本發(fā)明屬于生態(tài)毒性測試領(lǐng)域，涉及了一種評價農(nóng)藥對蜜蜂幼蟲毒性的方法，更具體的涉及了一種利用實驗室人工飼養(yǎng)蜜蜂幼蟲評價農(nóng)藥對蜜蜂幼蟲毒性的方法。

背景技術(shù)：

蜜蜂以其授粉高效性、采集專一性和種群社會性等優(yōu)勢在許多農(nóng)作物授粉中發(fā)揮著重要作用，是自然界授粉昆蟲中種類最多、數(shù)量最大的類群。然而，農(nóng)藥的濫用不僅對采集蜂的采集行為和健康產(chǎn)生嚴重影響，受農(nóng)藥污染的蜂蜜、花粉以及巢脾中蓄積的農(nóng)藥還將對蜜蜂幼蟲的生長發(fā)育產(chǎn)生影響，嚴重危害時，導致蜜蜂幼蟲大量死亡。蜂群中幼蟲的數(shù)量越少，發(fā)展壯群的可能性越小，其采集能力越差，生產(chǎn)蜂產(chǎn)品和傳粉的能力無法發(fā)揮，將給養(yǎng)蜂業(yè)及農(nóng)業(yè)帶來沉重的打擊。

目前為評價農(nóng)藥對蜜蜂幼蟲毒性，科技工作者開展了蜂巢內(nèi)農(nóng)藥對蜜蜂幼蟲的影響研究，然而蜜蜂是典型的真社會性昆蟲，具有明確而細致的勞動分工，蜂群中的幼蟲食物由專職哺育蜂來提供，而人工對幼蟲進行操作，幼蟲往往會被工蜂遺棄，自然蜂群中添加殺蟲劑易存儲于巢脾上影響蜂群繁殖，同時外界蜜源沖淡殺蟲劑劑量，存在重復性差、試驗結(jié)果說服力低等缺點。如果能夠像開展農(nóng)藥對蜜蜂急性毒性研究一樣，將幼蟲飼養(yǎng)在實驗室內(nèi)進行，可人為控制幼蟲食物成分，排除哺育蜂以及外界蜜源的影響。因此，需加大科研的力度，探索可行的技術(shù)，建立有效的、簡便的、重復性高的室內(nèi)方法。

為建立室內(nèi)農(nóng)藥對蜜蜂幼蟲毒性評價方法，人工飼養(yǎng)蜜蜂幼蟲的技術(shù)是必不可少的一項工程。過去的養(yǎng)蜂和研究實踐中，已形成了一些飼養(yǎng)技術(shù)。但需操作者具有良好的操作經(jīng)驗，需每天進行幼蟲的轉(zhuǎn)移，這一過程往往費時費力，如開展試驗需批量的蜜蜂幼蟲時，大大增加試驗成本，并減緩試驗進程，同時還會對受試幼蟲造成一定的傷害，影響后期試驗結(jié)果的準確性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種利用實驗室人工飼養(yǎng)蜜蜂幼蟲評價農(nóng)藥對蜜蜂幼蟲毒性的方法，具有重要的科學意義。

本發(fā)明的目的可以通過以下措施達到：

本發(fā)明技術(shù)方案之一：一種利用實驗室人工飼養(yǎng)蜜蜂幼蟲評價農(nóng)藥對蜜蜂幼蟲毒性的方法，包括如下步驟：

(1)蜜蜂幼蟲的準備：向含有蜂群的蜂箱內(nèi)插入空蜂脾，將產(chǎn)卵期內(nèi)的蜂王固定在所述空蜂脾上進行產(chǎn)卵，20～28小時后將蜂王放出至含有蜂卵的蜂脾外，該含有蜂卵的蜂脾繼續(xù)留在蜂箱內(nèi)，直到其中的蜂卵孵化成蜜蜂幼蟲；

(2)蜜蜂幼蟲的實驗室飼養(yǎng)：從蜂箱內(nèi)取出所插入的蜂脾，挑取所述蜜蜂幼蟲用基礎(chǔ)口糧進行適應性飼養(yǎng)3天，于第4天進行健康檢查，選取健康幼蟲；

