本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，具體地，涉及一種便捷的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞的凍存方法。

背景技術(shù)：

乳腺癌是女性最常見的癌癥，主要包括導(dǎo)管癌和小葉癌。2016年美國ca（acancerjournalforclinicians）公布的最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，美國2016年預(yù)計將有420840例女性患乳腺癌，占女性新發(fā)惡性腫瘤的38%，居女性惡性腫瘤發(fā)病率第一位，并且死亡人數(shù)將達(dá)52930例。更為嚴(yán)重的是全球的乳腺癌發(fā)病率正在逐年增長。

細(xì)胞培養(yǎng)是生物與健康相關(guān)研究領(lǐng)域的一項重要技術(shù)。隨著生命科學(xué)的迅速發(fā)展，目前細(xì)胞培養(yǎng)已成為細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和免疫學(xué)等學(xué)科研究的重要基礎(chǔ)。為了深入探討細(xì)胞的生長活動規(guī)律、有關(guān)疾病的病理和藥物的藥理（毒理）機制，開發(fā)具有不同針對性的細(xì)胞培養(yǎng)方法具有重要意義。

其中，mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞作為人源性高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞，常用于乳腺癌的體內(nèi)外研究。然而，隨著研究過程中越來越多的運用組織細(xì)胞培養(yǎng)增殖技術(shù)，將mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞采用低溫度進(jìn)行長期保存數(shù)月、數(shù)年、數(shù)十年甚至數(shù)百年，一旦需要，可隨時對所保存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，恢復(fù)其完整的形態(tài)結(jié)構(gòu)與生物學(xué)特性，供生命科學(xué)研究實驗。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明提供了一種便捷的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞的凍存方法，用于多種人源以及非人源細(xì)胞的培養(yǎng)。

技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種便捷的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞的凍存方法，包括以下步驟：用移液槍將培養(yǎng)基吸盡，加入3-5mlpbs洗滌mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞2-3次，向細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入1-2ml0.38%的胰蛋白酶，于37℃條件下消化3-5min，加入2-3ml的新鮮的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基，使用移液槍吹打細(xì)胞培養(yǎng)皿底部40-50次；將液體移至細(xì)胞離心管中，在1000-1500g/min條件下離心3-10min，用移液槍去除上清液，加入mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用凍存液，使用移液槍上下吹打mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞40-50次，加入到細(xì)胞凍存管中，擰緊凍存管蓋，用封口膜封住凍存管；在2-7℃保存10-30min，再于-15--20℃保存40-60min，然后移入到≤-80℃環(huán)境進(jìn)行細(xì)胞凍存；其中所述mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用凍存液以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞砜5-15份、羥甲基淀粉2-5份、海藻糖3-12份、維生素e0.5-3份、25%山梨醇1-5份、丙二醇0.8-1.6份、(s)-(-)-1-(4-氟異喹啉-5-基)磺?；?2-甲基-1,4-二氮環(huán)庚烷0.5-2份和基礎(chǔ)培養(yǎng)基80-90份。本發(fā)明所述的便捷的的細(xì)胞凍存方法，安全性、穩(wěn)定性好，凍存后的細(xì)胞復(fù)蘇后存活率高，其中mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用凍存液，組分合理，營養(yǎng)豐富，其中，25%山梨醇為滲透性保護(hù)液，而(s)-(-)-1-(4-氟異喹啉-5-基)磺?；?2-甲基-1,4-二氮環(huán)庚烷則抑制細(xì)胞活動和基因表達(dá)，維生素e的抗氧化性好，在保證休眠細(xì)胞的營養(yǎng)的同時還可以顯著減少對細(xì)胞的損傷，提高凍存細(xì)胞的存活率，并且在增殖方面也保持很好的狀態(tài)。

進(jìn)一步的，上述的便捷的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞的凍存方法，凍存的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞在≤-80℃環(huán)境過夜凍存后，第二天放入液氮罐中在液氮浸沒于液氮中進(jìn)行細(xì)胞凍存。液氮中保存可以進(jìn)一步延長mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞的保存時間，可以在數(shù)年、數(shù)十年后仍然保持很好的細(xì)胞存活率以及細(xì)胞活性。

