本發(fā)明屬于細胞凍存領(lǐng)域，尤其涉及細胞凍存液及細胞凍存方法。

背景技術(shù)：

脂肪干細胞即脂肪來源間充質(zhì)干細胞(adipose-derivedstemcells，adscs)，是近年來從脂肪組織中分離得到的一種尚不成熟的具有自我復(fù)制能力的多潛能細胞。在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞，具有再生各種組織器官的潛在功能。

脂肪干細胞在無菌條件下從人體自身組織中取出，經(jīng)分離、純化后在模擬的體內(nèi)生理條件下，通過核心的優(yōu)化技術(shù)將其在體外進行培養(yǎng)，使未完全分化的細胞不斷地分化生長,大量增殖，并使細胞保持良好的生長狀態(tài)，以及旺盛的增殖活力，然后注射回自身，從而提高人體整個器官功能，改善機能老化狀態(tài)，滿足各種治療需要。因此，脂肪干細胞目前已廣泛地應(yīng)用于衰老醫(yī)學和再生組織工程。

但是，脂肪干細胞分離培養(yǎng)的周期比較長，多次傳代后容易分化或失去多向分化的潛能。而科研研究以及臨床應(yīng)用中對脂肪干細胞的需求非常強烈，需要隨時提供大批量的脂肪干細胞，因此，有必要將生產(chǎn)好的脂肪干細胞進行冷凍保存，待到有使用需求時再復(fù)蘇使用。然而，目前常見的脂肪干細胞凍存液往往含有動物血清和dmso。動物血清容易給細胞引入外源性病毒，給脂肪干細胞的臨床應(yīng)用帶來潛在風險。dmso對脂肪干細胞具有毒性，容易對細胞造成損傷。而且傳統(tǒng)的細胞凍存過程需要程序降溫，操作繁瑣。

因此，尋找一種無毒、凍存效果好的細胞凍存液和操作簡單的凍存方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供了細胞凍存液及細胞凍存方法能有效解決現(xiàn)有技術(shù)的凍存液凍存效果差和現(xiàn)有凍存方法操作繁瑣的技術(shù)缺陷。

本發(fā)明提供了一種細胞凍存液，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血小板裂解物、bfgf和l-谷氨酰胺。

作為優(yōu)選，所述血小板裂解物在所述細胞凍存液的體積百分比為5％。

作為優(yōu)選，所述bfgf在所述細胞凍存液的濃度為50ng/ml。

作為優(yōu)選，所述l-谷氨酰胺在所述細胞凍存液的濃度為4mmol/l。

其中，所述細胞凍存液包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血小板裂解物、bfgf和l-谷氨酰胺；所述血小板裂解物在所述細胞凍存液的體積百分比為5％；所述bfgf在所述細胞凍存液的濃度為50ng/ml；所述l-谷氨酰胺在所述細胞凍存液的濃度為4mmol/l。

作為優(yōu)選，所述細胞凍存液還包括羥乙基淀粉、海藻糖、羧甲基纖維素鈉和甘油中的至少一種。

作為優(yōu)選，所述羥乙基淀粉在所述細胞凍存液體積百分比為0％～5％；所述海藻糖在所述細胞凍存液體積百分比為0％～5％；所述羧甲基纖維素鈉在所述細胞凍存液體積百分比為0％～0.1％；所述甘油在所述細胞凍存液體積百分比為0％～20％。

次優(yōu)選的，所述細胞凍存液所述細胞凍存液包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血小板裂解物、bfgf、l-谷氨酰胺、羥乙基淀粉、海藻糖、羧甲基纖維素鈉和甘油；所述血小板裂解物在所述細胞凍存液的體積百分比為5％；所述bfgf在所述細胞凍存液的濃度為50ng/ml；所述l-谷氨酰胺在所述細胞凍存液的濃度為4mmol/l；所述羥乙基淀粉在所述細胞凍存液體積百分比為1％～5％，所述海藻糖在所述細胞凍存液體積百分比為1％～5％，所述羧甲基纖維素鈉在所述細胞凍存液體積百分比為0.05％～0.1％，所述甘油在所述細胞凍存液體積百分比為5％～20％。