(3)受試農(nóng)藥的添加：將步驟(2)選取的健康幼蟲分成對照組幼蟲和處理組幼蟲并繼續(xù)飼養(yǎng)3天，其中處理組幼蟲用受試飼料飼養(yǎng)，所述受試飼料含有各濃度的受試農(nóng)藥和基礎(chǔ)日糧；

(4)化蛹及觀察：將步驟(3)中飼養(yǎng)3天后的即將進入蛹化期的幼蟲轉(zhuǎn)移至化蛹板的板孔中準備化蛹，觀察幼蟲在板孔中完成排便、吐絲、化蛹和羽化的過程，統(tǒng)計各幼蟲的存活、化蛹或/和羽化情況。

本發(fā)明技術(shù)方案之二：一種實驗室人工飼養(yǎng)蜜蜂幼蟲的方法，包括如下步驟：

(1)蜜蜂幼蟲的準備：向含有蜂群的蜂箱內(nèi)插入空蜂脾，將產(chǎn)卵期內(nèi)的蜂王固定在所述空蜂脾上進行產(chǎn)卵，20～28小時后將蜂王放出至含有蜂卵的蜂脾外，該含有蜂卵的蜂脾繼續(xù)留在蜂箱內(nèi)，直到其中的蜂卵孵化成蜜蜂幼蟲；

(2)蜜蜂幼蟲的實驗室飼養(yǎng)：從蜂箱內(nèi)取出所插入的蜂脾，挑取所述蜜蜂幼蟲用基礎(chǔ)口糧進行適應性飼養(yǎng)3天，于第4天進行健康檢查，選取健康幼蟲繼續(xù)飼養(yǎng)3天；

(3)化蛹及觀察：將步驟(2)中繼續(xù)飼養(yǎng)3天后的即將進入蛹化期的幼蟲轉(zhuǎn)移至化蛹板的板孔中準備化蛹，觀察幼蟲在板孔中完成排便、吐絲、化蛹和羽化的過程，統(tǒng)計各幼蟲的存活、化蛹或/和羽化情況。

本發(fā)明技術(shù)方案之三：所述的實驗室人工飼養(yǎng)蜜蜂幼蟲的方法在評價農(nóng)藥對蜜蜂幼蟲毒性方面的用途。

本發(fā)明還公開一種具體方案，一種利用實驗室人工飼養(yǎng)蜜蜂幼蟲評價農(nóng)藥對蜜蜂幼蟲毒性的方法，其包括如下步驟：

(1)蜜蜂幼蟲的準備：向含有蜂群的蜂箱內(nèi)插入1張空蜂脾，用隔王板將產(chǎn)卵期內(nèi)的蜂王固定在所述空蜂脾上進行產(chǎn)卵，20～28小時后去掉隔王板將蜂王放出至插入的蜂脾外，該含有蜂卵的蜂脾繼續(xù)留在蜂箱內(nèi)，直到其中的蜂卵孵化成蜜蜂幼蟲；

(2)蜜蜂幼蟲的實驗室飼養(yǎng)：從蜂箱內(nèi)取出所插入的蜂脾，挑取所述蜜蜂幼蟲置于裝有蜜蜂幼蟲基礎(chǔ)日糧的孔板上，放入培養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)，待幼蟲即將進入蛹化期時，將幼蟲轉(zhuǎn)移至化蛹板中準備化蛹，此后不再移動蟲體，直至蜜蜂幼蟲發(fā)育完全。該過程中可進一步添加受試農(nóng)藥；

