本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是甘藍(lán)型油菜黃籽新種質(zhì)資源的獲取技術(shù)和鑒定的方法。

背景技術(shù)：

黃籽油菜具有相對含油量高、菜籽油品質(zhì)好、菜籽粕營養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)，選育黃籽油菜已成為當(dāng)前油菜育種的主要目標(biāo)之一，成為提高種子含油量、改進(jìn)油菜品質(zhì)的一條重要途徑。白菜型油菜和芥菜型油菜均有不少黃籽品種，且黃籽性狀穩(wěn)定。而甘藍(lán)型油菜不存在天然黃籽種質(zhì)，黃色種皮基因資源匱乏。目前培育出的黃籽甘藍(lán)型油菜均來自蕓苔屬內(nèi)種間雜交，還未見通過屬間雜交獲得黃籽甘藍(lán)型油菜的報(bào)道，且現(xiàn)有獲得的屬內(nèi)起源的甘藍(lán)型油菜黃籽性狀存在籽色不純，遺傳不穩(wěn)定的問題。白芥屬白芥種與甘藍(lán)型油菜同屬十字花科，其種皮顏色為純黃色，且遺傳穩(wěn)定。因此，引進(jìn)白芥屬黃籽基因，對拓寬甘藍(lán)型油菜黃籽性狀遺傳基礎(chǔ)，選育籽色較純、遺傳穩(wěn)定的黃籽甘藍(lán)型油菜將具有非常重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種種子含油量高、黃色種皮遺傳穩(wěn)定的黃籽甘藍(lán)型油菜的獲取方法。

本發(fā)明技術(shù)方案包括以下步驟：

1)通過蕓苔屬甘藍(lán)型油菜與白芥屬白芥野生種原生質(zhì)體融合，獲得屬間雜種F₁；

2)將屬間雜種F₁與親本蕓苔屬甘藍(lán)型油菜回交，獲得BC₁；

3)將BC₁與親本蕓苔屬甘藍(lán)型油菜再回交，獲得BC₂；

4)從BC₂自交后代中篩選獲得褐黃籽單株，獲得BC₂F₁；

5)將BC₂F₁進(jìn)一步自交，獲得具有白芥黃籽表現(xiàn)型的易位系BC₂F₂，即黃籽甘藍(lán)型油菜種質(zhì)資源。

通常黃籽甘藍(lán)型油菜種質(zhì)資源的創(chuàng)建選自同屬的不同種進(jìn)行雜交，而本發(fā)明雜交的兩個(gè)親本來自不同屬，該遠(yuǎn)緣雜交可以實(shí)現(xiàn)不同種間、屬間甚至親緣關(guān)系更遠(yuǎn)的物種間的雜交突破種屬界限，擴(kuò)大遺傳變異，從而創(chuàng)造新的變異類型或新物種。但隨著親緣關(guān)系差距的加大，不同種屬的物種雜交常表現(xiàn)雜交不親和性。原生質(zhì)體融合技術(shù)可避免受精作用中種的特異性配子識別反應(yīng)，打破遠(yuǎn)緣雜交中的有性不親和界限。通過該技術(shù)可克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性，將十字花科不同屬優(yōu)良性狀導(dǎo)入現(xiàn)有甘藍(lán)型油菜栽培品種中，實(shí)現(xiàn)優(yōu)良基因的屬間轉(zhuǎn)移。

本發(fā)明以白芥屬白芥野生種與甘藍(lán)型油菜經(jīng)原生質(zhì)體融合獲得屬間雜種F₁，并用親本甘藍(lán)型油菜回交至BC₂，從BC₂自交后代中篩選獲得褐黃籽單株，該單株進(jìn)一步自交，篩選獲得6個(gè)遺傳穩(wěn)定、不同程度黃籽表現(xiàn)型株系，經(jīng)細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，這6個(gè)黃籽材料均為帶有白芥黃籽基因的易位系材料。使用丹麥FOSS公司TR-3700近紅外分析儀測定黃籽株系的含油量，表明本發(fā)明獲取的黃籽單株含油量明顯高于白芥屬白芥型，較蕓苔屬甘藍(lán)型提高1.7-6％。

