 死亡，而大部分為正常生長(zhǎng)細(xì)胞，而經(jīng)H 〇echst33342染色后，在轉(zhuǎn)染組呈現(xiàn)出明顯的細(xì)胞 凋亡狀態(tài)，結(jié)果說(shuō)明miR-143對(duì)體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞具有明顯的促凋亡作用；
[0026] 圖4為miR-143對(duì)細(xì)胞周期影響的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果示意圖，
[0027] 圖中A為陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞周期分布；B為轉(zhuǎn)染組細(xì)胞周期分布；C為不同組間細(xì)胞周 期分布統(tǒng)計(jì)結(jié)果，顯示經(jīng)miR-143處理后，Gl期變長(zhǎng)而S期變短，且兩組處理間差異達(dá)到顯 著水平，結(jié)果說(shuō)明miR-143可使體外培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)周期阻滯在Gl期，從而延緩了細(xì)胞周 期的進(jìn)程；
[0028] 圖5為miR-143對(duì)乳腺上皮細(xì)胞凋亡影響的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果示意圖，
[0029] 圖中A為陽(yáng)性對(duì)照組；B為轉(zhuǎn)染組，
[0030] 結(jié)果顯示在對(duì)照組僅檢測(cè)到正常的二倍體細(xì)胞DNA峰（Gl峰），而轉(zhuǎn)染組在Gl峰 前出現(xiàn)一小峰，即所謂的凋亡峰（Ap峰）.結(jié)果表明miR-143對(duì)體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞具 有促凋亡作用；
[0031] 圖6. miR-143過(guò)表達(dá)后凋亡相關(guān)基因 BAX和BCL2表達(dá)的qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果示意 圖，結(jié)果顯示凋亡基因 BAX在轉(zhuǎn)染組，與陽(yáng)性對(duì)照相比其mRNA表達(dá)量顯著升高，差異達(dá)到極 顯著（P〈0. 01)，抗凋亡基因 BCL2在對(duì)照組，與轉(zhuǎn)染組相比其mRNA表達(dá)量顯著升高，差異達(dá) 到顯著性（P〈〇. 05)，結(jié)果表明miR-143對(duì)體外培養(yǎng)的乳腺細(xì)胞具有凋亡作用。

【具體實(shí)施方式】
[0032] 以下實(shí)施例中進(jìn)一步定義本發(fā)明，根據(jù)以上的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明 作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。除特殊注明外，本發(fā)明所采用的均為本 領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)；
[0033] 其中細(xì)胞培養(yǎng)基的配制：體積比FBS !DMEM-F12為1:9的溶液，含有5mg/L牛胰島 素、5mg/L氫化可的松、10 μ g/L表皮生長(zhǎng)因子和10萬(wàn)IU/L青鏈霉素雙抗；
[0034] 消化液為等體積混合的不含鈣鎂離子的PBS和0. 25wt%胰蛋白酶的EDTA溶液，消 化條件為室溫25°C，成纖維細(xì)胞消化時(shí)間為2-3分鐘；
[0035] 其中所采用的FBS、DMEM-F12、0. 25wt%胰蛋白酶的EDTA溶液購(gòu)自gibco公司， 牛胰島素、氫化可的松和青鏈霉素雙抗購(gòu)自Sigma公司，表皮生長(zhǎng)因子購(gòu)自Invitrogen公 司；
[0036] 實(shí)施例1.原代乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)
[0037] 1.乳腺組織采集與處理
[0038] 用常規(guī)手段獲取奶山羊乳腺組織，取樣時(shí)，獲取腺泡較豐富且結(jié)締組織和脂肪較 少的乳腺組織塊約30g，放入含3%雙抗的滅菌PBS中沖洗后，于低溫2h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。培 養(yǎng)前將乳腺組織在培養(yǎng)皿中用含1 %雙抗的PBS洗3-5次，直到組織顏色發(fā)白。用手術(shù)剪刀 將組織剪碎（成Imm3左右的乳糜小塊），再用含1 %雙抗的PBS清洗2次，洗到組織塊發(fā)白 為止。
[0039] 2.組織塊接種及培養(yǎng)
[0040] (1)用吸管或眼科鑷子將乳糜樣組織小塊接種于培養(yǎng)瓶中：每個(gè)25cm2平皿十塊 左右均勻放置，每小塊間距0. 5cm左右；
[0041] (2)將培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn)使組織塊朝下，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2_3h左右，使組織 塊牢固貼于培養(yǎng)瓶表面；
[0042] (3)加入含1 %雙抗的全培養(yǎng)基3-4ml (培養(yǎng)基成分包括：DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、 10%胎牛血清FBS、胰島素、氫化可的松和表皮生長(zhǎng)因子），輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)液緩緩 浸潤(rùn)組織塊；
[0043] (4)將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)，每3天換液一次；
[0044] (5) 10天后在顯微鏡下觀察細(xì)胞爬出情況，待細(xì)胞長(zhǎng)出后，每2天換液一次。
[0045] 3.細(xì)胞純化：