(3)受試農(nóng)藥的準備：受試農(nóng)藥用蒸餾水或/和對蜜蜂幼蟲無毒性的有機溶劑溶解后，配制成一個或多個不同濃度處理組，并配制對應溶劑對照組；

(4)受試農(nóng)藥的添加：步驟(2)中幼蟲經(jīng)3天飼養(yǎng)，于第4天進行健康檢查，剔除異常、生病、受傷的幼蟲，分配到各處理組中。將含受試農(nóng)藥的各濃度處理組以及溶劑對照組分別添加到基礎(chǔ)日糧中制成受試飼料，利用該受試飼料飼喂各處理組的蜜蜂幼蟲，連續(xù)飼喂3天，隨后進入蛹化期，不再喂食，同步驟(2)待幼蟲即將進入蛹化期時，將幼蟲轉(zhuǎn)移至化蛹板的板孔中準備化蛹，觀察幼蟲在孔中完成排便、吐絲、化蛹和羽化的過程，統(tǒng)計各幼蟲的存活、化蛹及羽化情況。

優(yōu)選的，其中蜜蜂幼蟲的準備的步驟中：所述蜂群為四周內(nèi)未用藥的、健康的、已知來源和生理狀態(tài)的蜂群；產(chǎn)卵期內(nèi)的蜂王在所述空蜂脾上進行產(chǎn)卵的時間優(yōu)選為24小時。

優(yōu)選的，蜜蜂幼蟲的準備步驟中的蜂卵孵化期為2～4天，一般為3天。

優(yōu)選的，其中蜜蜂幼蟲的實驗室飼養(yǎng)步驟中：所挑取的蜜蜂幼蟲為1日齡后期幼蟲，其體色為白色。相較于其他日齡的幼蟲，挑選1日齡后期幼蟲能夠在實驗室人工飼養(yǎng)的條件下獲得良好的生長，將幼蟲的存活率提高到90％以上，使更多幼蟲能夠成功進入蛹化期。

優(yōu)選的，所述基礎(chǔ)日糧的質(zhì)量組成為：新鮮蜂王漿50±5％，無菌水37±2％，葡萄糖6±1％，果糖6±1％，酵母提取物1±0.5％；基礎(chǔ)日糧的優(yōu)選質(zhì)量組成為：新鮮蜂王漿50％，無菌水37％，葡萄糖6％，果糖6％，酵母提取物1％。更優(yōu)選的，基礎(chǔ)日糧現(xiàn)配現(xiàn)用，飼喂前須在培養(yǎng)箱內(nèi)預熱。例如飼喂前須在培養(yǎng)箱內(nèi)預熱30分鐘。本發(fā)明所述的基礎(chǔ)日糧相較于其他的蜜蜂幼蟲飼料能夠使幼蟲生長良好，大幅提高幼蟲成活率。

優(yōu)選的，其中蜜蜂幼蟲的實驗室飼養(yǎng)步驟中：所述適應性飼養(yǎng)采用裝有基礎(chǔ)日糧的孔板進行；孔板中每孔分配一只蜜蜂幼蟲，每孔蜜蜂幼蟲基礎(chǔ)日糧的飼料量為40～60μL，孔板中的基礎(chǔ)日糧每24小時更換。優(yōu)選的孔板可采用48孔板或其他孔板。

優(yōu)選的，蜜蜂幼蟲的實驗室飼養(yǎng)和受試農(nóng)藥的添加步驟中的環(huán)境條件均為：溫度34±2℃，濕度95±1％，優(yōu)選溫度34±1℃，濕度95％；更優(yōu)選的，飼養(yǎng)時孔板置于箱底部裝有甘油水混合液的密閉箱中，再放于34±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

優(yōu)選的，其中受試農(nóng)藥的添加步驟中，所述對照組幼蟲分為空白對照組幼蟲或/和溶劑對照組幼蟲；所述空白對照組幼蟲用基礎(chǔ)日糧飼養(yǎng)，所述溶劑對照組幼蟲用添加了溶劑的基礎(chǔ)日糧作為飼料飼養(yǎng)，其中每41～61μL飼料中含有溶劑0.5～5μL；所述處理組幼蟲分為多個處理組，優(yōu)選分為至少5個處理組，每個處理組分別用含有不同濃度受試農(nóng)藥的受試飼料飼養(yǎng)。

