專利名稱：一種促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞發(fā)育及泌乳的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種促進(jìn)乳腺發(fā)育及泌乳的方法。
背景技術(shù)：
奶牛是畜牧養(yǎng)殖業(yè)中重要的經(jīng)濟(jì)動物之一，奶牛的產(chǎn)奶量和奶品質(zhì)是衡量養(yǎng)殖水 平和經(jīng)濟(jì)效益的重要標(biāo)準(zhǔn)。我國為奶牛養(yǎng)殖大國，存欄奶牛達(dá)1216萬頭，但奶牛的平均 年單產(chǎn)水平只有3884kg，美國的奶牛單產(chǎn)則可達(dá)7767kg，以色列為8615kg，料奶比可達(dá)到 1 3。產(chǎn)奶量低、乳脂和乳蛋白含量相對不高、產(chǎn)出投入比較低的是制約我國奶牛養(yǎng)殖業(yè) 發(fā)展的主要因素。依據(jù)《國家中長期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要》、《國家“十一五”科學(xué)技術(shù)發(fā)展規(guī)劃》 和《863計(jì)劃“十一五”發(fā)展綱要》，通過運(yùn)用各種生物信息學(xué)手段和基因操作技術(shù)，篩選出 影響泌乳性狀的重要功能基因，對促進(jìn)我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展具有重大的理論意義和實(shí)際應(yīng) 用價值。乳腺是重要的泌乳功能器官，乳腺內(nèi)基因表達(dá)水平受遺傳和環(huán)境因素的雙重調(diào)控。 泌乳重要功能基因的表達(dá)水平變化能夠調(diào)控乳腺的生長發(fā)育、分化和組織重建，以及乳汁 合成、分泌和運(yùn)輸?shù)戎匾纳磉^程。乳腺上皮細(xì)胞是泌乳的基本結(jié)構(gòu)和功能單位，通過研 究其內(nèi)泌乳相關(guān)基因的表達(dá)，可以為揭示乳腺特異性表達(dá)基因如何被激活、泌乳重要功能 基因如何起始和維持泌乳、調(diào)控乳汁組分提供理論依據(jù)。同時，有助于建立一種調(diào)控奶牛泌 乳重要功能基因表達(dá)水平并顯著提高產(chǎn)奶量的乳腺生物調(diào)控技術(shù)。目前奶牛功能基因組學(xué)研究處于起步階段，對影響牛健康、疾病、肉奶品質(zhì)相關(guān)基 因的功能研究是未來的研究重點(diǎn)。國內(nèi)對泌乳相關(guān)的奶牛功能基因的研究工作基本處于空 白狀態(tài)，國外也只有較少的研究報告，獲得的泌乳功能基因數(shù)量較少。采用現(xiàn)代功能基因組 學(xué)研究方法，來研究泌乳這一奶牛重要的生產(chǎn)指標(biāo)相關(guān)的基因，以及奶牛從飼料所獲得的 各種營養(yǎng)物質(zhì)同這些控制泌乳的重要基因之間的相互作用具有重要的意義?？蔀槟膛．a(chǎn)奶 性能的提高以及營養(yǎng)物質(zhì)的合理供給研究提供重要的技術(shù)理論依據(jù)和技術(shù)手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞發(fā)育及泌乳的方法。促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)發(fā)育及泌乳的方法按以下步驟進(jìn)行一、取荷斯坦牛泌乳期 組織樣并采用膠原酶_胰酶消化法分離上皮細(xì)胞，然后置于細(xì)胞生長培養(yǎng)液中培養(yǎng)3代，得 體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞；二、根據(jù)Kcnmal基因的mRNA序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增出Kcnmal 基因的全序列，然后與PGEM-T載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，獲得克隆載體 質(zhì)粒；三、pSV-β-Galactosidase Control Vector質(zhì)粒和克隆載體質(zhì)粒分別使用AgeI和 XbaI進(jìn)行雙酶切，回收所需目的片段，連接并構(gòu)建表達(dá)載體，再用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的 乳腺上皮細(xì)胞，使Kcnmal基因在體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞中過量表達(dá)，即完成奶牛乳腺上 皮細(xì)發(fā)育及泌乳的促進(jìn)；其中步驟一中細(xì)胞生長培養(yǎng)液由90ml的DMEM高糖培養(yǎng)基、IOml 的FBS (胎牛血清)和IOml濃度為50mg/ml的胰島素、100 μ 1 10萬單位/ml的青霉素和100 μ 1 10萬單位/ml的鏈霉素組成；步驟二中PCR擴(kuò)增所用上游引物為5' -GCACCGGTTG CTAGCTATGGCAAATGGTGGC-3 ‘，下游引物為 5 ‘ -GCTCTAGAGGCAGTGGATACACACATCAGAG-3 ‘， 而且在上下游引物的5'端分別添加了限制性內(nèi)切酶AgeI和XbaI的酶切位點(diǎn)。