進(jìn)一步的，上述的便捷的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞的凍存方法，每支凍存管中mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞凍存密度為10⁵-10⁶個細(xì)胞。細(xì)胞密度合理，可以有效保證細(xì)胞的存活率及細(xì)胞活性。

進(jìn)一步的，上述的便捷的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞的凍存方法，所述胰蛋白酶中還包含0.5%的edta?？梢耘c胰蛋白酶相配合，迅速使貼壁細(xì)胞脫離培養(yǎng)皿，減少胰蛋白酶對細(xì)胞的損傷。

進(jìn)一步的，上述的便捷的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞的凍存方法，所述mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基包括70-90%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及10-30%的胎牛血清。胎牛血清可以進(jìn)一步為培養(yǎng)的細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)，同時還能終止胰蛋白酶的消化作用。

進(jìn)一步的，上述的便捷的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞的凍存方法，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖82-88份、碳酸氫鈉12-25份、丙酮酸鈉10-16份、脂肪酸白蛋白6-12份、氯化鉀35-45份、無水硫酸鎂6-10份、氯化鈉70-78份、無水磷酸二氫鈉10-14份、葉酸0.3-0.5份、肌醇0.8-1.2份、煙酰胺0.3-0.6份、無水氯化鈣25-35份、硝酸鐵0.2-0.4份、丁二酸6-8份、丁二酸鈉12-16份、d-泛酸鈣0.3-0.6份、n-異丙基甲基丙烯酰胺0.4-0.6份、酒石酸膽堿0.6-0.8份、核黃素0.1-0.3份、鹽酸硫胺0.2-0.4份、鹽酸吡哆辛0.3-0.5份、l-丙酰胺-l-谷氨二肽0.4-0.8份、乙酸酯1.5-2份、生物素0.6-0.8份、硫辛酸0.4-0.7份、酚紅鈉1-1.3份和去離子水100份。

進(jìn)一步的，上述的便捷的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞的凍存方法，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括3-8份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸5-10份、l-鹽酸胱氨酸3-8份、l-絲氨酸3-6份、甘氨酸1-5份、l-鹽酸組氨酸4-6份、l-異亮氨酸8-20份、l-亮氨酸7-18份、l-鹽酸賴氨酸10-20份、l-甲硫氨酸1-6份、l-苯丙氨酸2-8份、l-蘇氨酸5-15份、l-色氨酸1-3份、l-酪氨酸5-9份和l-纈氨酸8-12份。

進(jìn)一步的，上述的便捷的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞的凍存方法，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括2-5份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：胰島素生長因子3-8份、白介素62-5份、白介素101-4份、白介素123-6份、tnf-β2-10份、gm-csf1-5份。基礎(chǔ)培養(yǎng)基組分合理，營養(yǎng)豐富，可以提高細(xì)胞凍存時的營養(yǎng)物質(zhì)，保證凍存細(xì)胞的活性。

進(jìn)一步的，上述的便捷的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞的凍存方法，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素?？梢杂行Х乐箖龃婕?xì)胞被污染。

進(jìn)一步的，上述的便捷的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞的凍存方法，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。青霉素和鏈霉素活性好，效果佳。

有益效果：本發(fā)明所述的便捷的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞的凍存方法，方法合理，應(yīng)用成本低，在保證休眠細(xì)胞的營養(yǎng)的同時還可以顯著減少凍存對mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞的損傷，提高凍存細(xì)胞的存活率，并且在增殖方面也保持很好的狀態(tài)。

附圖說明

圖1為實施例1-4細(xì)胞存活率的測定圖。

具體實施方式

下面將通過幾個具體實施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，這些實施例只是為了說明問題，并不是一種限制。