優(yōu)選的，其中受試農(nóng)藥的添加步驟中，受試飼料的制備方法為：受試農(nóng)藥用蒸餾水或/和對蜜蜂幼蟲無毒性的有機溶劑溶解后，配制成一個或多個不同濃度的受試農(nóng)藥溶液，將其分別加入基礎(chǔ)日糧中配制得到受試飼料，其中每41～61μL受試飼料中含有受試農(nóng)藥溶液0.5～5μL，優(yōu)選1μL；

優(yōu)選的，受試農(nóng)藥的添加步驟中繼續(xù)飼養(yǎng)過程中每只蜜蜂幼蟲的飼料量為41～61μL，飼料每24小時更換。更優(yōu)選的，受試飼料中各濃度處理組及溶劑對照組的量不超過基礎(chǔ)日糧體積的5％。

優(yōu)選的，受試農(nóng)藥的添加步驟中，受試農(nóng)藥添加時，受試對象一般為4日齡后的蜜蜂幼蟲。

優(yōu)選的，在繼續(xù)喂養(yǎng)過程中也需定時(如24h)更換受試飼料，其中基礎(chǔ)日糧現(xiàn)配現(xiàn)用，飼喂前須在培養(yǎng)箱內(nèi)預熱。

優(yōu)選的，化蛹及觀察步驟中，所述化蛹板孔中墊有干燥的滅菌紙，例如干燥的無菌擦鏡紙；優(yōu)選的，即將進入蛹化期的幼蟲在轉(zhuǎn)移至化蛹板之前先吸干幼蟲體表的飼料；更優(yōu)選的，轉(zhuǎn)移至化蛹板中的幼蟲不再移動，直至蜜蜂幼蟲發(fā)育完全。實驗發(fā)現(xiàn)，在化蛹板孔中墊干燥的滅菌紙，可以使預蛹到成蜂過程的羽化率提高50％以上。

優(yōu)選的，化蛹及觀察步驟中，化蛹板可采用24孔板或其他孔板。

一種蜜蜂幼蟲實驗室內(nèi)飼養(yǎng)的具體方法為：從蜂脾中移取1日齡后期的蜜蜂幼蟲至盛有蜜蜂幼蟲基礎(chǔ)日糧的48孔板內(nèi)，每孔一只幼蟲，將48孔板置于箱底部裝有1L滅菌的甘油水混合液(15.5％甘油+84.5％水)的密閉小整理箱中，置于34±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，以后每24小時，更換孔板中的飼料，待幼蟲即將進入蛹化期時，用擦鏡紙吸干幼蟲體表的飼料后，將幼蟲轉(zhuǎn)移于墊有滅菌紙的24孔板中準備化蛹，此后不再移動蟲體，直至蜜蜂幼蟲發(fā)育完全。在該過程中可進一步添加受試農(nóng)藥或其他試劑，借此可以進一步開展許多以蜜蜂幼蟲為對象的活體實驗。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點：

1.快速、簡單。本發(fā)明通過優(yōu)化蜜蜂幼蟲基礎(chǔ)日糧、蟲齡以及化蛹板，獲得了較為簡單的，容易掌握的室內(nèi)飼養(yǎng)技術(shù)，操作者能在較短的時間內(nèi)掌握。

2.直觀、準確。本發(fā)明在實驗室內(nèi)飼養(yǎng)蜜蜂幼蟲的方法，可以讓我們不依賴于蜂群，在實驗室內(nèi)開展農(nóng)藥對蜜蜂幼蟲毒性研究，避免蜂群內(nèi)諸多不可控制因素的制約，可直觀、高效、準確的評價農(nóng)藥對蜜蜂幼蟲的影響。

3.較強的實用性和擴展性。本發(fā)明在實驗室內(nèi)飼養(yǎng)蜜蜂幼蟲的方法，在此基礎(chǔ)上可以開展許多以蜜蜂幼蟲為對象的活體實驗，因此適用于除農(nóng)藥外的其它研究，應用范圍較廣。