鉀大電導(dǎo)鈣活化通道亞家族Μ，α成員1 (potassium large conductance calcium-activated channel, subfamily M, alpha member 1,Kcnma 1)編石馬一禾中 BK 鉀離子 通道蛋白；它由兩個亞基組成，分別負(fù)責(zé)通道形成的α亞基和起調(diào)節(jié)作用的β亞基；細(xì)胞 內(nèi)鈣離子調(diào)節(jié)α和β亞基之間的相互作用；鉀通道通過膜的去極化或者提高細(xì)胞內(nèi)Ca2+ 濃度被激活，調(diào)節(jié)K+的運(yùn)輸；它也可以被細(xì)胞內(nèi)Mg2+激活；它的激活將緩沖細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度 和/或膜電位去極化，因此可以使膜電位復(fù)極化。本發(fā)明中Kcnmal基因在泌乳期奶牛乳腺中高表達(dá)，通過基因過表達(dá)實(shí)驗(yàn)和RNA干 擾實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平驗(yàn)證了 Kcnmal基因確實(shí)是能夠促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞發(fā)育以及乳產(chǎn)生 的重要功能基因。本發(fā)明中Kcnmal基因是奶牛乳腺中影響細(xì)胞增殖以及乳蛋白合成的重要功能基 因，在奶牛乳腺發(fā)育以及泌乳功能中起著重要的關(guān)鍵性作用；通過對Kcnmal基因的調(diào)控， 可以改變奶牛乳腺的泌乳機(jī)能，達(dá)到改變泌乳性狀，增加經(jīng)濟(jì)效益的目的；本發(fā)明也是首次 證明了 Kcnmal基因在乳腺中具有刺激乳腺發(fā)育及泌乳的功能，并可用于基因調(diào)控改變動 物生產(chǎn)性能等相關(guān)應(yīng)用。


圖1是具體實(shí)施方式
一中Kcnmal基因在體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞中過量表達(dá)細(xì) 胞酪蛋白及PSTAT5檢測圖；圖2是具體實(shí)施方式
一中Kcnmal基因在體外培養(yǎng)的乳腺上皮 細(xì)胞中過量表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞周期檢測圖，其中A為Kcnmal基因在體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞 中過量表達(dá)曲線，B為對照；圖3是具體實(shí)施方式
一中PCR擴(kuò)增出Kcnmal基因的全序列進(jìn)行 RNA干擾時間梯度曲線圖；圖4是具體實(shí)施方式
一中Kcnmal基因沉默后Weatern Blot檢 測圖；圖5是具體實(shí)施方式
一中Kcnmal基因沉默細(xì)胞的細(xì)胞周期檢測圖，其中A為Kcnmal 基因沉默細(xì)胞的細(xì)胞周期檢測曲線，B為對照。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的 任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)發(fā)育及泌乳的方法按以下步驟 進(jìn)行一、取荷斯坦牛泌乳期組織樣并采用膠原酶-胰酶消化法分離上皮細(xì)胞，然后置于細(xì) 胞生長培養(yǎng)液中培養(yǎng)3代，得體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞；二、根據(jù)Kcnmal基因的mRNA序列 設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增出Kcnmal基因的全序列，然后與pGEM_T載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 大腸桿菌DH5 α，獲得克隆載體質(zhì)粒；三、pSV- β -Galactosidase Control Vector質(zhì)粒和 克隆載體質(zhì)粒分別使用AgeI和XbaI進(jìn)行雙酶切，回收所需目的片段，連接并構(gòu)建表達(dá)載 體，再用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞，使Kcnmal基因在體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì) 胞中過量表達(dá)，即完成奶牛乳腺上皮細(xì)發(fā)育及泌乳的促進(jìn)；其中步驟一中細(xì)胞生長培養(yǎng)液 由90ml的DMEM高糖培養(yǎng)基、IOml的FBS(胎牛血清)和IOml濃度為50mg/ml的胰島素、100 μ 1 10萬單位/ml的青霉素和100 μ 1 10萬單位/ml的鏈霉素組成；步驟二中PCR擴(kuò)增 所用上游引物為 5 ‘ -GCACCGGTTGCTAGCTATGGCAAATGGTGGC-3 ‘，下游引物為 5 ‘ -GCTCTAGA GGCAGTGGATACACACATCAGAG-3‘，而且在上下游引物的5‘端分別添加了限制性內(nèi)切酶AgeI 和XbaI的酶切位點(diǎn)。