實施例1

一種便捷的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞的凍存方法，包括以下步驟：用移液槍將培養(yǎng)基吸盡，加入3mlpbs洗滌mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞3次，向細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入1ml0.38%的胰蛋白酶，于37℃條件下消化5min，加入2ml的新鮮的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基，使用移液槍吹打細(xì)胞培養(yǎng)皿底部40次；將液體移至細(xì)胞離心管中，在1000g/min條件下離心10min，用移液槍去除上清液，加入mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用凍存液，使用移液槍上下吹打mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞40次，加入到細(xì)胞凍存管中，每支凍存管中mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞凍存密度為10⁵個細(xì)胞。擰緊凍存管蓋，用封口膜封住凍存管；在2℃保存10min，再于-15℃保存60min，然后移入到≤-80℃環(huán)境進(jìn)行細(xì)胞凍存，凍存的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞在≤-80℃環(huán)境過夜凍存后，第二天放入液氮罐中在液氮浸沒于液氮中進(jìn)行細(xì)胞凍存。

其中，所述mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基包括70%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及30%的胎牛血清。并且，所述mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用凍存液以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞砜5份、羥甲基淀粉2份、海藻糖3份、維生素e0.5份、25%山梨醇1份、丙二醇0.8份、(s)-(-)-1-(4-氟異喹啉-5-基)磺?；?2-甲基-1,4-二氮環(huán)庚烷0.5份和基礎(chǔ)培養(yǎng)基80份。

進(jìn)一步的，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖82份、碳酸氫鈉12份、丙酮酸鈉10份、脂肪酸白蛋白6份、氯化鉀35份、無水硫酸鎂6份、氯化鈉70份、無水磷酸二氫鈉10份、葉酸0.3份、肌醇0.8份、煙酰胺0.3份、無水氯化鈣25份、硝酸鐵0.2份、丁二酸6份、丁二酸鈉12份、d-泛酸鈣0.3份、n-異丙基甲基丙烯酰胺0.4份、酒石酸膽堿0.6份、核黃素0.1份、鹽酸硫胺0.2份、鹽酸吡哆辛0.3份、l-丙酰胺-l-谷氨二肽0.4份、乙酸酯1.5份、生物素0.6份、硫辛酸0.4份、酚紅鈉1份和去離子水100份。

另，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括3份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸5份、l-鹽酸胱氨酸3份、l-絲氨酸3份、甘氨酸1份、l-鹽酸組氨酸4份、l-異亮氨酸8份、l-亮氨酸7份、l-鹽酸賴氨酸10份、l-甲硫氨酸1份、l-苯丙氨酸2份、l-蘇氨酸5份、l-色氨酸1份、l-酪氨酸5份和l-纈氨酸8份。

再，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括2份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：胰島素生長因子3份、白介素62份、白介素101份、白介素123份、tnf-β2份、gm-csf1份。

又，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。并且，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。此外，所述胰蛋白酶中還包含0.5%的edta。

實施例2

一種便捷的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞的凍存方法，包括以下步驟：用移液槍將培養(yǎng)基吸盡，加入5mlpbs洗滌mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞2次，向細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入2ml0.38%的胰蛋白酶，于37℃條件下消化3min，加入3ml的新鮮的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基，使用移液槍吹打細(xì)胞培養(yǎng)皿底部50次；將液體移至細(xì)胞離心管中，在1500g/min條件下離心3min，用移液槍去除上清液，加入mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用凍存液，使用移液槍上下吹打mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞50次，加入到細(xì)胞凍存管中，每支凍存管中mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞凍存密度為10⁶個細(xì)胞。擰緊凍存管蓋，用封口膜封住凍存管；在7℃保存30min，再于-20℃保存40min，然后移入到≤-80℃環(huán)境進(jìn)行細(xì)胞凍存，凍存的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞在≤-80℃環(huán)境過夜凍存后，第二天放入液氮罐中在液氮浸沒于液氮中進(jìn)行細(xì)胞凍存。

其中，所述mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基包括90%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及10的胎牛血清。并且，所述mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用凍存液以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞砜15份、羥甲基淀粉5份、海藻糖12份、維生素e3份、25%山梨醇5份、丙二醇1.6份、(s)-(-)-1-(4-氟異喹啉-5-基)磺?；?2-甲基-1,4-二氮環(huán)庚烷2份和基礎(chǔ)培養(yǎng)基90份。

