本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種獼猴桃組織培養(yǎng)方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：獼猴桃(actinidiachinensis)是一種經(jīng)濟價值較高的木質(zhì)藤本植物，其果實肉厚汁多，酸甜適度，營養(yǎng)豐富，以其維生素c特高的營養(yǎng)價值而成為當前水果中之珍品，已經(jīng)成為當今世界的新興栽培果樹。瓊露獼猴桃是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所1978年從河南省西峽野生資源中選出的優(yōu)良品系，單果重70～105克，果皮黃褐色，果肉淡黃色，汁多，味酸甜，微香，維生素c含量241～318毫克/100克鮮果肉，可溶性固形物19％，是一個早果、豐產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、抗逆性強、耐土壤高ph值(可耐7.5)、適于密植的中熟加工品種。隨著獼猴桃栽培的興起，獼猴桃良種苗需要量急劇增加。由于獼猴桃是雌雄異株植物，采用播種等常規(guī)繁殖方式容易造成品種退化。同時，獼猴桃屬雌雄異株，倍性復(fù)雜,雌雄株間花期不遇使種間雜交困難，育種周期長，且有不確定性，給育種工作帶來了難度，本領(lǐng)域主要采用組織培養(yǎng)的方法對獼猴桃進行快速繁殖。該方法可以保持獼猴桃植株的良種遺傳特異性，繁殖速度快，繁殖量大，是現(xiàn)在普遍認同的良種繁育方法。目前，國內(nèi)外關(guān)于獼猴桃組織培養(yǎng)的研究已經(jīng)比較成熟，但至今尚沒有瓊露獼猴桃組培再生的研究。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一目的在于提供一種獼猴桃組織培養(yǎng)方法，所述方法能夠降低組培過程中的污染，提高愈傷組織的誘導(dǎo)率、發(fā)芽率和生根率。本發(fā)明的第二目的在于提供一種上述方法在培植獼猴桃幼苗中的應(yīng)用，所述應(yīng)用獲得的幼苗具有植株生長健壯、根系發(fā)達、移栽成活率高的優(yōu)點。為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：一種獼猴桃組織培養(yǎng)方法，所述方法包括以下步驟：取腋芽在無菌狀態(tài)下萌發(fā)而形成的葉柄作為外植體，接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)愈傷組織的形成，再將所述愈傷組織培育成獼猴桃幼苗。本發(fā)明還涉及上述方法在培植獼猴桃幼苗中的應(yīng)用。本發(fā)明上述方法能夠降低組培過程的污染率、提高愈傷組織的誘導(dǎo)率、發(fā)芽率和生根率，獲得健壯、成活率高的獼猴桃幼苗。具體實施方式本發(fā)明涉及一種獼猴桃組織培養(yǎng)方法，所述方法包括以下步驟：取腋芽在無菌狀態(tài)下萌發(fā)而形成的葉柄作為外植體，接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)愈傷組織的形成，再將所述愈傷組織培育成獼猴桃幼苗。本申請在研究獼猴桃的組培方法時意外地發(fā)現(xiàn)，與以葉片或莖段為外植體的組培方法相比，以獼猴桃葉柄作為外植體能夠顯著提高愈傷組織的誘導(dǎo)率、以及后續(xù)不定芽和不定根的發(fā)生率，但在組培過程中同時也伴隨高比例的污染。經(jīng)仔細研究發(fā)現(xiàn)獼猴桃葉柄表面密布細毛，細菌極易藏身于葉柄的細毛之間，在外植體消毒過程中，消毒液往往只能停留在葉柄表面的細毛上，難以進入葉柄細毛之間的部位，無法徹底消毒，因此，在組培過程中容易引起污染。申請人嘗試延長消毒時間以對葉柄進行徹底消毒。該措施在一定程度上能夠提升滅菌效果，但由于長時間與消毒劑接觸，葉柄的切口處受到消毒劑的嚴重毒害，切口容易發(fā)生褐變甚至致死，抑制愈傷組織的形成。因此，直接消毒獼猴桃的葉柄作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織存在污染風險高或外植體容易發(fā)生褐變甚至死亡，愈傷組織的誘導(dǎo)成功率低的缺陷。為了克服上述缺陷，本發(fā)明在組培時巧妙地選取腋芽在無菌狀態(tài)下萌發(fā)而形成的葉柄作為外植體，誘導(dǎo)愈傷組織、不定芽和不定根的形成。