附圖說明

圖1為在實驗室利用48孔板飼養(yǎng)的不同發(fā)育時期的蜜蜂幼蟲，其中A、B、C、D、E、F分別表示1、2、3、4、5、6日齡的幼蟲。

圖2為在實驗室利用24孔板進行化蛹和羽化的蜜蜂幼蟲，其中A、B、C分別表示剛化蛹的蜜蜂幼蟲、成熟蛹體和羽化的幼蜂。

具體實施方式

實施例1：本發(fā)明實驗室人工飼養(yǎng)蜜蜂幼蟲的方法，包括以下步驟：

(1)蜜蜂幼蟲的準備

在蜂王產(chǎn)卵期內(nèi)，選擇三箱四周內(nèi)未用藥的、健康的、已知來源和生理狀態(tài)的蜂群。打開蜂箱蓋各插入1張空脾，用隔王板將蜂王固定在空脾上產(chǎn)卵，24小時后去掉隔王板將蜂王放出，檢查新產(chǎn)卵情況。根據(jù)蜂王的生育能力，可適當縮短隔離時間，以減少幼蟲之間的大小和年齡差異。含有蜂卵的蜂脾繼續(xù)留在蜂箱內(nèi)，直到孵化(蜂卵孵化期一般為3天)。

(2)蜜蜂幼蟲的實驗室飼養(yǎng)

從蜂箱內(nèi)取出所插入的蜂脾，挑取所述蜜蜂幼蟲置于裝有蜜蜂幼蟲基礎(chǔ)日糧的孔板上，放入培養(yǎng)箱內(nèi)進行飼養(yǎng)。

實驗室內(nèi)利用48孔板來飼喂蜜蜂幼蟲。

幼蟲基礎(chǔ)日糧配方為新鮮蜂王漿占50％，無菌水占37％，葡萄糖占6％，果糖占6％，酵母提取物占1％。具體操作方法為：配制好幼蟲基礎(chǔ)日糧，置于培養(yǎng)箱內(nèi)預熱30分鐘，按每個孔中添加50μL幼蟲日糧到48孔板內(nèi)。

從蜂脾中移取1日齡后期的蜜蜂幼蟲至盛有蜜蜂幼蟲基礎(chǔ)日糧的48孔板內(nèi)，每孔一只幼蟲，將48孔板置于箱底部裝有1L滅菌的甘油水混合液(15.5％甘油+84.5％水)的密閉小整理箱中，置于34±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，以后每24小時，更換孔板中的幼蟲基礎(chǔ)日糧。

待幼蟲即將進入蛹化期時，用擦鏡紙吸干幼蟲體表的飼料后，將幼蟲轉(zhuǎn)移于墊有滅菌紙的24孔板中準備化蛹，此后不再移動蟲體，直至蜜蜂幼蟲發(fā)育完全，具體培養(yǎng)的各日齡蜜蜂幼蟲見圖1，可見各日齡的蜜蜂幼蟲均能正常生長發(fā)育并化蛹。

利用這種方法培養(yǎng)的蜜蜂幼蟲都能夠正常發(fā)育，與在蜂箱內(nèi)哺育的蜜蜂幼蟲發(fā)育情況基本一致。在此基礎(chǔ)上可以開展許多以蜜蜂幼蟲為對象的活體實驗，避免蜂群內(nèi)諸多不可控制因素的制約。

對比例1：日糧配方對蜜蜂幼蟲生長發(fā)育的影響

為獲得最佳蜜蜂幼蟲日糧配比，參照蜜蜂幼蟲的營養(yǎng)需要，本發(fā)明配制蜜蜂幼蟲基礎(chǔ)日糧：新鮮蜂王漿占50％，無菌水占37％，葡萄糖占6％，果糖占6％，酵母提取物占1％。

同時配制OECD237準則中給出不同階段的三種日糧：

日糧A(第1天)：50％的新鮮蜂王漿和50％的含2％的酵母提取物、12％的葡萄糖和12％果糖的水溶液；

日糧B(第3天)：50％的新鮮蜂王漿和50％的含3％的酵母提取物、15％的葡萄糖和15％的果糖的水溶液；

日糧C(第4天到第6天)：50％的新鮮蜂王漿和50％含4％的酵母提取物，18％的葡萄糖和18％的果糖的水溶液。

試驗按日糧分為2個處理，每個處理3個培養(yǎng)板(48孔)即3個重復，挑取不同日齡的蜜蜂幼蟲進行飼喂，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明幼蟲基礎(chǔ)日糧處理組幼蟲生長良好，均能排便進入蛹化期。OECD237處理組幼蟲生長不佳，幼蟲在移植到培養(yǎng)板3天左右死亡，個別幼蟲在發(fā)育到蛹期后停止發(fā)育，然后死亡。