更為優(yōu)選，所述細胞凍存液所述細胞凍存液包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血小板裂解物、bfgf、l-谷氨酰胺、羥乙基淀粉、海藻糖、羧甲基纖維素鈉和甘油；所述血小板裂解物在所述細胞凍存液的體積百分比為5％；所述bfgf在所述細胞凍存液的濃度為50ng/ml；所述l-谷氨酰胺在所述細胞凍存液的濃度為4mmol/l；所述羥乙基淀粉在所述細胞凍存液體積百分比為5％，所述海藻糖在所述細胞凍存液體積百分比為5％，所述羧甲基纖維素鈉在所述細胞凍存液體積百分比為0.1％，所述甘油在所述細胞凍存液體積百分比為20％。

作為優(yōu)選，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為dmem/f12。

本發(fā)明還公開了一種細胞凍存方法，包括：

1)配置細胞凍存液；

2)將干細胞與步驟1)的凍存液按照5×10⁶個/ml～1×10⁷個/ml的密度混合，得到混合物；

3)將步驟2)的混合物直接置于-80℃凍存8-24h后轉(zhuǎn)存于液氮保存；

或，將步驟2)的混合物置于4℃凍存40min，然后放入-20℃凍存2h，再放入-80℃凍存3h，最后轉(zhuǎn)入液氮中保存。

其中，所述步驟1)的細胞凍存液為上述制備得到的細胞凍存液。

本發(fā)明所公開的細胞凍存液和細胞凍存方法在凍存脂肪干細胞中的應(yīng)用。

其中，所述血小板裂解物可以降低溶液中電解質(zhì)的濃度，減少陽離子進入細胞的數(shù)量；所述羥乙基淀粉和所述海藻糖優(yōu)先與溶液中的水分子相結(jié)合，降低溶液中自由水的含量，使冰點降低，減少冰晶的形成；同時，由于其分子量大，使溶液中電解質(zhì)濃度降低，從而減輕溶質(zhì)損傷；所述甘油，能在細胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細胞內(nèi)，使細胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護細胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷；所述羧甲基纖維素鈉，能分散和乳化細胞懸液，減小細胞在凍存中聚集成團。

本發(fā)明的目的針對現(xiàn)有凍存液往往含有動物血清和dmso，其中，動物血清容易給細胞引入外源性病毒，給脂肪干細胞的臨床應(yīng)用帶來潛在風險；dmso對脂肪干細胞具有毒性，容易對細胞造成損傷；此外，傳統(tǒng)的細胞凍存方法過程需要程序降溫，操作繁瑣中。本發(fā)明提供的細胞凍存液，包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血小板裂解物、bfgf、l-谷氨酰胺、羥乙基淀粉、海藻糖、羧甲基纖維素鈉和甘油，該細胞凍存液不含動物血清和不含dmso，消除動物血清可能引入外源性病毒的可能性和消除dmso對脂肪干細胞的不良影響；本發(fā)明公開的細胞凍存液與細胞混合后能采用-80℃凍存后轉(zhuǎn)存液氮，無需復(fù)雜的程序性降溫，操作簡單。采用本發(fā)明公開的細胞凍存液和凍存法凍存脂肪干細胞一年后，細胞存活率能達到93％，且不影響脂肪干細胞分化能力。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1是采用實施例3凍存復(fù)蘇的p6代細胞的成脂分化圖。

具體實施方式

本發(fā)明提供了細胞凍存液及其細胞凍存方法，用于解決現(xiàn)有技術(shù)的凍存液凍存效果差和現(xiàn)有凍存方法操作繁瑣的技術(shù)缺陷。

下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

其中，以下實施例所用的試劑均為市售。

實施例1

以dmem/f12為基礎(chǔ)溶液，加入血小板裂解物、bfgf、l-谷氨酰胺、羥乙基淀粉、海藻糖、羧甲基纖維素鈉、甘油、dmso和fbs，使血小板裂解物、bfgf、l-谷氨酰胺、羥乙基淀粉、海藻糖、羧甲基纖維素鈉、甘油、dmso和fbs在細胞凍存液的終濃度/體積百分比分別對應(yīng)為5％(v/v)、50ng/ml、4mmol/l、0％～5％(v/v)、0％～5％(v/v)、0％～0.1％(v/v)、0％～20％(v/v)、5％(v/v)和10％(v/v)。其中，在細胞凍存液添加的具體體積百分比/濃度如表1所示。

