油菜雙單倍體誘導(dǎo)系規(guī)?；瘎?chuàng)造油菜遺傳穩(wěn)定群體的方法
【專利摘要】本發(fā)明油菜雙單倍體誘導(dǎo)系規(guī)?；瘎?chuàng)造油菜遺傳穩(wěn)定群體的方法，包括：1）根據(jù)研究需求選擇目標(biāo)性狀;2)根據(jù)目標(biāo)性狀選擇具有該目標(biāo)性狀差異較大的兩個親本材料;3）兩個親本材料雜交；4）用油菜雙單倍體誘導(dǎo)系給親本雜交F1代授粉；4)誘導(dǎo)后代遺傳穩(wěn)定性鑒定；5）誘導(dǎo)后代目標(biāo)性狀調(diào)查形成遺傳穩(wěn)定的遺傳群體。本發(fā)明可在油菜3個栽培種（甘藍型油菜（2n=38）、白菜型油菜(2n=20)、芥菜型油菜（2n=36））中都可運用，可以快速（3代）、規(guī)?；@得遺傳穩(wěn)定的DH（Double Haploid）群體，對油菜基礎(chǔ)研究特別是遺傳作圖群體用于基因定位、基因精細定位、QTL分析具有明顯的促進作用，降低油菜基礎(chǔ)研究的周期和人力、物力投入。
【專利說明】
油菜雙單倍體誘導(dǎo)系規(guī)?；瘎?chuàng)造油菜遺傳穩(wěn)定群體的方法
[0001 ]
技術(shù)領(lǐng)域： 本發(fā)明與農(nóng)業(yè)有關(guān)，特別與油菜雙單倍體誘導(dǎo)系規(guī)模化創(chuàng)造油菜遺傳穩(wěn)定群體即DH 群體的方法有關(guān)。
[0002]
【背景技術(shù)】： 油菜是我國主要的油料作物，包括3個栽培種，甘藍型油菜(jSrassica /ja/ws，蕓苔(aa， n=10)與甘藍(cc，n=9)通過自然種間雜交后雙二倍化進化而來的一種復(fù)合種，根據(jù)染色體 來源判斷為四倍體，2n=38);白菜型油菜(jSrassia caspesiris 包括原產(chǎn)中國的蕓苔和 油白菜。中國又稱小白菜、矮油菜、甜油菜等。染色體組為aa，n=10,根據(jù)來源染色體組來源 判斷為二倍體，2]1=20);芥菜型油菜(1^^88；[03加11063，由蕓薹(33，11=10)和黑芥(1313，11=8) 通過自然種間雜交后雙二倍化進化而來的一個復(fù)合種，根據(jù)染色體來源判斷為四倍體，2n= 36)0
[0003] 在油菜中開展基礎(chǔ)研究，特別是針對目標(biāo)性狀(含油率、油酸、芥酸、株高、生育期、 光葉等性狀)進行基因克隆或連鎖標(biāo)記篩選，需要對目標(biāo)性狀進行遺傳群體構(gòu)建，搭建遺傳 作圖群體，便于基因定位或QTL掃描，因為構(gòu)建遺傳作圖群體的需求不同，群體個體數(shù)目要 求也不一致，初步定位需要遺傳穩(wěn)定(DH群體)單株200-1000個，精細定位需要2000個以上 的穩(wěn)定遺傳單株。油菜遺傳群體構(gòu)建一般采用DH群體或重組自交系(F2:3家系），DH系依賴 油菜小孢子離體培養(yǎng)技術(shù)，更依賴油菜材料的基因型，很多材料基因型不適合大規(guī)模小孢 子培養(yǎng)。不適合小孢子培養(yǎng)就選擇重組自交系(F2:3家系），先獲得F2,然后每個F2單株進行 株系種植，在獲得F3，F(xiàn)3再以株系種植，一直選擇具有目標(biāo)性狀的株系種植，直到每個株系 穩(wěn)定遺傳不再分離，一般情況下重組自交系群體構(gòu)建需要8-10年的時間，才能構(gòu)建起適合 遺傳作圖的群體。油菜小孢子立體培養(yǎng)也需要3-4年的時間才能建立起來，而且對小孢子培 養(yǎng)技術(shù)和實驗室研究條件有嚴格的要求。
[0004]目前，在油菜中還未有誘導(dǎo)系或雙單倍體誘導(dǎo)系的報道。所謂"誘導(dǎo)系"是指，用該 植物作為父本用其花粉對同類植株授粉，能誘導(dǎo)同類植株(母本)產(chǎn)生相應(yīng)的效應(yīng)，如產(chǎn)生 單倍體、雙單倍體(DH系)等。在植物中運用誘導(dǎo)系進行新品種選育最多的是玉米，但玉米中 的誘導(dǎo)系也只是單倍體誘導(dǎo)系。最早出現(xiàn)的玉米單倍體誘導(dǎo)系為stock6,該誘導(dǎo)系只能誘 導(dǎo)玉米產(chǎn)生單倍體，然后單倍體植株再進行人工染色體加倍形成純合二倍體(雙單倍體）， 且誘導(dǎo)效率較低，一般誘導(dǎo)效率在10%以下（以收獲種子中獲得單倍體數(shù)計算）。

【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明的目的為了提供一種能方便、快速、高效，只需3代(2年或3年)獲得穩(wěn)定的油菜 株系(DH系），提高油菜DH群體構(gòu)建的效率、降低油菜DH群體構(gòu)建難度，同時能極大地滿足油 菜基礎(chǔ)研究的需求的油菜雙單體誘導(dǎo)系規(guī)?；瘎?chuàng)造油菜DH群體的方法。
