本發(fā)明涉及水產(chǎn)品養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種降低半靜態(tài)養(yǎng)殖水中毒死蜱誘導(dǎo)斑馬魚死亡率的方法。

背景技術(shù)：

高毒有機(jī)磷農(nóng)藥的替代品種毒死蜱被廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和草坪殺蟲劑，已造成環(huán)境水體污染。毒死蜱對人類屬于中低毒農(nóng)藥，但是魚類的敏感類農(nóng)藥。毒死蜱屬于神經(jīng)毒劑，其功能之一是抑制機(jī)體內(nèi)神經(jīng)中乙酰膽堿酯酶AChE或膽堿酯酶ChE的活性，破壞正常的神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)，引起斑馬魚中毒死亡。另外，機(jī)體在正常情況下，體內(nèi)氧自由基處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。 一旦氧自由基在機(jī)體內(nèi)失去平衡，如超過了細(xì)胞抗氧化防護(hù)的能力，則會(huì)造成氧脅迫。研究表明，達(dá)到半致死濃度的毒死蜱會(huì)破壞機(jī)體氧自由基平衡，形成氧化脅迫，造成機(jī)體損傷、死亡。

對于斑馬魚，如果血清中毒死蜱濃度升高，酶活性將會(huì)降低，解毒功能下降。魚類有機(jī)磷農(nóng)藥中毒，多用“阿托品”灑入養(yǎng)殖水中進(jìn)行解毒，降低致死率。但是“阿托品”易于魚體內(nèi)聚集，具有明顯的生理副作用。同時(shí)如果滯留在養(yǎng)殖廢水中，擴(kuò)散到其他環(huán)境介質(zhì)，易造成環(huán)境危害。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是一種來源于植物的多酚化合物，具有抗氧化、抗癌、抗突變等生理活性，這些功效歸結(jié)于他們對氧自由基的清除能力。研究表明EGCG具有與腸、肝、和肺中的其他酶共同阻止某些有害物質(zhì)的活力，保護(hù)機(jī)體。最新研究證明EGCG可能具有神經(jīng)保護(hù)功能。到目前為止， EGCG仍然被認(rèn)為是具有環(huán)境友好性的純天然試劑。

斑馬魚是生態(tài)和環(huán)境指示性生物，在生態(tài)、環(huán)境和毒理等方面極具研究價(jià)值，同時(shí)又具有觀賞性等其他用途，其養(yǎng)殖通常在小體積半靜態(tài)水中進(jìn)行。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種降低半靜態(tài)養(yǎng)殖水中毒死蜱誘導(dǎo)斑馬魚死亡率的方法，采用EGCG降低水中毒死蜱誘導(dǎo)斑馬魚死亡率 。本發(fā)明針對半靜態(tài)水中斑馬魚對毒死蜱的暴露，檢測、調(diào)控水中毒死蜱的濃度，通過添加EGCG，調(diào)整半靜態(tài)水中EGCG與毒死蜱濃度比 ，來降低斑馬魚的死亡率。發(fā)明方法簡單易行，可提高斑馬魚暴露于毒死蜱的存活率，避免使用化學(xué)解毒劑帶來的后續(xù)副作用，提高養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益；同時(shí)避免排放廢水中化學(xué)解毒劑的二次污染，提高環(huán)境經(jīng)濟(jì)效益。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種降低半靜態(tài)養(yǎng)殖水中毒死蜱誘導(dǎo)斑馬魚死亡率的方法，其特征在于： 在含有毒死蜱的半靜態(tài)養(yǎng)殖水中添加適量的EGCG ，使得養(yǎng)殖水中EGCG與毒死蜱的濃度比=（1-2）：1，所述的毒死蜱在水中的濃度為0.48-0.70 mg/L 。

所述的一種降低半靜態(tài)養(yǎng)殖水中毒死蜱誘導(dǎo)斑馬魚死亡率的方法，其特征在于，具體操作步驟如下：

（1）取適量養(yǎng)殖水，測量水中毒死蜱母體起始濃度、pH值、水溫，調(diào)整養(yǎng)殖水的pH=6.8~8.5，控制水溫為18～25℃；

（2）根據(jù)步驟（1）測量得到的水中毒死蜱母體起始濃度，然后按比例加水稀釋至毒死蜱的濃度為0.48-0.70mg/L， 在按比例向養(yǎng)殖水中加入已預(yù)先配制好的高濃度EGCG水溶液，使水中EGCG與毒死蜱的濃度比=（1-2）：1， 其中，最佳配比為 EGCG：毒死蜱=（0.5-1.0）：0.5，（mg/L：mg/L），即可有效控制斑馬魚死亡，達(dá)到降低半靜態(tài)養(yǎng)殖水中毒死蜱誘導(dǎo)斑馬魚死亡率的目的。