由于腋芽是在無菌狀態(tài)下被誘導(dǎo)萌發(fā)，因此由腋芽萌發(fā)而形成的葉柄同樣也保持高度無菌的狀態(tài)，故而取該葉柄作為外植體不需要對葉柄進行再次消毒，就能獲得遠勝于現(xiàn)有技術(shù)中使用酒精或升汞對獼猴桃葉柄進行消毒而獲得的滅菌效果。同時，由于不需要再次消毒，獼猴桃葉柄的切口因此不會與消毒劑接觸，出現(xiàn)褐變或死亡的現(xiàn)象。綜上所述，本發(fā)明上述方法不但能夠提高獼猴桃葉柄的無菌程度，還避免消毒劑對葉柄的毒害作用，顯著提高外植體形成愈傷組織的誘導(dǎo)率。在一些實施方式中，通過以下方式獲得所述葉柄：取滅菌的帶腋芽莖段接種到腋芽萌發(fā)培養(yǎng)基中進行無菌培養(yǎng)直至腋芽萌發(fā)，長出帶葉柄的葉片。在一些實施方式中，將所述愈傷組織培育成獼猴桃幼苗具體包括以下步驟：(1)將愈傷組織接種至不定芽再生培養(yǎng)基，誘導(dǎo)不定芽再生；(2)任選的，將不定芽接種至增殖培養(yǎng)基，進行不定芽增殖培養(yǎng)；(3)將不定芽接種至生根培養(yǎng)基，進行生根培養(yǎng)，獲得獼猴桃幼苗；(4)任選的，還包括將獼猴桃幼苗進行煉苗移栽的步驟。在一些實施方式中，所述腋芽萌發(fā)培養(yǎng)基為包括6-ba、naa、蔗糖和瓊脂的ms培養(yǎng)基。在一些實施方式中，所述腋芽萌發(fā)培養(yǎng)基為包括1.0～2.0mg·l-16-ba、0.1～0.5mg·l-1naa、25～35g·l-1蔗糖和5～10g·l-1瓊脂的ms培養(yǎng)基。在一些實施方式中，所述腋芽萌發(fā)培養(yǎng)基為包括1.5～2.0mg·l-16-ba、0.1～0.4mg·l-1naa、25～35g·l-1蔗糖和5～10g·l-1瓊脂的ms培養(yǎng)基。在一些實施方式中，所述腋芽萌發(fā)培養(yǎng)基為包括1.0～1.5mg·l-16-ba、0.1～0.3mg·l-1naa、25～35g·l-1蔗糖和5～10g·l-1瓊脂的ms培養(yǎng)基。在一些實施方式中，所述腋芽萌發(fā)培養(yǎng)基為包括1.0mg·l-16-ba、0.1mg·l-1naa、30g·l-1蔗糖和7g·l-1瓊脂的ms培養(yǎng)基。在一些實施方式中，所述腋芽萌發(fā)培養(yǎng)基為包括2.0mg·l-16-ba、0.1mg·l-1naa、30g·l-1蔗糖和7g·l-1瓊脂的ms培養(yǎng)基。在一些實施方式中，所述腋芽萌發(fā)培養(yǎng)基為包括2.0mg·l-16-ba、0.5mg·l-1naa、30g·l-1蔗糖和7g·l-1瓊脂的ms培養(yǎng)基。本發(fā)明上述方法限定6-ba、naa、蔗糖、瓊脂和ms培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)的腋芽萌發(fā)培養(yǎng)基的組分，上述組分在功能上互相補充和支持，具有協(xié)同增效的作用，能夠提升腋芽萌發(fā)率。在一些實施方式中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為包括zt、蔗糖和瓊脂的ms培養(yǎng)基。在一些實施方式中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為包括0.5～1.0mg·l-1zt、25～35mg·l-1蔗糖、5～10mg·l-1瓊脂的ms培養(yǎng)基。在一些實施方式中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為包括0.7～1.0mg·l-1zt、25～35mg·l-1蔗糖、5～10mg·l-1瓊脂的ms培養(yǎng)基。在一些實施方式中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為包括0.8～1.0mg·l-1zt、25～35mg·l-1蔗糖、5～10mg·l-1瓊脂的ms培養(yǎng)基。在一些實施方式中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為包括0.5mg·l-1zt、30mg·l-1蔗糖、7mg·l-1瓊脂的ms培養(yǎng)基。在一些實施方式中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為包括0.8mg·l-1zt、30mg·l-1蔗糖、7mg·l-1瓊脂的ms培養(yǎng)基。