[0005]本發(fā)明的目的是這樣來實現(xiàn)的： 本發(fā)明油菜雙單倍體誘導(dǎo)系規(guī)?；瘎?chuàng)造油菜遺傳穩(wěn)定群體(DH群體)的方法，包括如下 步驟： 1) 對具有目標(biāo)性狀(含油率、油酸、芥酸、株高、生育期、光葉等性狀1項或多項)差異明 顯的2個遺傳穩(wěn)定油菜進行人工去雄雜交，并收獲雜交后代Fi種子； 2) 對上述步驟1)中雜交?:植株種植，在現(xiàn)蕾初期進行化學(xué)殺雄;根據(jù)化學(xué)殺雄劑不同 或油菜材料不同提前進行濃度摸索和比較試驗，保證化學(xué)殺雄徹底，采用化學(xué)殺雄劑為苯 磺隆或戊炔草胺，其作用濃度為30-150ppm; 3) 在油菜花期，利用油菜雙單倍體誘導(dǎo)系對上述步驟2)中化學(xué)殺雄后的雜交Fi植株進 行人工授粉，或?qū)⒂筒穗p單倍體誘導(dǎo)系與上述步驟2)化學(xué)殺雄雜交h植株種植在一個隔離 網(wǎng)室，采用壁蜂輔助授粉，接受授粉的母體植株至少在100株以上； 4) 對上述步驟3)中油菜雙單倍體誘導(dǎo)系授粉后代進行單株種植，苗期利用流式細胞儀 鑒定倍性，淘汰多倍體、單倍體或具有油菜雙單倍體誘導(dǎo)系顯性性狀特征植株，選擇正常育 性，正常倍性植株，單株套袋自交，選擇套袋自交單株數(shù)在5000株以上； 5) 對上述步驟4)中單株自交后代進行株系種植，調(diào)查株系形態(tài)一致性，并通過分子標(biāo) 記(SSR或S R A P )鑒定株系一致性及穩(wěn)定性； 6) 上述步驟5)中所鑒定的所有遺傳穩(wěn)定株系(至少在2000個株系以上)再進行目標(biāo)性 形狀(含油率、油酸、芥酸、株高、生育期、光葉等性狀1項或多項）的統(tǒng)計，分析目標(biāo)性狀(含 油率、油酸、芥酸、株高、生育期、光葉等性狀1項或多項)是否符合正態(tài)分布； 7) 上述步驟6)中所有遺傳穩(wěn)定株系，即DH群體，滿足目標(biāo)性狀(含油率、油酸、芥酸、株 高、生育期、光葉等性狀1項或多項）正態(tài)分布，確定這些DH群體構(gòu)建合格，用于油菜目標(biāo)性 狀的遺傳作圖、目標(biāo)性狀基因的定位、QTL分析、以及目標(biāo)性狀與基因的關(guān)聯(lián)分析等； 上述步驟3)中油菜雙單倍體誘導(dǎo)系的選育方法如下： (1) 選育具有孤雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系： ① 將兩個油菜親本材料雜交Fi代種子在培養(yǎng)基上用染色體加倍誘導(dǎo)劑進行人工染色 體加倍獲得加倍后的Fi代植株； ② 加倍后的h代植株進行自交或強制自交獲得內(nèi)代，對F2代進行田間種植觀察，并鑒定 每個單株的育性，選擇可育后代自交獲得F 3代，對F3代進行純合度鑒定，通過形態(tài)、細胞學(xué)以 及分子標(biāo)記鑒定，對后代DNA進行聚合酶鏈反應(yīng)擴增，電泳觀察每個特異引物擴增下單株的 DNA帶型及條帶數(shù)目，顯示每個單株都是兩個親本的雜交后代，每個單株之間分子標(biāo)記圖譜 一致，說明這些單株是純合系一早代穩(wěn)定系； ③ 獲得的早代穩(wěn)定系與至少10個油菜常規(guī)純合穩(wěn)定系進行正反交，F(xiàn)i代、F2R鑒定早 代穩(wěn)定系的遺傳特性，即是否有孤雌生殖特性;上述正反交，如有Fi分離，^代出現(xiàn)部分穩(wěn)定 株系，對應(yīng)的早代穩(wěn)定系是具有孤雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系； (2) 選育攜帶顯性遺傳性狀、具有孤雌遺傳特性且倍性遺傳穩(wěn)定的多倍體油菜： ① 具有孤雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系與具有顯性性狀油菜雜交(如顯性矮桿、紫葉、 花葉、黃葉、高芥酸等性狀），得到雜交?:代種子，上述雜交FHf種子在培養(yǎng)基上用染色體加 倍誘導(dǎo)劑進行人工染色體加倍，得到加倍后的帶顯性性狀的^植株； ② 對加倍的帶顯性性狀的Fi植株，通過顯微觀察或流式細胞儀進行染色體倍性鑒定， 選擇帶顯性性狀的多倍體的植株，淘汰非正常加倍株、非整倍體植株、以及不帶顯性性狀加 倍植株;帶顯性性狀的多倍體的植株主要是倍性遺傳穩(wěn)定、結(jié)實性好、具有孤雌生殖遺傳特 性、帶顯性性狀（如顯性矮桿、紫葉、花葉、黃葉、高芥酸等性狀）的六倍體或八倍體油菜植 株； (3)油菜雙單倍體誘導(dǎo)系鑒定及誘導(dǎo)能力測定： ① 倍性遺傳穩(wěn)定、具有孤雌生殖遺傳特性、帶顯性性狀的多倍體植株中的顯性性狀能 去除測交后代中產(chǎn)生的雜交株，如果測交后代中出現(xiàn)顯性性狀植株、或非整倍體植株，說明 該植株是多倍體植株和母本雜交產(chǎn)生的，去除該植株； ② 上述單株測交后代如果出現(xiàn)全不育、為正常倍性(二倍體或四倍體)油菜、且不帶顯 性性狀，說明該測交后代對應(yīng)的父本基因未進入測交后代中，顯性多倍體植株為油菜雙單 倍體誘導(dǎo)系； 本發(fā)明油菜DH系或遺傳穩(wěn)定群體，可用于遺傳圖譜構(gòu)建、QTL定位或精細定位，利用該 方法可規(guī)?；⒖焖?、方便獲得穩(wěn)定遺傳的作圖或定位群體，保證遺傳圖譜構(gòu)建、QTL定位或 精細定位的可靠性。采用本發(fā)明獲得油菜遺傳穩(wěn)定群體借助了油菜雙單倍體誘導(dǎo)系能誘導(dǎo) 母體植株在F1代發(fā)生孤雌生殖，在^代形成穩(wěn)定的雙單倍體個體，F(xiàn) 3代進行穩(wěn)定性、一致性 鑒定，獲得穩(wěn)定遺傳后代。