表明本發(fā)明中的蜜蜂幼蟲基礎(chǔ)日糧配方優(yōu)于OECD237準則，主要是由于蜜蜂幼蟲期發(fā)育緩慢，對糖的需求量較少，但蜜蜂幼蟲期要經(jīng)歷一系列復雜的變化，其體內(nèi)不斷進行物質(zhì)的分解和合成，而水分是生理代謝和生化反應的主要媒介，對水的需求量大，而OECD237準則增大了糖的含量，降低了水分含量，所以幼蟲生長不佳。

對比例2：蟲齡對幼蟲存活率的影響

試驗日糧統(tǒng)一為實施例1中飼喂效果最佳的日糧配方，1日齡前期幼蟲(蛋青色)和1日齡后期幼蟲(白色)兩個處理組，每個處理3個培養(yǎng)板(48孔)即3個重復。在飼喂過程中發(fā)現(xiàn)，1日齡前期幼蟲在移植到培養(yǎng)板前3天長勢比較不錯，第四天50％以上的幼蟲身體彈性減弱，逐漸停止發(fā)育然后死亡。1日齡后期幼蟲生長良好，90％以上的幼蟲存活，排便進入蛹化期。

對比例3：化蛹板對幼蟲發(fā)育的影響

試驗設(shè)計了2個處理組，一個是在24孔培養(yǎng)板孔內(nèi)墊干燥的無菌擦鏡紙，另一個是空白24孔培養(yǎng)板。試驗日糧統(tǒng)一為實施例1中飼喂效果最佳的日糧配方，挑取實施例2中飼喂效果最佳的蟲齡，進行飼喂，然后把進入排便期即將化蛹的幼蟲(預蛹)用移蟲針移入化蛹板孔中，每孔1只?？瞻椎幕及宓幕寄Ｊ?，從預蛹到成蜂僅獲得44.44％的羽化率，相比之下，墊干燥的無菌擦鏡紙的化蛹板獲得高達95.83％的成活率。

實施例2：本發(fā)明利用實驗室人工飼養(yǎng)蜜蜂幼蟲評價農(nóng)藥對蜜蜂幼蟲毒性的方法，包括以下步驟：

(1)蜜蜂幼蟲的準備

在蜂王產(chǎn)卵期內(nèi)，選擇三箱四周內(nèi)未用藥的、健康的、已知來源和生理狀態(tài)的蜂群。打開蜂箱蓋各插入1張空脾，用隔王板將蜂王固定在空脾上產(chǎn)卵，24小時后去掉隔王板將蜂王放出，檢查新產(chǎn)卵情況。根據(jù)蜂王的生育能力，可適當縮短隔離時間，以減少幼蟲之間的大小和年齡差異。含有蜂卵的蜂脾繼續(xù)留在蜂箱內(nèi)，直到孵化(蜂卵孵化期一般為3天)。

(2)蜜蜂幼蟲的實驗室飼養(yǎng)

從蜂箱內(nèi)取出所插入的蜂脾，挑取所述蜜蜂幼蟲置于裝有蜜蜂幼蟲基礎(chǔ)日糧的孔板上，放入培養(yǎng)箱內(nèi)進行飼養(yǎng)。

實驗室內(nèi)利用48孔板來飼喂蜜蜂幼蟲。

幼蟲基礎(chǔ)日糧配方為新鮮蜂王漿占50％，無菌水占37％，葡萄糖占6％，果糖占6％，酵母提取物占1％。具體操作方法為：配制好幼蟲基礎(chǔ)日糧，置于培養(yǎng)箱內(nèi)預熱30分鐘，按每個孔中添加50μL幼蟲日糧到48孔板內(nèi)。