進(jìn)一步的，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖88份、碳酸氫鈉25份、丙酮酸鈉16份、脂肪酸白蛋白12份、氯化鉀45份、無水硫酸鎂10份、氯化鈉78份、無水磷酸二氫鈉14份、葉酸0.5份、肌醇1.2份、煙酰胺0.6份、無水氯化鈣35份、硝酸鐵0.4份、丁二酸8份、丁二酸鈉16份、d-泛酸鈣0.6份、n-異丙基甲基丙烯酰胺0.6份、酒石酸膽堿0.8份、核黃素0.3份、鹽酸硫胺0.4份、鹽酸吡哆辛0.5份、l-丙酰胺-l-谷氨二肽0.8份、乙酸酯2份、生物素0.8份、硫辛酸0.7份、酚紅鈉1.3份和去離子水100份。

另，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括8份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸10份、l-鹽酸胱氨酸8份、l-絲氨酸6份、甘氨酸5份、l-鹽酸組氨酸6份、l-異亮氨酸20份、l-亮氨酸18份、l-鹽酸賴氨酸20份、l-甲硫氨酸6份、l-苯丙氨酸8份、l-蘇氨酸15份、l-色氨酸3份、l-酪氨酸9份和l-纈氨酸12份。

再，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括5份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：胰島素生長因子8份、白介素65份、白介素104份、白介素126份、tnf-β10份、gm-csf5份。

又，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。并且，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。此外，所述胰蛋白酶中還包含0.5%的edta。

實施例3

一種便捷的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞的凍存方法，包括以下步驟：用移液槍將培養(yǎng)基吸盡，加入5mlpbs洗滌mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞3次，向細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入2ml0.38%的胰蛋白酶，于37℃條件下消化4min，加入3ml的新鮮的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基，使用移液槍吹打細(xì)胞培養(yǎng)皿底部45次；將液體移至細(xì)胞離心管中，在1500g/min條件下離心5min，用移液槍去除上清液，加入mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用凍存液，使用移液槍上下吹打mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞40次，加入到細(xì)胞凍存管中，每支凍存管中mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞凍存密度為6×10⁵個細(xì)胞。擰緊凍存管蓋，用封口膜封住凍存管；在5℃保存20min，再于-18℃保存50min，然后移入到≤-80℃環(huán)境進(jìn)行細(xì)胞凍存，凍存的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞在≤-80℃環(huán)境過夜凍存后，第二天放入液氮罐中在液氮浸沒于液氮中進(jìn)行細(xì)胞凍存。

其中，所述mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基包括80%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及20%的胎牛血清。并且，所述mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用凍存液以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞砜12份、羥甲基淀粉3份、海藻糖8份、維生素e2份、25%山梨醇3份、丙二醇1份、(s)-(-)-1-(4-氟異喹啉-5-基)磺酰基-2-甲基-1,4-二氮環(huán)庚烷1份和基礎(chǔ)培養(yǎng)基85份。

進(jìn)一步的，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖86份、碳酸氫鈉18份、丙酮酸鈉12份、脂肪酸白蛋白9份、氯化鉀40份、無水硫酸鎂8份、氯化鈉75份、無水磷酸二氫鈉12份、葉酸0.4份、肌醇1份、煙酰胺0.5份、無水氯化鈣30份、硝酸鐵0.3份、丁二酸7份、丁二酸鈉14份、d-泛酸鈣0.5份、n-異丙基甲基丙烯酰胺0.5份、酒石酸膽堿0.7份、核黃素0.2份、鹽酸硫胺0.3份、鹽酸吡哆辛0.4份、l-丙酰胺-l-谷氨二肽0.6份、乙酸酯1.8份、生物素0.7份、硫辛酸0.6份、酚紅鈉1.2份和去離子水100份。