[0006]上述獲得油菜雙單倍體誘導(dǎo)系是將兩個親本材料雜交FHf種子或具有孤雌生殖 遺傳特性的早代穩(wěn)定系與具有顯性性狀油菜雜交得到的雜交Fi代種子在培養(yǎng)基上用染色 體加倍誘導(dǎo)劑進行人工染色體加倍，具體方法如下： 1) 用純度為75%酒精進行種子表面消毒25-40秒，用0.1%升汞消毒12-17分鐘，然后用無 菌水將種子表面的升汞沖洗干凈，用無菌紙將種子表面的水分吸干，然后將種子接種在第 一培養(yǎng)基上； 2) 讓種子在第一培養(yǎng)基上生根發(fā)芽，培養(yǎng)條件:溫度23-251，白天光照12-16小時，光 照強度2000-3000勒克斯，夜晚暗培養(yǎng)8-12小時，待植株長到1 一2片真葉時，從下胚軸處剪 下植株繼續(xù)在第二培養(yǎng)基上生長； 3) 將剪下的植株繼續(xù)插入第二培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待有側(cè)芽分化后，將側(cè)芽及植株轉(zhuǎn) 入第三培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)； 4) 生根培養(yǎng)二周后，植株長出粗壯的根后，將植株在室溫?zé)捗?-7天，取出植株將植株 上的培養(yǎng)基用自來水沖洗干凈，并在浸泡緩沖液中浸泡15-30分鐘后移栽到溫室中，溫室 溫度16 QC-25QC，相對濕度60-80%，能保證移栽成活率在95%以上； 上述的第一培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： -MS培養(yǎng)基 1L 6_芐基腺嘌呤 0.5-1.5mg 染色體加倍誘導(dǎo)劑 30-70mg 鹿糖 20-30g 瓊脂 8 一10g， 第一培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， 上述的第二培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L 6_芐基腺嘌呤 0.5-lmg 染色體加倍誘導(dǎo)劑 20-40mg 鹿糖 20-30g 瓊脂 8 一10g， 第二培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， 上述的第三培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L α-蔡乙酸 0.03-0.5mg 染色體加倍誘導(dǎo)劑 5-20mg 鹿糖 20-30g 瓊脂 8 一10g， 第三培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， 上述的浸泡緩沖液由以及下配比的組分組成： 水 1L 易?；蚩寺?0.6-1.2g α-萘乙酸 0.5-lmg。
[0007] 油菜雙單倍體誘導(dǎo)系能直接誘導(dǎo)油菜產(chǎn)生雙單倍體后代，無需進行人工染色體加 倍來獲得純合系;且誘導(dǎo)效率高，最高可達1〇〇%，一般的誘導(dǎo)效率都在50%以上。
[0008] 雙單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)母體植株產(chǎn)生雙單倍體的主要原理是:誘導(dǎo)系能誘導(dǎo)母體植 株，大孢子生殖細胞(卵細胞)產(chǎn)生孤雌生殖效應(yīng)，且卵細胞能進行染色體加倍，即卵細胞孤 雌生殖產(chǎn)生的后代就雙單倍體。本發(fā)明可以快速(3代，2年）、高效、規(guī)模化(2000個遺傳穩(wěn)定 株系以上)獲得DH群體;本發(fā)明可在油菜3個栽培種(甘藍型油菜（2n=38)、白菜型油菜(2n= 20)、芥菜型油菜（2n=36))中都可運用，對油菜基礎(chǔ)研究特別是遺傳作圖群體同于基因定 位、基因精細定位、QTL分析具有明顯的促進作用，降低油菜基礎(chǔ)研究的周期和人力、物力投 入。
[0009] 上述的染色體加倍誘導(dǎo)劑采用秋水仙素、氟樂靈、氨磺樂靈中的至少一種。
[0010] 本發(fā)明方法可以方便、快速、規(guī)?；糜谟筒诉z傳穩(wěn)定群體(DH群體)構(gòu)建，可以在 2年或3代的時間內(nèi)、不借助油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系獲得遺傳穩(wěn)定群體(DH群體），大大節(jié) 約油菜基礎(chǔ)研究的時間周期。