表1試驗組1～11與對比例1～2的細胞凍存液的配方

實施例2

脂肪干細胞凍存、復(fù)蘇，步驟如下：

細胞凍存：取培養(yǎng)至p6代的脂肪干細胞，消化、離心收集后，用實施例1配置的試驗組1～11和對比例1～2的凍存液分別重懸細胞，脂肪干細胞在凍存液中的密度為1×10⁷個/ml。

凍存方法一：先將細胞在4℃凍存40min，然后放入-20℃凍存2h，再放入-80℃凍存3h。最后轉(zhuǎn)入液氮中保存。分別凍存1周、1個月、6個月和1年。

凍存方法二：直接將細胞放入-80℃凍存12小時后轉(zhuǎn)存于液氮中保存。分別凍存1周、1個月、6個月和1年。

復(fù)蘇：從液氮罐中取出凍存管，快速置于38℃水浴鍋中，輕輕震蕩凍存管，直至細胞懸液完全融化。

實施例3

將實施例2采用兩種方法凍存的脂肪干細胞進行復(fù)蘇后檢測細胞存活率，步驟如下：

活率檢測：細胞復(fù)蘇后，用dmem/f12培養(yǎng)基稀釋，于1200rpm/min，離心3min，棄上清后，用dmem/f12培養(yǎng)基重懸細胞，計算脂肪干細胞進行復(fù)蘇后的細胞存活率，結(jié)果見表2和表3。

其中，凍存方法一為先將復(fù)蘇的細胞在4℃凍存40min，然后放入-20℃凍存2h，再放入-80℃凍存3h。最后轉(zhuǎn)入液氮中保存。分別凍存1周、1個月、6個月和1年；凍存方法二為直接將細胞放入-80℃凍存12小時后轉(zhuǎn)存于液氮中保存。分別凍存1周、1個月、6個月和1年。

表2凍存方法一凍存的細胞復(fù)蘇后細胞存活率統(tǒng)計表

表3凍存方法二凍存的細胞復(fù)蘇后細胞存活率統(tǒng)計表

如表2和表3所示，采用本發(fā)明提供的凍存液，程序性降溫(凍存方法一)，試驗組1～11之間凍存的細胞在液氮中保存一年后，細胞存活率均大于94％，而對比例1～2凍存一年后細胞存活只達到90％，直接將細胞放入-80℃凍存12h后轉(zhuǎn)存于液氮中保存(凍存方法二)中試驗組1～7凍存一年后細胞存活率均大于93％，試驗組8～11凍存一年后細胞存活率均有所下降，這是因為試驗組8～11凍存液缺少羥乙基淀粉，海藻糖、羧甲基纖維素鈉或甘油中的某一成分，實驗說明這些成分對于采用凍存方法二時起到重要的保護作用，復(fù)蘇后存活率才大大提高；而比較例1～2為直接將細胞放入-80℃凍存12h后轉(zhuǎn)存于液氮中保存時，復(fù)蘇后大部分死亡，凍存一年后細胞存活率只有6％。

實施例4

成脂誘導(dǎo)分化能力檢測，步驟如下：

采用adipogenesisdifferentiationkit(gibco)試劑盒對所獲取的脂肪干細胞進行成脂誘導(dǎo)分化實驗。

取采用試驗組3的凍存液放入-80℃凍存12h后轉(zhuǎn)存于液氮中保存的p6脂肪干細胞，以2×10⁴個/孔接種于12孔板，37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后細胞融合度達到約80％時，將所有脂肪干細胞平均分成兩半，一半的脂肪干細胞將細胞培養(yǎng)液更換成誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，標記為試驗組，每3天換新鮮誘導(dǎo)液；另一半的脂肪干細胞將細胞培養(yǎng)液更換普通培養(yǎng)基，標記為對照組，每3天更換新鮮普通培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)14-21天。誘導(dǎo)14-21天后，油紅0染色鑒定，將試驗組和對照組造染色前與染色后進行分化能力檢測。

結(jié)果如圖1所示，采用試驗組3直接凍存到-80℃，12h再轉(zhuǎn)存于液氮中保存6個月的p6代脂肪干細胞的仍然具有成脂分化能力，表明采用試驗組3所配置的凍存液在不經(jīng)過常規(guī)的程序性降溫的情況下，對脂肪干細胞的成脂分化能力沒有影響。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。