[0046] 在培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞中混有成纖維細(xì)胞，利用兩種細(xì)胞消化和貼壁所需時(shí)間長(zhǎng) 短不同來(lái)進(jìn)行純化，待細(xì)胞生長(zhǎng)良好后，用0. 25%的胰酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化傳代，最終獲得較 純的乳腺上皮細(xì)胞，具體操作如下：
[0047] (1)將培養(yǎng)瓶取出吸掉舊培養(yǎng)液，用卜2mLPBS潤(rùn)洗細(xì)胞，加入ImLO. 25%的胰酶消 化；
[0048] (2)放在顯微鏡下觀察，成纖維細(xì)胞會(huì)比上皮細(xì)胞先從瓶壁上脫落，因此待有細(xì)胞 脫落時(shí)棄掉消化液連同脫落的細(xì)胞，重新加入ImLO. 25%的胰酶繼續(xù)消化，至細(xì)胞全部脫落 時(shí)，加入全培養(yǎng)液終止消化；
[0049] (3)重復(fù)純化3-4代，可消除成纖維細(xì)胞從而獲得較純的乳腺上皮細(xì)胞；
[0050] 發(fā)明人對(duì)其進(jìn)行體外培養(yǎng)的原代乳腺上皮細(xì)胞免疫熒光鑒定，結(jié)果如圖1所示， 其中右下角深色區(qū)域是乳腺上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白角蛋白18的免疫熒光鑒定；可見(jiàn)我們?cè)谠?體外培養(yǎng)獲得的確實(shí)是乳腺上皮細(xì)胞。
[0051] 實(shí)施例2.細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
[0052] 轉(zhuǎn)染試驗(yàn)分為3組：轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照
[0053] 首先將miR-143按常規(guī)方法連接到pcDNA3. 1載體上獲得轉(zhuǎn)染質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染組；
[0054] 將pcDNA3. 1空載體作為陽(yáng)性對(duì)照組的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒；
[0055] 陰性對(duì)照為不采用任何轉(zhuǎn)染質(zhì)粒；
[0056] 轉(zhuǎn)染步驟按 Lipofectamine? LTX and PLUS? Reagents (invitrogen)轉(zhuǎn)染試劑盒 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；
[0057] (1)對(duì)于培養(yǎng)貼壁良好處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，均勻 等量的接種于24孔培養(yǎng)板；
[0058] (2)培養(yǎng)24h后，細(xì)胞融合度達(dá)70-80 %時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染；
[0059] (3)將每組質(zhì)粒及內(nèi)參載體質(zhì)粒pGL4. 74(轉(zhuǎn)染質(zhì)粒與內(nèi)參質(zhì)粒按質(zhì)量比30:1)按 每孔質(zhì)粒終濃度〇· 8 μ g稀釋至100 μ I Opti-MEM I中，質(zhì)粒DNA( μ g)與Lipofectamine? PLUS ( μ 1)體積按1:1的量加入Lipof ectamine? PLUS后吹打混勻，5min后加入適量 Lipofectamine? LTX轉(zhuǎn)染試劑輕輕吹打混勻，室溫繼續(xù)孵育30min ;
[0060] (4)加100 μ L混合液至待轉(zhuǎn)染的每一細(xì)胞培養(yǎng)孔中，將含雙抗的培養(yǎng)液（體積比 FBS !DMEM-F12為1:9的溶液，含有5mg/L牛胰島素、5mg/L氫化可的松、10 μ g/L表皮生長(zhǎng) 因子和10萬(wàn)IU/L青鏈霉素雙抗；）換成不含抗生素的上述培養(yǎng)液，每孔加400 μ L，每組設(shè) 置4個(gè)復(fù)孔；
[0061] (5)將培養(yǎng)板放入37 °C 5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，在轉(zhuǎn)染后6h換掉轉(zhuǎn)染液，繼續(xù) 用正常培養(yǎng)液培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后24-48h檢測(cè)熒光強(qiáng)度。
[0062] 實(shí)施例3. MTT法檢測(cè)miR-143對(duì)細(xì)胞增殖影響
[0063] (1)細(xì)胞接種：用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)過(guò)反復(fù) 摸索，最終以每孔3 X IO4個(gè)細(xì)胞密度接種于96孔板，每孔培養(yǎng)液體積200 μ 1 ;
[0064] (2)細(xì)胞培養(yǎng)：將96孔培養(yǎng)板放入37 °C 5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0065] (3)細(xì)胞轉(zhuǎn)染：培養(yǎng)24h后，細(xì)胞生長(zhǎng)到70-80%匯合度時(shí)，對(duì)每塊96孔培養(yǎng)板同 時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每板均分為3組（miR-143轉(zhuǎn)染組，對(duì)照組（陽(yáng)性），空白組（陰性）），每組設(shè) 6個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染時(shí)用不含抗生素的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后12h換成正常培養(yǎng)基；
[0066] (4)細(xì)胞呈色：分別在轉(zhuǎn)染的0h、48h、72h檢測(cè)熒光值，每孔加入終濃度為5mg/ mlMTT溶液20 μ 1，繼續(xù)孵育4h后終止培養(yǎng)。用注射器小心吸棄孔內(nèi)全部上清液，同時(shí)每孔 加入150 μ 1二甲基亞砜（DMSO)，輕微振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解；