[0011] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點： 1、 該方法方便易于掌握，無須繁瑣的油菜小孢子離體培養(yǎng)技術(shù)； 2、 該方法能快速獲得油菜遺傳穩(wěn)定群體(DH系），最快3代(2年)就能獲得； 3、 該方法能規(guī)?；@得油菜遺傳穩(wěn)定群體(DH系），最少能獲得2000個株系以上的穩(wěn)定 群體，還可根據(jù)需要無限擴大； 4、 本發(fā)明可以用在3個油菜栽培種遺傳穩(wěn)定群體(DH群體)的構(gòu)建，降低油菜基礎(chǔ)研究 周期，降低人力物力成本、提高效率； 5、 油菜雙單倍體誘導(dǎo)系直接誘導(dǎo)母體植株產(chǎn)生雙單倍體，誘導(dǎo)甘藍型油菜、芥菜型油 菜產(chǎn)生純合四倍體(基因純合系）、誘導(dǎo)白菜型油菜產(chǎn)生純合二倍體（基因純合系）；獲得的 遺傳穩(wěn)定群體，無需進行人工染色體加倍，可一步形成穩(wěn)定群體。
[0012]【附圖說明】： 圖1為油菜雙單倍體誘導(dǎo)系規(guī)?；瘎?chuàng)造油菜遺傳穩(wěn)定群體的流程圖。
[0013]圖2為油菜雙單倍體誘導(dǎo)系選育流程圖。
[0014] 圖3為獲得油菜早代穩(wěn)定系的方法流程圖。
[0015] 圖4為油菜雙單倍體誘導(dǎo)系Y3560選育流程圖。
[0016]圖5為油菜雙單倍體誘導(dǎo)系Y3380選育流程圖。
[0017] 圖6為油菜早代穩(wěn)定系P3-2選育流程圖。
[0018] 圖7為甘藍型油菜高含油DH穩(wěn)定遺傳群體構(gòu)建圖。
[0019] 圖8為甘藍型油菜早熟DH穩(wěn)定遺傳群體構(gòu)建圖。
[0020] 圖9為P3-2四倍體油菜根尖染色體倍性鑒定圖。
[0021 ]圖10為為P3-2四倍體油菜流式細胞倍性鑒定圖。
[0022]圖11為Y3380流式細胞倍性鑒定圖。
[0023]圖12為為Y3560流式細胞倍性鑒定圖。
[0024]【具體實施方式】： 實施例1: 參見圖1、圖2、圖5、圖7,為了研究甘藍型油菜高含油基因及形成機制，需要構(gòu)建株系群 體在500個株系以上的DH穩(wěn)定遺傳作圖群體。采用甘藍型油菜P3-2(含油率55%以上）與 CY9802(含油率38%左右）雜交形成?!^!植株采用化學(xué)殺雄，在F!植株苗后期，現(xiàn)蕾初期（12 月中下旬），用苯磺隆80ppm噴灑植株2次，次年2 - 3月用本
【申請人】獲得的油菜雙單倍體誘導(dǎo) 系Y3380人工授粉，獲得大量誘導(dǎo)后代種子。F2R(誘導(dǎo)后代)進行種植并進行流式細胞檢 測、選育性正常、倍性（四倍體)正常、無誘導(dǎo)系顯性性狀(矮桿)植株單株套袋自交。F 3代株 系進行純度鑒定，獲得648個穩(wěn)定株系，并對這些穩(wěn)定株系含油率性狀進行了近紅外品質(zhì)測 試，648個群體含油率從35%-56%正態(tài)分布，說明構(gòu)建的含油率DH穩(wěn)定遺傳群體符合基因定 位及作圖群體的基本需要。
[0025] 油菜雙單倍體誘導(dǎo)系是通過以下方法獲得的： 參見圖2、圖4、圖6、圖9、圖10、圖12,由本
【申請人】獲得的甘藍型油菜四倍體早代穩(wěn)定系 P3-2，與20個純合甘藍型四倍體油菜正反交，3個正反交^代出現(xiàn)分離，且這3個組合F2代出 現(xiàn)穩(wěn)定株系，說明P3-2具有孤雌生殖遺傳特性。用P3-2與高芥酸、矮桿油菜4247正反交 (矮桿、高芥酸為顯性性狀），然后將雜交^代種子進行染色體加倍，加倍后代用流式細胞儀 鑒定或根尖顯微鏡觀察鑒定為顯示矮桿八倍體植株，該植株定名為Y3560。
[0026] 參見圖2、圖5、圖6、圖9、圖10、圖11，由本
【申請人】獲得的甘藍型油菜四倍體早代穩(wěn) 定系P3-2，與20個純合甘藍型四倍體油菜正反交，3個正反交^代出現(xiàn)分離，且這3個組合F 2 代出現(xiàn)穩(wěn)定株系，說明P3-2具有孤雌生殖遺傳特性。用P3-2與四倍體甘藍型矮桿油菜 D3-5正反交(矮桿為顯性性狀），然后將雜交種子進行染色體加倍，加倍后代用流式細 胞儀鑒定或根尖顯微鏡觀察鑒定為顯示矮桿八倍體植株，該植株定名為Y3380。
[0027]本實施例中將P3-2與矮桿油菜D3-5雜交Fi、P3-2與矮桿、高芥酸油菜4247雜交F! 種子在培養(yǎng)基上用秋水仙素進行人工染色體加倍的具體方法如下： 1) 用純度為75%酒精進行種子表面消毒25秒，用0.1%升汞消毒12分鐘，然后用無菌水將 種子表面的升汞沖洗干凈，用無菌紙將種子表面的水分吸干，然后將種子接種在第一培養(yǎng) 基(染色體加倍誘導(dǎo)培養(yǎng)基)上； 2) 讓種子在第一培養(yǎng)基上生根發(fā)芽，培養(yǎng)條件:溫度250C，白天光照16小時，光照強度 2000勒克斯，晚上暗培養(yǎng)8小時，待長到1 一2片真葉時，將植株從下胚軸剪下繼續(xù)在第二培 養(yǎng)基上生長； 3) 將剪下的植株繼續(xù)插入第二培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待有側(cè)芽分化后，將側(cè)芽及植株轉(zhuǎn) 入第三培養(yǎng)基(生根培養(yǎng)基）中進行生根培養(yǎng)； 4) 生根培養(yǎng)二周后，植株長出粗壯的根后，將植株在室溫?zé)捗?