所述高濃度EGCG溶液是指由純度≥90%的EGCG粉狀固體配制成濃度≥5.0g/L的EGCG溶液。

本發(fā)明涉及利用純植物提取劑EGCG的配比和使用方法，降低水中斑馬魚對毒死蜱的暴露死亡率。相關(guān)研究實(shí)驗(yàn)如下：

配制高濃度毒死蜱和EGCG的溶液，逐級稀釋用于添加試劑。供試生物選室內(nèi)馴養(yǎng)7d以上，自然死亡率小于2%，平均體長2~3cm的斑馬魚。試驗(yàn)前一天停止喂食。實(shí)驗(yàn)將供試魚分為三組（G_{n（1、2、3）}），每組按照EGCG與毒死蜱的不同配比，分不同水平（GnL（1、2、3…7 ））。每組每個(gè)水平設(shè)3個(gè)平行樣，并設(shè)置相應(yīng)的對照組，用已曝氣的水進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)觀察到，72小時(shí)處理過程中毒死蜱與EGCG配比組，水環(huán)境pH值變化在7.6~8.1之間。觀察24、48、72h后的死亡率，提取72h處理后斑馬魚頭部的乙酰膽堿酯酶和肝臟的谷胱甘肽進(jìn)行測定。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：

1斑馬魚死亡率變化：72小時(shí)馴養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，斑馬魚的毒死蜱半致死濃度為0.5mg/L，EGCG沒有誘導(dǎo)死亡。水中含有0.5mg/L的毒死蜱時(shí)，斑馬魚的死亡率分別是：24h為40%；48h和72h均為60%。添加不同比例的EGCG后，斑馬魚的死亡率明顯降低。EGCG與毒死蜱的配比在0.25：1至4：1之間，EGCG均可以降低斑馬魚72小時(shí)內(nèi)死亡率。但是不同配比，降低的程度不同。0.25：1至0.5：1之間倍比，死亡率從低配比的50%向高配比的死亡率20%逐漸降低；配比為1：1至 2：1時(shí)，72h內(nèi)的死亡率均為0%；3至4倍比時(shí)死亡率為10%。實(shí)驗(yàn)表明存在EGCG與毒死蜱的最佳配比范圍內(nèi)，最大限度的降低斑馬魚死亡率； EGCG降低毒死蜱致斑馬魚死亡率有最佳配比范圍，即EGCG：毒死蜱（mg/L: mg/L）= 1：1至2：1之間。同時(shí)當(dāng)水中毒死蜱分別為0.6、0.7mg/L時(shí)，添加EGCG也有效的降低了斑馬魚死亡率。

2斑馬魚腦部AChE變化：斑馬魚腦部乙酰膽堿酯酶活性測定表明，比較毒死蜱存在時(shí)斑馬魚腦部AChE，EGCG的出現(xiàn)極大的提高了斑馬魚腦部AChE的濃度。 0.5mg/L毒死蜱濃度水平下，斑馬魚AChE濃度為3.8U/ mgprot，添加0.25：1至4.0：1之間的不同配比EGCG， AChE濃度基本按照遞增規(guī)律上升，最高至14.00 U/ mgprot（EGCG：毒死蜱=2:1），之后略有下降，但仍維持在12.00 U/ mgprot。相較于沒有添加EGCG，EGCG的出現(xiàn)提高AChE的濃度最高達(dá)368%。同時(shí)，這個(gè)AChE的水平變化與相應(yīng)的斑馬魚死亡率相對應(yīng)。0.6mg/L毒死蜱濃度水平下，雖然斑馬魚死亡率變化成波狀不穩(wěn)定的趨勢，AChE的變化也基本與之相呼應(yīng)。說明，EGCG對斑馬魚腦部AChE的濃度提高是影響斑馬魚死亡率的重要原因之一，并且在一定濃度的毒死蜱水平下作用有效。