由于通過遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)獲得的雜種及其回交后代中附加有大量外源植物染色體，遺傳不穩(wěn)定，難以在育種直接應(yīng)用，因此有必要通過細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)的方法對獲得的后代進(jìn)行鑒定，以篩選遺傳穩(wěn)定的易位系，為育種應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。原位雜交(GISH)和分子標(biāo)記鑒定已成為外源遺傳物質(zhì)鑒定的有效方法。GISH技術(shù)利用核酸序列間的同源互補(bǔ)，已被廣泛用于分析植物基因組結(jié)構(gòu)、確定外源DNA的插入位點(diǎn)及定量分析、鑒定外源染色體片斷、分析植物雜交品種染色體組成來源以及近緣種屬或品系的比較研究。分子標(biāo)記技術(shù)(包括RFLP、RAPD、SSR、AFLP等)可在DNA水平上迅速、有效的反映生物個(gè)體之間的差異，因而可應(yīng)用于異染色體系鑒定及輔助育種。

本發(fā)明針對分析該黃籽甘藍(lán)型油菜來源的特殊性，對雜種后代減數(shù)分裂進(jìn)行GISH分析，發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜的染色體在回/自交各個(gè)世代中均能正常配對和分離，部分白芥染色體與甘藍(lán)型油菜染色體形成三價(jià)體，可能發(fā)生異源染色體重組；BC₂F₂黃籽材料染色體數(shù)目與正常甘藍(lán)型油菜相同，無雜交信號，排除該材料是異附加系或置換系的可能性。微衛(wèi)星核心序列引物33.6擴(kuò)增結(jié)果證明，在黃籽后代基因組中存在白芥基因組特異序列。類黃酮基因引物TT2-2獲得一致結(jié)果，即黃籽后代中具有白芥DNA序列；同時(shí)獲得黃籽特異性分子標(biāo)記Sa1，為分子標(biāo)記輔助育種奠定了基礎(chǔ)。結(jié)合細(xì)胞學(xué)鑒定結(jié)果，本發(fā)明可以確認(rèn)獲得的黃籽后代株系是帶有白芥DNA序列的易位系。

附圖說明

圖1為本發(fā)明技術(shù)方案的流程圖。

圖2為本發(fā)明獲得的6個(gè)白芥屬來源的甘藍(lán)型油菜黃籽株系種子照片圖。

具體實(shí)施方式

一、獲取黃籽甘藍(lán)型油菜種質(zhì)資源的步驟，如圖1所示：

1、白芥屬白芥野生種與蕓苔屬甘藍(lán)型油菜的原生質(zhì)體融合及植株再生：

將白芥屬白芥野生種種子和蕓苔屬甘藍(lán)型油菜種子分別經(jīng)70％(v/v)酒精消毒1min、2％(v/v)次氯酸鈉消毒15min，無菌水沖洗3遍后，接種于MS培養(yǎng)基，于25℃光照條件下培養(yǎng)16h。

分別取3～4周齡葉片，分別分離出白芥屬白芥型油菜原生質(zhì)體和蕓苔屬甘藍(lán)型油菜原生質(zhì)體。

將白芥屬白芥型油菜原生質(zhì)體和蕓苔屬甘藍(lán)型油菜原生質(zhì)體以1∶2體積比混合至終濃度≥5×10⁵個(gè)/mL后，進(jìn)行電融合。

將電融合的原始質(zhì)體于CR培養(yǎng)基中25℃暗培養(yǎng)，2～3周后形成的愈傷組織轉(zhuǎn)至固體培養(yǎng)基(MS+10g/l蔗糖+20g/l甘露醇+250mg/l甘酪素水解物+6g/l瓊脂+0.5g/l NAA+0.5g/l 6-BA+1g/l TDZ)，25℃16h光照條件下培養(yǎng)。4周后轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+20g/l蔗糖+250mg/l甘酪素水解物+10g/l瓊脂+10g/l 6-BA+0.04g/l GA₃)。3～4周后生根后轉(zhuǎn)到無激素的MS培養(yǎng)基上生長，最終獲得7棵屬間雜種F1。