天后，取出植株將植株 上的培養(yǎng)基沖洗干凈，并在浸泡緩沖液中浸泡15分鐘后移栽到溫室中，溫室溫度250C，相對 濕度60%，能保證移栽成活率在95%以上； 上述的第一培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： -MS培養(yǎng)基 1L 6_芐基腺嘌呤（6BA) 0.5mg 秋水仙素 50mg 鹿糖 20g 瓊脂 8g， 第一培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， MS培養(yǎng)基由Murashige和Skoog發(fā)明，簡寫為MS，其配方參見附表1， 上述的第二培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L 6_芐基腺嘌呤（6BA) 0.5mg 秋水仙素 30mg 鹿糖 30g 瓊脂 8g， 第二培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0。
[0028]上述的第三培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L α-萘乙酸 0.03mg 秋水仙素 20mg 鹿糖 20g 瓊脂 8g， 第三培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0。
[0029] 上述的浸泡緩沖液由以下配比的組分組成： 水 1L 易?；蚩寺?〇.6g α -萘乙酸 0.5mg。
[0030] 參見圖2、圖3、圖5,用Y3380作父本，與甘藍型油菜細胞質(zhì)不育系（0464A)測交，測 交后代50株，全為高桿，且全為四倍體油菜，其中49株為全不育，1株半不育，且形態(tài)特征與 0464A完全相同。同時用P3-2與矮桿油菜D3-5雜交F!(非加倍株)做父本與0464A測交作為對 照驗證，測交后代102株，出現(xiàn)矮桿62株、高桿40株、且育性分離較大，出現(xiàn)全可育73株、半不 育20株、全不育9株。說明Y3380中的基因并未進入測交株，測交后代為0464A孤雌生殖而來， 誘導(dǎo)率98%。用Y3380做父本與甘藍型油菜3954去雄聚合雜交（3954SFi，由中雙11與CAX雜 交而來），聚合雜交后代Fi分離，每個h自交，收獲h自交株45個。種植F 2代株系45個，出現(xiàn)穩(wěn) 定株系45個，穩(wěn)定株系出現(xiàn)比列100%，誘導(dǎo)率100%。
[0031] 用Y3380做父本與甘藍型油菜3968去雄聚合雜交(3968SFi，由中雙11與1365雜交 而來），聚合雜交后代h分離，每個h自交，收獲Fi自交株52個。種植F2代株系52個，出現(xiàn)穩(wěn)定 株系28個，穩(wěn)定株系出現(xiàn)比例53.85%，誘導(dǎo)率53.85%。
[0032]用Y3380做父本與甘藍型油菜中雙11(常規(guī)品種，純合系）去雄雜交，獲得雜交?:植 株70株，70ftFi形態(tài)與中雙11完全相同，且每個單株自交后F2代未發(fā)生分離，為穩(wěn)定株系，與 中雙11形態(tài)也完全相同，說明F!代就為純系。即Y3380與中雙11雜交過程，誘導(dǎo)中雙11發(fā)生 了孤雌生殖，所產(chǎn)生的FiS孤雌生殖自交，是純合系，因此Fi穩(wěn)定、F 2也穩(wěn)定，且與中雙11形 態(tài)完全相同，該誘導(dǎo)率100%。
[0033]同樣用Y3380做父本與白菜型油菜雅安黃油菜YH(二倍體油菜，2 η =20)去雄雜 交，獲得雜交Fi植株98株，97株?1形態(tài)與ΥΗ完全相同，且每個單株自交后F2R形態(tài)都為二倍 體、外形與YH-致，說明Y3380與YH雜交過程，誘導(dǎo)YH發(fā)生了孤雌生殖，所產(chǎn)生的^為孤雌生 殖自交，且與YH形態(tài)完全相同，該誘導(dǎo)率98.9%。最終，顯性矮桿八倍體植株Y3380確定為油 菜雙單倍體誘導(dǎo)系。
[0034]參見圖2、圖3、圖4,用Y3560作父本，與甘藍型油菜細胞質(zhì)不育系（0464A)測交，測 交后代80株，全為高桿，且76為四倍體油菜、2株為二倍體、2株為八倍體;其中76株四倍體植 株為全不育，4株半不育，且形態(tài)特征與0464A完全相同。同時用P3-2與矮桿、高芥酸油菜 4247雜交F!(非加倍株）做父本與0464A測交作為對照驗證，測交后代153株，出現(xiàn)矮桿102 株、高桿51株、且育性分離較大，出現(xiàn)全可育65株、半不育35株、全不育53株。說明Y3560中的 基因并未進入測交株，測交后代為0464A孤雌生殖而來，誘導(dǎo)率95%。