3谷胱甘肽酶活性變化：0.5mg/L毒死蜱濃度降低了87.6%谷胱甘肽酶的活性濃度值。但是添加了不同配比水平的EGCG，改善了谷胱甘肽酶受毒死蜱抑制的狀況，提高了谷胱甘肽酶的活性。這種提高不是隨著EGCG配比的增加而增加，而是呈現(xiàn)不穩(wěn)定的趨勢。EGCG：毒死蜱=1:2（EGCG濃度為0.25mg/L）提高的比率達(dá)到最大值88.7%，另一個(gè)峰值是EGCG：毒死蜱=4:1（EGCG濃度為2.0mg/L），提高率達(dá)86.5%。

0.6mg/L，0.7mg/L毒死蜱濃度水平時(shí)，添加EGCG同樣不同程度的提高了谷胱甘肽酶活性，并且和0.5mg/L水平一樣，影響沒有一定的規(guī)律。0.6mg/L毒死蜱，添加EGCG使EGCG：毒死蜱=1:4，提高92.0%的谷胱甘肽酶活性；另一個(gè)峰值為EGCG：毒死蜱=3:1，提高94.6%，達(dá)到最大。0.7mg/L毒死水平下，EGCG提高谷胱甘肽酶活性比率較小，峰值在EGCG：毒死蜱=1:2，和EGCG：毒死蜱=3:1處。

乙酰膽堿酯酶和谷胱甘肽酶均是有機(jī)磷農(nóng)藥和其他污染物的靶標(biāo)物質(zhì)。養(yǎng)殖水中注入與誘導(dǎo)斑馬魚死亡的毒死蜱具有一定配比的EGCG后，明顯提高了被毒死蜱抑制的斑馬魚的乙酰膽堿酯酶的活性，抑制了毒死蜱誘導(dǎo)的斑馬魚腦部毒性；同時(shí)提高斑馬魚肝部谷胱甘肽酶活性，提高機(jī)體抗氧化力，抑制毒死蜱誘導(dǎo)的斑馬魚肝部毒性。這些影響可能降低了因毒死蜱誘導(dǎo)的水中斑馬魚的死亡率。

本發(fā)明對半靜態(tài)水中斑馬魚對毒死蜱的暴露，檢測、調(diào)控水中毒死蜱的濃度，通過添加EGCG試劑，調(diào)整 EGCG與水中毒死蜱的濃度比，達(dá)到降低斑馬魚的死亡率。發(fā)明方法通過原位或異位技術(shù)實(shí)施，簡單易行，可提高斑馬魚暴露于毒死蜱的存活率，避免使用化學(xué)解毒劑帶來的后續(xù)副作用，提高養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益；同時(shí)避免排放廢水中化學(xué)解毒劑的二次污染，提高環(huán)境經(jīng)濟(jì)效益。

附圖說明

圖 1為養(yǎng)殖單元處理示意圖。

圖2 為 0.5 mg/L 毒死蜱暴露下不同暴露時(shí)間和EGCG配比死亡率。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例：

1 一個(gè)如圖1所示的處理單元。單元體積為0.5 m³ ，EGCG配制裝置。設(shè)取樣口（取水樣測定毒死蜱濃度），進(jìn)水口，多孔進(jìn)EGCG溶液口，攪拌裝置等。

2 進(jìn)水毒死蜱濃度調(diào)節(jié)由進(jìn)水部分完成：依據(jù)測定的原水毒死蜱濃度，原水由進(jìn)水口1輸入，一定體積比例的稀釋水由進(jìn)水口2輸入，混合并稀釋后，使進(jìn)水毒死蜱濃度為0.5mg/l , 輸入處理單元。

3 EGCG注入方式1：單點(diǎn)重力注入，將EGCG注入稀釋水中，共同由進(jìn)水管輸入，依賴水的流動(dòng)混合后，共同注入處理單元。EGCG注入方式2：多孔重力注入，由EGCG配制設(shè)備通過多點(diǎn)位直接將EGCG注入處理單元，設(shè)多個(gè)溶液注入口。 兩種方法均啟動(dòng)緩速攪拌，20min內(nèi)，將EGCG與水混合均勻，達(dá)到EGCG：毒死蜱= 1：1至2：1之間的配比要求。

圖2表明0.5mg/l 毒死蜱水平下，EGCG和毒死蜱的不同配比作用時(shí)， EGCG （mg/l）：毒死蜱（mg/l）=0.5：0.5至1.0：0.5之間斑馬魚的死亡率最低。