[0067] (5)比色：混勻后用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490nm處測(cè)定各孔吸光值，對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng) 計(jì)分析；通過(guò)比較過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組的吸光值確定活細(xì)胞數(shù)（結(jié)果如圖2所示）。
[0068] 實(shí)施例4.熒光Hoechst33342/PI雙染檢測(cè)miR-143對(duì)細(xì)胞凋亡影響
[0069] (1)固定培養(yǎng)的細(xì)胞消化后懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，lOOOrpm/min離心收集細(xì)胞，將 IO5-IO6個(gè)細(xì)胞懸浮于ImL培養(yǎng)基中，再加入IOyL Hoechst 33342染液，混勻，37°C孵育 5 ?15min ;
[0070] (2)細(xì)胞于4°C，500?1000rpm/min離心5min棄去上清液；
[0071] (3)加入I. OiriLBuffei* A工作液（用雙蒸水將lOXBuffei* A稀釋10倍）懸浮細(xì) 胞，加入5 μ L PI染液，室溫避光放置5?15min后混勻；
[0072] 對(duì)空白組，轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組均進(jìn)行上述操作；
[0073] (4)熒光顯微鏡觀察：Heochst 33342用氪激光激發(fā)的紫外光，將產(chǎn)生熒光 (I -3, II -3, III-3)，而凋亡細(xì)胞將表現(xiàn)為更為明亮（II -3) ;PI用氬離子激光激發(fā)熒光， 死亡細(xì)胞產(chǎn)生熒光（I -2, II -2，III-2);結(jié)果如圖3所示。
[0074] 實(shí)施例5.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-143對(duì)細(xì)胞凋亡影響
[0075] 1.細(xì)胞樣品的制備：
[0076] (1)用胰酶消化細(xì)胞，收集到5mL離心管中；
[0077] (2) 1000rpm/min 離心 5min，棄掉上清液；
[0078] (3)加入預(yù)冷的PBS ImL并懸浮細(xì)胞，然后離心，棄掉并留少許上清液重要懸浮細(xì) 胞；
[0079] 2.細(xì)胞固定：
[0080] 加入ImL冰浴預(yù)冷70%乙醇，輕輕吹打細(xì)胞以混勻，4°C過(guò)渡；
[0081] 3. PI 染色：
[0082] (1)將固定好的細(xì)胞1000rpm/min離心5min，棄掉上清液；
[0083] (2)加入冰浴預(yù)冷的PBS洗2次；
[0084] (3)在離心管中加入PI染料并輕輕混勻，37°C避光溫浴30min ;
[0085] 4.流式檢測(cè)與分析：
[0086] 用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488nm波長(zhǎng)處檢測(cè)紅色熒光，同時(shí)檢測(cè)光散射情況。采 用適當(dāng)分析軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA含量分析和光散射分析，結(jié)果如圖4和5所示。
[0087] 實(shí)施例6. qRT-PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)
[0088] (1)總 RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄：使用 TIANGEN 公司的 RNAsimple Total RNA Kit 總 RNA 提取試劑盒（Cat. #DP419)提取細(xì)胞組織總RNA，具體操作參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行；將提取的 RNA 米用 TaKaRa 公司的 RrimeScript? RT reagent Kit (Cat. #RR037A)反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 第 一鏈，-20 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0089] (2)引物設(shè)計(jì)說(shuō)明：根據(jù)羊抗凋亡基因 BCL2(NCBI登錄號(hào)：JN036559. 1)和牛凋亡 基因 BAX(NCBI登錄號(hào)：NM_173894. 1)序列設(shè)計(jì)引物，引物信息見(jiàn)如下表：
[0090]

【權(quán)利要求】
1. 一種與奶山羊乳腺上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)的miRNA，其特征在于：該miRNA為miR-143， 其基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的miRNA，其特征在于：其前體基因序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. 權(quán)利要求1所述的miRNA在奶山羊育種中的應(yīng)用，其特征在于，抑制基因序列如SEQ ID NO. 1所示序列在奶山羊體內(nèi)的表達(dá)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，抑制基因序列如SEQ ID NO. 2所示的前體 序列在奶山羊體內(nèi)的表達(dá)。
【文檔編號(hào)】A01K67/027GK104498497SQ201410757938
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】王建民, 紀(jì)志賓, 王桂芝 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)