[0035]用Y3560做父本與白菜型油菜雅安黃油菜YH(二倍體油菜，2 η =20)去雄雜交，獲 得雜交F:植株145株，143株?1形態(tài)與ΥΗ完全相同，且每個單株自交后F2代形態(tài)都為二倍體、 外形與YH-致，說明Y3560與YH雜交過程，誘導(dǎo)YH發(fā)生了孤雌生殖，所產(chǎn)生的Fi為孤雌生殖 自交，且與YH形態(tài)完全相同，該誘導(dǎo)率98.6%。
[0036]同樣用Y3560做父本與芥菜型油菜GW(四倍體油菜，2 η = 36)去雄雜交，獲得雜 交?:植株124株，123株?:形態(tài)與G W完全相同，且每個單株自交后F2代形態(tài)都為四倍體、外 形與YH-致，說明Y3560與GW雜交過程，誘導(dǎo)GW發(fā)生了孤雌生殖，所產(chǎn)生的FiS孤雌生 殖自交，且與G W形態(tài)完全相同，該誘導(dǎo)率99.2%。最終，顯性矮桿八倍體植株Y3560確定為 油菜雙單倍體誘導(dǎo)系。
[0037] 參見圖3、圖6、圖9、圖10,獲得早代穩(wěn)定系P3-2方法如下： 甘藍型油菜F009(四倍體，染色體2n=38)與白菜型油菜YH(二倍體，雅安黃油菜，染色體 2n=20)剝蕾進行人工去雄雜交獲得h代雜交種子。^代雜交種子在培養(yǎng)基上用秋水仙素進 行人工染色體加倍。對加倍后的FHf植株進行自交(或強制自交)獲得^代，對F 2代進行田間 種植觀察、育性鑒定即通過醋酸洋紅對花粉染色，判斷花粉育性，出現(xiàn)三種情況（1、單倍體 植株，花粉極少，且育性極低；2、多倍體植株完全不育，花器官發(fā)育受阻，不能正常的開花， 無花粉;3、正?？捎闹仓?，花粉量多，花粉育性95%以上）。對? 2代正常可育單株進行自交 獲得F3代。對F3代進行純合度鑒定，種植F3代單株株系，32%的可育株系單株植株整齊一致， 開花結(jié)實正常。對整齊一致株系進行細胞學(xué)鑒定，染色體條數(shù)一致(38條），染色體形態(tài)未出 現(xiàn)異常。SSR分子標(biāo)記，通過DNA聚合酶鏈反應(yīng)，電泳觀察每個特異引物擴增下單株DNA帶型， 顯示每個單株都是H)09與YH的雜交后代，且每個單株DNA擴增條帶數(shù)目及帶型一致，可以判 斷這些株系為純合系，即早代穩(wěn)定系。將其中1個葉片較大、無裂葉、葉片著生緊湊、含油率 55%的甘藍型(染色體38條)油菜早代穩(wěn)定系定名為P3-2。
[0038] 本實施例中將F1代雜交種子在培養(yǎng)基上用秋水仙素進行人工染色體加倍的具體 方法如下： 1) 用純度為75%酒精進行種子表面消毒25秒，用0.1%升汞消毒12分鐘，然后用無菌水將 種子表面的升汞沖洗干凈，用無菌紙將種子表面的水分吸干，然后將種子接種在第一培養(yǎng) 基(染色體加倍誘導(dǎo)培養(yǎng)基)上； 2) 讓種子在第一培養(yǎng)基上生根發(fā)芽，培養(yǎng)條件:溫度250C，白天光照16小時，光照強度 2000勒克斯，晚上暗培養(yǎng)8小時，待長到1 一2片真葉時，將植株從下胚軸剪下繼續(xù)在第二培 養(yǎng)基上生長； 3) 將剪下的植株繼續(xù)插入第二培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待有側(cè)芽分化后，將側(cè)芽及植株轉(zhuǎn) 入第三培養(yǎng)基(生根培養(yǎng)基）中進行生根培養(yǎng)； 4) 生根培養(yǎng)二周后，植株長出粗壯的根后，將植株在室溫?zé)捗?天后，取出植株將植株 上的培養(yǎng)基沖洗干凈，并在浸泡緩沖液中浸泡15分鐘后移栽到溫室中，溫室溫度250C，相對 濕度60%，能保證移栽成活率在95%以上； 上述的第一培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： -MS培養(yǎng)基 1L 6_芐基腺嘌呤（6BA) 0.5mg 秋水仙素 30mg 鹿糖 20g 瓊脂 8g， 第一培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0。
[0039] MS培養(yǎng)基由Murashige和Skoog發(fā)明，簡寫為MS，其配方參見附表1。
[0040] 上述的第二培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L 6_芐基腺嘌呤（6BA) 0.5mg 秋水仙素 20mg 鹿糖 30g 瓊脂 8g， 第二培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0。
[0041 ]上述的第三培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L α-萘乙酸 0.03mg 秋水仙素 5mg 鹿糖 20g 瓊脂 8g， 第三培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0。