2、體細(xì)胞雜種后代的黃籽篩選：

將獲得的屬間雜種F₁與蕓苔屬甘藍(lán)型油菜回交至BC₂。

從BC₂自交后代中篩選褐黃籽單株，即得BC₂F₁。

將BC₂F₁進(jìn)一步自交，篩選獲得6個(gè)遺傳穩(wěn)定、不同程度黃籽表現(xiàn)型株系BC₂F₂。

上述黃籽株系BC₂F₂繼續(xù)自交并無分離，相關(guān)基因已純合并穩(wěn)定遺傳。

3、黃籽甘藍(lán)型油菜的細(xì)胞學(xué)鑒定：

本發(fā)明按試劑盒(Catalogue No.976776，Roche，德國)標(biāo)記白芥基因組為探針，對雜種后代減數(shù)分裂和根尖細(xì)胞染色體制片進(jìn)行基因組原位雜交(GISH)，使用Olympus BX51熒光顯微鏡觀察染色體和雜交信號，對于分散較好的細(xì)胞在不同的濾光片進(jìn)行拍照，用Image-Pro Plus Version 5.0軟件進(jìn)行圖片合成和處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜的染色體在回/自交各個(gè)世代中均能正常配對和分離，而白芥染色體多以單價(jià)體形式存在，部分白芥染色體會與甘藍(lán)型油菜染色體形成三價(jià)體，可能發(fā)生異源染色體重組，為易位系的產(chǎn)生奠定基礎(chǔ)。BC₂F₂黃籽材料根尖細(xì)胞和減數(shù)分裂細(xì)胞的GISH鑒定顯示，獲得的黃籽材料染色體數(shù)目與正常甘藍(lán)型油菜相同，無雜交信號，排除該材料是異附加系或置換系的可能性。

4、黃籽甘藍(lán)型油菜的分子標(biāo)記鑒定：

本發(fā)明參考Somers(2002)的研究結(jié)果，利用微衛(wèi)星核心序列33.6引物(AGGGCTGGAGG)對黃籽后代進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物于9％聚丙烯酰胺凝膠電泳上檢測，結(jié)果表明黃籽后代的基因組中存在與白芥相同的特異序列(300bp)。同時(shí)根據(jù)擬南芥類黃酮合成相關(guān)基因設(shè)計(jì)引物對黃籽后代進(jìn)行PCR鑒定，其中TT2-2引物(正向序列為：5′-CAGAATCTATTCTCAACACAACAC-3′，反向序列為：5′-TCTAGATAWTAYTWGTAATTAGAAG-3′)的擴(kuò)增結(jié)果也表明：黃籽后代中存在白芥特異片段。將PCR擴(kuò)得的白芥特異條帶經(jīng)TIANgel MidiPurification Kit(QIAGEN)進(jìn)行切膠回收、純化，連接pMD19-TVector(TaKaRa)，熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，進(jìn)行Amp抗性和X-gal/IPTG藍(lán)白斑篩選。選白色菌落進(jìn)行菌落PCR，結(jié)果為陽性的菌落進(jìn)行LB液體培養(yǎng)，堿裂解法提取質(zhì)粒。以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR檢測。選取含陽性質(zhì)粒的菌液送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。根據(jù)TT2-2擴(kuò)增特異產(chǎn)物測序結(jié)果設(shè)計(jì)的引物Sa1：

正向序列為5′-GAAGTAGTAGGTGGAAAGC-3′，

反向序列為5′-AAGGCAGTAAGGATGTAA-3′

在白芥和黃籽后代中擴(kuò)增的特異產(chǎn)物具有一致性。

5、黃籽甘藍(lán)型油菜的品質(zhì)分析：

如圖2所示，白芥屬白芥野生種(圖2中標(biāo)記：白芥)具有黃籽性狀，籽粒顏色淡黃色。

回交親本蕓苔屬甘藍(lán)型油菜(圖2中標(biāo)記：揚(yáng)油6號)籽粒顏色為褐色。

在回交后代BC₂F₂中篩選出多個(gè)具有黃籽或趨向黃籽性狀的株系，籽色顏色從紅偏黃到鮮黃各個(gè)梯度均有如圖2中標(biāo)記D244-18、D244-52、D244-6、D255-3、D246-5、D211-1。

本發(fā)明使用丹麥FOSS公司TR-3700近紅外分析儀測定黃籽株系的含油量，表明黃籽單株含油量明顯提高，黃籽株系D244-18、D244-52、D244-6、D255-3、D246-5、D211-1的含油量分別為43.32％、43.35％、47.60％、42.94％、42.79％、44.57％。而揚(yáng)油6號和白芥的含油量分別為41.63％和39.04％。結(jié)果表明：本發(fā)明獲取的黃籽材料含油量較蕓苔屬甘藍(lán)型油菜提高1.7-6％。