本實(shí)施方式步驟一中細(xì)胞生長培養(yǎng)液，經(jīng)0. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌后，調(diào)節(jié) pH值為7. 2。本實(shí)施方式步驟二中轉(zhuǎn)化的過程a、冰上融化50 μ 1大腸桿菌DH5 α，加入5 μ 1 連接產(chǎn)物，混勻后于-20°C放置30min，然后置于42°C水浴中45秒，其間保持EP管靜止不 動；b、迅速取出放置于冰浴中2min，加入950 μ 1 LB液體培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)1. 5h ；c、 培養(yǎng)后3000r/min離心lOmin，棄去上清液，用200 μ 1 LB液體培養(yǎng)基重懸固體沉淀；d、取 100 μ 1涂布含有青霉素并涂有X-gal和IPTG的LB平板，吹干后，37°C培養(yǎng)12h觀察結(jié)果； e、培養(yǎng)12h后，在LB平板上挑取白色的菌落，接種于20ml含有青霉素的LB液體培養(yǎng)基中， 37°C震蕩培養(yǎng)12h。取陽性重組子20 μ 1，送北京華大基因有限公司測序，所得測序結(jié)果同Kcnmal基 因序列進(jìn)行比對，同源性為100%。本實(shí)施方式步驟三中轉(zhuǎn)染過程a、將2 X IO5個體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞加入6孔 細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁生長；b、滅菌離心管中混合預(yù)熱37°C的培養(yǎng)基400ul、重 組載體30ul，短暫振蕩后，加入脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑16ul，振蕩混勻，室溫孵育混合物IOminJl 去細(xì)胞培養(yǎng)基，將混合物短暫振蕩混勻，加入一個細(xì)胞培養(yǎng)孔中，37°C培養(yǎng)lh，每孔加入預(yù) 熱到37°C的無血清和抗生素培養(yǎng)基1. 5ml，置于5% C02、37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h ；c、換 成步驟一中細(xì)胞生長培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。本實(shí)施方式中Kcnmal基因在體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞中過量表達(dá)后，檢測體 外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞中乳蛋白合成能力的變化以及乳腺上皮細(xì)胞增殖能力的變化; Weatern Blot檢測結(jié)果如圖1所示，可見Kcnmal基因過表達(dá)的細(xì)胞酪蛋白表達(dá)能力明顯增 強(qiáng)，PSTAT5表達(dá)量增加；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果如圖2所示，可見Kcnmal基因過表 達(dá)的細(xì)胞分裂增殖更加活躍，更多的細(xì)胞處于分裂期；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Kcnmal基因過表達(dá) 使細(xì)胞酪蛋白合成能力增強(qiáng)(P < 0. 05)，并且Kcnmal基因過表達(dá)的細(xì)胞增殖活性增加(P < 0. 05)。本實(shí)施方式步驟二中PCR擴(kuò)增出Kcnmal基因的全序列進(jìn)行RNA干擾實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合 成3對干擾小RNA序列，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染乳腺上皮細(xì)胞后篩選最佳干擾序列、最佳干擾劑量 和最佳干擾時間；結(jié)果如圖3所示，使用干擾片作用24小時效果較好，當(dāng)目的基因被沉默后 檢測乳腺上皮細(xì)胞的增殖分化、酪蛋白產(chǎn)量和stat5信號通路啟動情況；從結(jié)果可以看出， Kcnmal基因沉默使細(xì)胞酪蛋白合成能力下降(P < 0. 05)，并且Kcnmal基因被干擾的細(xì)胞 增殖活性降低(P <0.05) ；Weatern Blot檢測結(jié)果如圖4所示，可見Kcnmal基因沉默的乳 腺上皮細(xì)胞酪蛋白合成量下降，PSTAT5表達(dá)量降低，這都表明此時乳腺上皮細(xì)胞的乳蛋白 合成能力下降；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果如圖5所示，可見Kcnmal基因沉默的乳腺上 皮細(xì)胞分裂增殖變得不活躍，處于分裂期的細(xì)胞減少。實(shí)驗(yàn)表明=Kcnmal基因是奶牛乳腺中影響細(xì)胞增殖以及乳蛋白合成的重要功 能基因，在奶牛乳腺發(fā)育以及泌乳功能中起著重要的關(guān)鍵性作用；通過對Kcnmal基因的