[0042] 上述的浸泡緩沖液由以下配比的組分組成： 水 1L 易?；蚩寺?〇.6g α -萘乙酸 0.5mg。
[0043]附表1 MS培養(yǎng)基成分配方
實施例2: 參見圖1、圖2、圖4、圖8,為了研究甘藍型油菜早熟性狀，需要構(gòu)建株系群體在1000個以 上的DH穩(wěn)定遺傳作圖群體。采用早熟甘藍型油菜蓉C2994與蓉B0464(中晚熟油菜)雜交形成 植株采用化學(xué)殺雄，在h植株苗后期，現(xiàn)蕾初期（12月中下旬），用戊炔草胺lOOppm噴灑 植株2次，并用本
【申請人】獲得的油菜雙單倍體誘導(dǎo)系Y3560種植在一個隔離網(wǎng)室內(nèi)，次年2 - 3月初花期用壁蜂輔助授粉，獲得大量誘導(dǎo)后代種子。^代(誘導(dǎo)后代)進行種植并進行流式 細胞檢測、選育性正常、倍性（四倍體)正常、無誘導(dǎo)系顯性性狀(矮桿)植株單株套袋自交。 F3代株系進行純度鑒定，獲得1545個穩(wěn)定株系，并對這些穩(wěn)定株系早熟、早花性狀進行了調(diào) 查，花期及熟期呈正態(tài)型分布，說明構(gòu)建的早熟性狀DH穩(wěn)定遺傳群體符合基因定位及作圖 群體的基本需要。
[0044] 本實施例2中油菜雙單倍體誘導(dǎo)系的選育方法同實施例1。
[0045] 上述實施例是對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進一步說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述 主題的范圍僅限于上述實施例。凡基于上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的額范圍。
【主權(quán)項】
1.油菜雙單倍體誘導(dǎo)系規(guī)?；瘎?chuàng)造油菜遺傳穩(wěn)定群體的方法，包括以下步驟： 1) 對具有目標(biāo)性狀差異明顯的2個遺傳穩(wěn)定油菜進行人工去雄雜交，并收獲雜交后代h 種子； 2) 對上述步驟1)中收獲的雜交后代植株在現(xiàn)蕾初期進行化學(xué)殺雄;根據(jù)化學(xué)殺雄劑不 同或油菜材料不同提前進行濃度摸索和比較試驗，保證化學(xué)殺雄徹底，化學(xué)殺雄劑的作用 濃度為30-150ppm； 3) 在油菜花期，利用油菜雙單倍體誘導(dǎo)系對上述步驟2)中化學(xué)殺雄后的雜交Fi植株進 行人工授粉，或?qū)⒂筒穗p單倍體誘導(dǎo)系與上述步驟2)化學(xué)殺雄雜交h植株種植在一個隔離 網(wǎng)室，采用壁蜂輔助授粉，接受授粉的母體植株至少在100株以上； 4) 對上述步驟3)中用油菜雙單倍體誘導(dǎo)系授粉后代進行單株種植，苗期利用流式細胞 儀鑒定倍性，淘汰多倍體、單倍體或具有油菜雙單倍體誘導(dǎo)系顯性性狀特征植株，選擇正常 育性，正常倍性植株，單株套袋自交，選擇套袋自交單株數(shù)在5000株以上； 5) 對上述步驟4)中單株自交后代進行株系種植，調(diào)查株系形態(tài)一致性，并通過分子標(biāo) 記鑒定株系一致性及穩(wěn)定性； 6) 上述步驟5)中所鑒定的株系數(shù)至少在2000個以上，并對遺傳穩(wěn)定株系再進行目標(biāo)性 狀統(tǒng)計，分析目標(biāo)性狀是否符合正態(tài)分布； 7) 上述步驟6)中所有遺傳穩(wěn)定株系，即DH群體，滿足目標(biāo)性狀正態(tài)分布，確定這些DH群 體構(gòu)建合格，用于油菜目標(biāo)性狀的遺傳作圖、目標(biāo)性狀基因定位、QTL分析、以及目標(biāo)性狀與 基因的關(guān)聯(lián)分析等； 上述步驟3)中油菜雙單倍體誘導(dǎo)系的選育方法如下： (1) 選育具有孤雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系： ① 將兩個油菜親本材料雜交Fi代種子在培養(yǎng)基上用染色體加倍誘導(dǎo)劑進行人工染色體 加倍獲得加倍后的Fi代植株； ② 加倍后的Fi代植株進行自交或強制自交獲得內(nèi)代，對F2代進行田間種植觀察，并鑒定 每個單株的育性，選擇可育后代自交獲得F 3代，對F3代進行純合度鑒定，通過形態(tài)、細胞學(xué)以 及分子標(biāo)記鑒定，對后代DNA進行聚合酶鏈反應(yīng)擴增，電泳觀察每個特異引物擴增下單株的 DNA帶型及條帶數(shù)目，顯示每個單株都是兩個親本的雜交后代，每個單株之間分子標(biāo)記圖譜 一致，說明這些單株是純合系一早代穩(wěn)定系； ③ 獲得的早代穩(wěn)定系與至少10個油菜常規(guī)純合穩(wěn)定系進行正反交，F(xiàn)i代、F2代鑒定早代 穩(wěn)定系的遺傳特性，即是否有孤雌生殖特性;上述正反交，如有Fi分離，F(xiàn) 2代出現(xiàn)部分穩(wěn)定株 系，對應(yīng)的早代穩(wěn)定系是具有孤雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系； (2) 