另，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括4份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸8份、l-鹽酸胱氨酸6份、l-絲氨酸5份、甘氨酸3份、l-鹽酸組氨酸5份、l-異亮氨酸12份、l-亮氨酸10份、l-鹽酸賴氨酸15份、l-甲硫氨酸3份、l-苯丙氨酸4份、l-蘇氨酸9份、l-色氨酸2份、l-酪氨酸6份和l-纈氨酸9份。

再，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括3份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：胰島素生長因子5份、白介素63份、白介素102份、白介素125份、tnf-β8份、gm-csf2份。

又，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。并且，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。此外，所述胰蛋白酶中還包含0.5%的edta。

實施例4

一種便捷的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞的凍存方法，包括以下步驟：用移液槍將培養(yǎng)基吸盡，加入5mlpbs洗滌mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞2次，向細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入2ml0.38%的胰蛋白酶，于37℃條件下消化3min，加入3ml的新鮮的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基，使用移液槍吹打細(xì)胞培養(yǎng)皿底部40次；將液體移至細(xì)胞離心管中，在1200g/min條件下離心6min，用移液槍去除上清液，加入mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用凍存液，使用移液槍上下吹打mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞40次，加入到細(xì)胞凍存管中，每支凍存管中mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞凍存密度為10⁶個細(xì)胞。擰緊凍存管蓋，用封口膜封住凍存管；在4℃保存30min，再于-20℃保存45min，然后移入到≤-80℃環(huán)境進(jìn)行細(xì)胞凍存，凍存的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞在≤-80℃環(huán)境過夜凍存后，第二天放入液氮罐中在液氮浸沒于液氮中進(jìn)行細(xì)胞凍存。

其中，所述mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用培養(yǎng)基包括90%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及10%的胎牛血清。并且，所述mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞專用凍存液以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞砜5份、羥甲基淀粉5份、海藻糖9份、維生素e3份、25%山梨醇1份、丙二醇1份、(s)-(-)-1-(4-氟異喹啉-5-基)磺?；?2-甲基-1,4-二氮環(huán)庚烷1.5份和基礎(chǔ)培養(yǎng)基85份。

進(jìn)一步的，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖82份、碳酸氫鈉25份、丙酮酸鈉10份、脂肪酸白蛋白8份、氯化鉀38份、無水硫酸鎂8份、氯化鈉70份、無水磷酸二氫鈉10份、葉酸0.5份、肌醇1.2份、煙酰胺0.5份、無水氯化鈣30份、硝酸鐵0.4份、丁二酸6份、丁二酸鈉12份、d-泛酸鈣0.6份、n-異丙基甲基丙烯酰胺0.5份、酒石酸膽堿0.7份、核黃素0.2份、鹽酸硫胺0.4份、鹽酸吡哆辛0.3份、l-丙酰胺-l-谷氨二肽0.8份、乙酸酯1.8份、生物素0.6份、硫辛酸0.7份、酚紅鈉1份和去離子水100份。

另，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括6份氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸5份、l-鹽酸胱氨酸8份、l-絲氨酸6份、甘氨酸1份、l-鹽酸組氨酸4份、l-異亮氨酸12份、l-亮氨酸12份、l-鹽酸賴氨酸20份、l-甲硫氨酸1份、l-苯丙氨酸2份、l-蘇氨酸5份、l-色氨酸2份、l-酪氨酸6份和l-纈氨酸10份。

再，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包括2份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：胰島素生長因子3份、白介素65份、白介素104份、白介素123份、tnf-β5份、gm-csf3份。

又，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計，還包括0.006份青霉素和0.01份的鏈霉素。并且，所述青霉素選自10000u/ml，所述鏈霉素選自10000μg/ml。此外，所述胰蛋白酶中還包含0.5%的edta。

將實施例1-4凍存的細(xì)胞分別取凍存后3個月、6個月、9個月、12個月、18個月以及24個月的凍存細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，并對細(xì)胞存活率進(jìn)行測定，細(xì)胞存活率均在90%以上。

以上所述僅是發(fā)明的幾個實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)，這些改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。