7調(diào)控，可以改變奶牛乳腺的泌乳機(jī)能，達(dá)到改變泌乳性狀，增加經(jīng)濟(jì)效益的目的；證明了 Kcnmal基因在乳腺中具有特定的勝利功能，并可用于基因調(diào)控改變動物生產(chǎn)性能等相關(guān)應(yīng)用。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟二中PCR擴(kuò)增的反 應(yīng)體系為25 μ L反應(yīng)體系，由下列成分組成
權(quán)利要求
一種促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞發(fā)育及泌乳的方法，其特征在于促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)發(fā)育及泌乳的方法按以下步驟進(jìn)行一、取荷斯坦牛泌乳期組織樣并采用膠原酶 胰酶消化法分離上皮細(xì)胞，然后置于細(xì)胞生長培養(yǎng)液中培養(yǎng)3代，得體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞；二、根據(jù)Kcnma1基因的mRNA序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增出Kcnma1基因的全序列，然后與pGEM T載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得克隆載體質(zhì)粒；三、pSV β GalactosidaseControl Vector質(zhì)粒和克隆載體質(zhì)粒分別使用AgeI和XbaI進(jìn)行雙酶切，回收所需目的片段，連接并構(gòu)建表達(dá)載體，再用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞，使Kcnma1基因在體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞中過量表達(dá)，即完成奶牛乳腺上皮細(xì)發(fā)育及泌乳的促進(jìn)；其中步驟一中細(xì)胞生長培養(yǎng)液由90ml的DMEM高糖培養(yǎng)基、10ml的FBS和10ml濃度為50mg/ml的胰島素、100μl 10萬單位/ml的青霉素和100μl 10萬單位/ml的鏈霉素組成；步驟二中PCR擴(kuò)增所用上游引物為5′ GCACCGGTTGCTAGCTATGGCAAATGGTGGC 3′，下游引物為5′ GCTCTAGAGGCAGTGGATACACACATCAGAG 3′，而且在上下游引物的5′端分別添加了限制性內(nèi)切酶AgeI和XbaI的酶切位點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞發(fā)育及泌乳的方法，其特征在于 步驟二中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為25 μ L反應(yīng)體系，由下列成分組成成分用量TaKaRa Ex Taq (5U/μ 1)0.25 μ 110XPCR Buffer (Mg2+Plus)5 μ 1 dNTP Mixture(各 2. 5mmol/L) 4 μ 1cDNA 模版1 μ 1上游引物(20ymol/L)1μ 1下游引物(20ymol/L)1μ 1滅菌三蒸水12. 75 μ 1PCR擴(kuò)增條件為94°C變性3min，94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸5min，共38個 循環(huán)，再72°C延伸10min，4°C保溫。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞發(fā)育及泌乳的方法，其特征 在于步驟二中連接的體系如下成分用量Kcnmal基因的全序列3. 0 μ LpGEM-T 載體l.OyL2 X Buffer5. 0 μ LT4連接酶l.OyL 。