選育攜帶顯性遺傳性狀、具有孤雌遺傳特性且倍性遺傳穩(wěn)定的多倍體油菜： ① 具有孤雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系與具有顯性性狀油菜雜交，得到雜交^代種子， 上述雜交^種子在培養(yǎng)基上用染色體加倍誘導(dǎo)劑進行人工染色體加倍，得到加倍后的帶顯 性性狀的^植株； ② 對加倍的帶顯性性狀的Fi植株，通過顯微觀察或流式細胞儀進行染色體倍性鑒定，選 擇帶顯性性狀的多倍體的植株，淘汰非正常加倍株、非整倍體植株、以及不帶顯性性狀加倍 植株，帶顯性性狀的多倍體的植株主要是倍性遺傳穩(wěn)定、結(jié)實性好、具有孤雌生殖遺傳特 性、帶顯性性狀的六倍體或八倍體油菜植株； (3)油菜雙單倍體誘導(dǎo)系鑒定及誘導(dǎo)能力測定： ① 倍性遺傳穩(wěn)定、具有孤雌生殖遺傳特性、帶顯性性狀的多倍體植株中的顯性性狀能 去除測交后代中產(chǎn)生的雜交株，如果測交后代中出現(xiàn)顯性性狀植株、或非整倍體植株，說明 該植株是多倍體植株和母本雜交產(chǎn)生的，去除該植株； ② 上述單株測交后代如果出現(xiàn)全不育、為正常倍性油菜即二倍體或四倍體油菜、且不 帶顯性性狀，說明該測交后代對應(yīng)的父本基因未進入測交后代中，顯性多倍體植株為油菜 雙單倍體誘導(dǎo)系。2.如權(quán)利要求1所述的油菜雙單倍體誘導(dǎo)系規(guī)?；瘎?chuàng)造油菜遺傳穩(wěn)定群體的方法，其 特征在于油菜雙單倍體誘導(dǎo)系選育是將兩個親本材料雜交?:代種子或具有孤雌生殖遺傳 特性的早代穩(wěn)定系與具有顯性性狀油菜雜交得到的雜交FiR種子在培養(yǎng)基上用染色體加 倍誘導(dǎo)劑進行人工染色體加倍，具體方法如下： 1) 用純度為75%酒精進行種子表面消毒25-40秒，用0.1%升汞消毒12-17分鐘，然后用 無菌水將種子表面的升汞沖洗干凈，用無菌紙將種子表面的水分吸干，然后將種子接種在 第一培養(yǎng)基上； 2) 讓種子在第一培養(yǎng)基上生根發(fā)芽，培養(yǎng)條件:溫度23-25叱，白天光照12-16小時，光 照強度2000-3000勒克斯，夜晚暗培養(yǎng)8-12小時，待植株長到1 一2片真葉時，從下胚軸處 剪下植株繼續(xù)在第二培養(yǎng)基上生長； 3) 將剪下的植株繼續(xù)插入第二培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待有側(cè)芽分化后，將側(cè)芽及植株轉(zhuǎn) 入第三培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)； 4) 生根培養(yǎng)二周后，植株長出粗壯的根后，將植株在室溫?zé)捗?-7天，取出植株將植株 上的培養(yǎng)基用自來水沖洗干凈，并在浸泡緩沖液中浸泡15-30分鐘后移栽到溫室中，溫室 溫度16°C 16°C - 25^(:,相對濕度60-80%，能保證移栽成活率在95%以上； 上述的第一培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： 一MS培養(yǎng)基 1L 6_芐基腺嘌呤 0.5-1.5mg 染色體加倍誘導(dǎo)劑 30-70mg 鹿糖 20-30g 瓊脂 8 一10g， 第一培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， 上述的第二培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L， 6_芐基腺嘌呤 0.5-lmg， 染色體加倍誘導(dǎo)劑 20-40mg， 鹿糖 20-30g， 瓊脂 8 一10g， 第二培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， 上述的第三培養(yǎng)基由以下配比的組分組成： MS培養(yǎng)基 1L， α-蔡乙酸 0.03-0.5mg, 染色體加倍誘導(dǎo)劑 5-20mg， 鹿糖 20-30g， 瓊脂 8 一10g， 第三培養(yǎng)基的pH=5.8-6.0， 上述的浸泡緩沖液由以及下配比的組分組成： 水 1L， 易?；蚩寺?0.6-1.2g， α一萘乙酸 0.5-lmg〇3.如權(quán)利要求1或2所述的油菜雙單倍體誘導(dǎo)系規(guī)?；瘎?chuàng)造油菜遺傳穩(wěn)定群體的方法， 其特征在于染色體加倍誘導(dǎo)劑采用秋水仙素、氟樂靈、氨磺樂靈中的至少一種。
【文檔編號】C12Q1/68GK106069719SQ201610458271
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月23日
【發(fā)明人】付紹紅, 楊進, 王繼勝, 李云, 鄒瓊, 陶蘭蓉, 康澤明, 唐蓉, 殷麗琴
【申請人】成都市農(nóng)林科學(xué)院