從蜂脾中移取1日齡后期的蜜蜂幼蟲至盛有蜜蜂幼蟲基礎(chǔ)日糧的48孔板內(nèi)，每孔一只幼蟲，將48孔板置于箱底部裝有1L滅菌的甘油水混合液(15.5％甘油+84.5％水)的密閉小整理箱中，置于34±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，以后每24小時，更換孔板中的幼蟲基礎(chǔ)日糧。

(3)受試農(nóng)藥的準備

受試農(nóng)藥用蒸餾水溶解，對于難溶化合物選用對蜜蜂幼蟲無毒性的有機溶劑助溶，其中溶劑的量不超過飲食體積的5％，增加溶劑對照組。試驗至少設(shè)置5個濃度處理組。

(4)受試農(nóng)藥的添加

受試時，步驟(2)中所挑取的蜜蜂幼蟲經(jīng)三天適應性飼養(yǎng)(溫度34±1℃，濕度95％)，于第4天進行健康檢查，剔除異常、生病、受傷的幼蟲，分配到各處理組中。將1μL受試農(nóng)藥分別添加到基礎(chǔ)日糧中制成受試飼料，利用該受試飼料飼喂各處理組的蜜蜂幼蟲，每24小時，更換孔板中的飼料，連續(xù)飼喂3天，隨后進入蛹化期，不再喂食。觀察幼蟲在孔中完成排便、吐絲、化蛹和羽化的過程。

實施例3：

用類似實施例2的方法，以意大利蜜蜂幼蟲為研究對象，以典型新煙堿類農(nóng)藥吡蟲啉為代表，開展農(nóng)藥對蜜蜂幼蟲毒性研究。蜜蜂幼蟲準備完成后，試驗第1d，從三個蜂群上選取1日齡后期幼蟲，置于48孔板上，喂食等量的基礎(chǔ)日糧，經(jīng)三天適應性飼養(yǎng)(溫度34±1℃，濕度95％)，試驗開始后的第4d進行健康檢查，剔除異常、生病、受傷的幼蟲，再分配到各處理組中。試驗設(shè)置1個空白對照組(C1，始終喂基礎(chǔ)日糧)，1個溶劑對照組(C2，始終喂基礎(chǔ)日糧)及5，50，500，1000，2000和3000mg·L^-1 6個濃度處理組(于試驗開始后的第4d、5d和6d每天分別添加1μL藥液于基礎(chǔ)日糧中喂食)。連續(xù)飼喂3天，隨后進入蛹化期，不再喂食。觀察幼蟲在孔中完成排便、吐絲、化蛹和羽化的過程。

試驗結(jié)果表明，吡蟲啉處理劑量為15ng·幼蟲^-1時，并不影響蜜蜂幼蟲存活率、化蛹率和羽化率；當處理劑量達到150ng·幼蟲^-1時，蜜蜂幼蟲羽化率下降，但不影響蜜蜂幼蟲的存活率和化蛹率；幼蟲7天半數(shù)致死劑量為2300ng·幼蟲^-1。

實施例4：

用類似實施例2的方法，以意大利蜜蜂幼蟲為研究對象，以典型新煙堿類農(nóng)藥呋蟲胺為代表，開展農(nóng)藥對蜜蜂幼蟲毒性研究。試驗設(shè)置1個空白對照組(C1，始終喂基礎(chǔ)日糧)，1個溶劑對照組(C2，始終喂基礎(chǔ)日糧)及1，5，50，500，1500和3000mg·L^-1 6個濃度處理組。其他步驟采用與實施例3類似的方法進行受試。

試驗結(jié)果表明，呋蟲胺處理劑量為3ng·幼蟲^-1時，并不影響蜜蜂幼蟲存活率、化蛹率和羽化率；當處理劑量達到15ng·幼蟲^-1時，蜜蜂幼蟲羽化率下降，但不影響蜜蜂幼蟲的存活率和化蛹率；幼蟲7天半數(shù)致死劑量為577ng·幼蟲^-1。