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞發(fā)育及泌乳的方法，其特征在于 步驟二中PCR擴(kuò)增出Kcnmal基因的全序列為gttgctagct atggcaaatg gtggcggcgg cggcggcggcggcggcggaggcagcagtct60tagaatgagc agcaatatcc acgcgaacca tctcagcctagacgcgtcctcctcctcctc120ttcttcctcc tcctcctctt cctcgtcgtc ctcggtccacgagcccaagatggatgcgct180catcatcccg gtgaccatgg aggtgccgtg cgacagccggggccaacggatgtggtgggc240tttcctggcc tcctccatgg tgactttctt cggcggcctcttcatcatcttgctctggag300gacgctcaagtacctgtggaCCgtttgCtgccactgcgggggcaaaacgaaggaggccca360gaagattaacaatggctcaagccaggcagatggcactctcaagccagtggatgaaaaaga420ggagacggtggcagccgaggtcggctggatgacctccgtgaaagactgggcgggggtgat480gatatctgcccagacgctgactggcagagtcctggttgtcttagtctttgctctcagcat540tggtgcacttgtaatatacttcatagattcgtcaaacccaatagaatcctgccagaattt600ctacaaagatttcacattacagatcgacatggcgttcaacgtattcttccttctctactt660tggcttgcggtttattgcagccaacgataagctatggttctggcttgaagtgaactctgt720ggtagatttcttcacggtccCCCCtgtgtttgtgtccgtgtacttaaacagaagttggct780tggtttgagatttttaagagctctcagactgatccagttttcagaaattttacagtttct840gaatatcctgaaaacaagtaattccatcaagctggtgaatctgctctccatttttatcag900cacgtggctcacagcagccgggttcatccatttggtggagaattcaggggacccatggga960aaatttccaaaacaaccaggctcttacctactgggaatgtgtctatctgctcatggtgac1020catgtccactgttggttacggggatgtttatgcaaaaaccacgctcgggcgtctcttcat1080ggtcttcttcatcctcgggggactggccatgtttgccagctacgtccctgaaatcataga1140gttaataggaaaccgcaagaaatacgggggctcctatagtgcggttagtggaagaaagca1200catagtggtctgtggacacatcacactggagagcgtttccaacttcctgaaggactttct1260gcacaaggaccgggacgatgtcaatgtggagatcgtctttcttcacaacatctcccctaa1320cctggagctggaagccttgttcaaacgacattttactcaggtggagttttatcagggttc1380agtcctcaatccacatgatcttgcaagagtcaagatagagtcagcagatgcgtgcctgat1440ccttgccaataagtactgcgcagaccccgatgctgaagatgcctccaacatcatgagagt1500catctccataaagaactaccacccgaagataagaatcatcactcagatgctgcagtatca1560caataaggcccatctgctaaacatcccgagctggaattggaaagagggggatgatgcaat1620ctgcctcgcagaactgaagctggggttcatcgcccagagctgcctggctcaagggctctc1680caccatgctcgccaacctcttctccatgaggtcattcataaagattgaggaagacacgtg1740gcagaaatactacttggaaggagtctcaaatgaaatgtacacagaatatctctccagtgc1800CttCgtgggtctgtccttcccgactgtttgtgagctgtgttttgtgaagctcaagcttct1860catgatagccattgagtacaagtccgccaatcgagagagccgtatattaattaatcctgg1920aaaccatcttaagatccaagaaggtactttaggatttttcatcgcaagtgatgccaaaga1980agttaaaagggcatttttttactgcaaggcctgtcatgatgacatcacggatcccaaaag2040gataaaaaaatgcggctgcaaacggcttgaagatgaacagccgtcgacactgtcacccaa2100aaaaaagcagcgcaacggaggcatgcggaactcacccagctcgtcgcccaagctgatgag2160gcatgaccccttgttaattcctggcaatgatcagattgacaacatggactccaatgtgaa2220gaaatatgactctactgggatgtttcactggtgtgcgcccaaggagatagagaaagtcat2280cctgacccgaagtgaagctgccatgaccgtcctgagcggccacgtggtggtctgcatctt2340tggcgacgtcagctctgccctgattggccttcggaacctggtgatgccgctccgtgccag2400caactttcactaccacgagctcaagcacatCgtgtttgtgggctccatcgagtacctcaa2460gcgggaatgggagacactgcataacttccccaaggtttccatcttgcctggtacgccatt2520aagtcgggctgatttaagggccgtcaacatcaacctctgtgacatgtgcgttatcctgtc2580agccaatcagaataatattgatgatacttcgctgcaggacaaggaatgcatcttggcgtc2640actcaacatcaaatctatgcagtttgatgacagcatcggggtcttgcaggctaattccca2700agggttcacacctccaggaatggaccgatcctcaccagataacagcccggtacatgggat2760gttacgccagccctccatcactactggggtcaacatccccatcatcactgaactagtgaa2820cgatactaatgttcagtttttggaccaagacgatgacgatgaccccgacacagaactgta2880cctcacgcagccgtttgcatgtgggacagcgttcgccgtcagtgtcctggattcactcat2940gagcgcaacatacttcaatgacaacatccttaccctgatacggaccctggtgactggagg3000agccacaccagagctggaggctttgatcgctgaggagaatgcactccgcgggggctacag3060caccccccagacgctggccaacagggaccgCtgCCgtgtggcccagttagcgctgctgga3120CgggCCCtttgcggacctgggggatggtggttgttatggtgatctgttctgcaaagctct3180gaaaacatacaatatgctttgttttggaatttatcggctgagagatgctcacctcagcac3240ccccagccagtgcacgaagaggtatgtcatcaccaaccccccgtacgagtttgagctcgt3300gccgacggacctgatcttctgcttaatgcagtttgaccacaacgccggccagtcccgggc3360cagcctctcccattcctcccactcgtcccagtcctctagcaagaagagctcctccgtcca3420ctccatcccatccacggcaaaccgacagaaccggcccaagtcccgggagtcccgagacaa3480acagaagtacgtgcaggaagagcggctctgatgtgtgtatccactgcctc3530。全文摘要
一種促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞發(fā)育及泌乳的方法，它涉及一種促進(jìn)乳腺發(fā)育及泌乳的方法。方法一、體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞；二、設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增出Kcnma1基因的全序列，然后與pGEM-T載體進(jìn)行連接，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，得克隆載體質(zhì)粒；三、pSV-β-Galactosidase Control Vector質(zhì)粒和克隆載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，連接并構(gòu)建表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞，使Kcnma1基因在體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞中過量表達(dá)，即完成。本發(fā)明中Kcnma1基因在泌乳期奶牛乳腺中高表達(dá)，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Kcnma1基因確實(shí)是能夠促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞發(fā)育以及乳產(chǎn)生的重要功能基因。
文檔編號C12N5/10GK101962645SQ201010263328
公開日2011年2月2日 申請日期2010年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月26日
發(fā)明者侯曉明, 李慶章, 林葉, 高學(xué)軍 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)