在一些實施方式中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為包括1.0mg·l-1zt、30mg·l-1蔗糖、7mg·l-1瓊脂的ms培養(yǎng)基。本發(fā)明上述方法對誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的植物激素進行優(yōu)化，從naa、6-ba、zt中篩選出zt加入到誘導(dǎo)培養(yǎng)基，能夠提高所述培養(yǎng)基誘導(dǎo)獼猴桃葉柄形成愈傷組織的幾率和質(zhì)量。本發(fā)明還對zt的含量進行優(yōu)化，進一步提高愈傷組織的誘導(dǎo)率和質(zhì)量。在一些實施方式中，所述不定芽再生培養(yǎng)基的配方與誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方相同。本發(fā)明出人意料地發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)獼猴桃的葉柄形成愈傷組織后在原誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，愈傷組織上能夠形成不定芽，由此可見，本發(fā)明所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為雙效培養(yǎng)基，不但能夠誘導(dǎo)愈傷組織的形成，還能誘導(dǎo)愈傷組織形成不定芽。而將愈傷組織從原誘導(dǎo)培養(yǎng)基中取出，置于新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，愈傷組織的不定芽形成率更高，不定芽形成個數(shù)也更多。在一些實施方式中，所述增殖培養(yǎng)基為包括zt、ga、蔗糖和瓊脂的ms培養(yǎng)基。在一些實施方式中，所述增殖培養(yǎng)基為包括0.7～1.2mg·l-1zt、0.5～1.0mg·l-1ga、25～35mg·l-1蔗糖、5～10mg·l-1瓊脂的ms培養(yǎng)基。在一些實施方式中，所述增殖培養(yǎng)基為包括0.8～1.1mg·l-1zt、0.7～1.0mg·l-1ga、25～35mg·l-1蔗糖、5～10mg·l-1瓊脂的ms培養(yǎng)基。在一些實施方式中，所述增殖培養(yǎng)基為包括0.9～1.0mg·l-1zt、0.8～1.0mg·l-1ga、25～35mg·l-1蔗糖、5～10mg·l-1瓊脂的ms培養(yǎng)基。在一些實施方式中，所述增殖培養(yǎng)基為包括1.0mg·l-1zt、1.0mg·l-1ga、30mg·l-1蔗糖、7mg·l-1瓊脂的ms培養(yǎng)基。在一些實施方式中，所述增殖培養(yǎng)基為包括1.0mg·l-1zt、0.5mg·l-1ga、30mg·l-1蔗糖、7mg·l-1瓊脂的ms培養(yǎng)基。本發(fā)明上述方法對增殖培養(yǎng)基中所加入的植物激素進行優(yōu)化，從包括6-ba、naa、zt和ga在內(nèi)的多種植物激素中篩選出zt和ga加入到增殖培養(yǎng)基中，提高所述增殖培養(yǎng)基形成繼代幼芽的比例。本發(fā)明還對zt和ga的含量進行優(yōu)化，使用本發(fā)明上述組成和含量的增殖培養(yǎng)基可以進一步提高繼代芽的增殖系數(shù)和繼代芽的質(zhì)量。在一些實施方式中，所述生根培養(yǎng)基為包括iba、蔗糖和瓊脂的1/2ms培養(yǎng)基。在一些實施方式中，所述生根培養(yǎng)基為包括0.5～1.0mg·l-1iba、25～35mg·l-1蔗糖、5～10mg·l-1瓊脂的1/2ms培養(yǎng)基。在一些實施方式中，所述生根培養(yǎng)基為包括0.5～0.7mg·l-1iba、25～35mg·l-1蔗糖、5～10mg·l-1瓊脂的1/2ms培養(yǎng)基。在一些實施方式中，所述生根培養(yǎng)基為包括0.7～1.0mg·l-1iba、25～35mg·l-1蔗糖、5～10mg·l-1瓊脂的1/2ms培養(yǎng)基。在一些實施方式中，所述生根培養(yǎng)基為包括0.5mg·l-1iba、30mg·l-1蔗糖、7mg·l-1瓊脂的1/2ms培養(yǎng)基。在一些實施方式中，包括所述生根培養(yǎng)基為包括0.7mg·l-1iba、30mg·l-1蔗糖、7mg·l-1瓊脂的1/2ms培養(yǎng)基。在一些實施方式中，所述生根培養(yǎng)基為包括1.0mg·l-1iba、30mg·l-1蔗糖、7mg·l-1瓊脂的1/2ms培養(yǎng)基。本發(fā)明上述方法對生根培養(yǎng)基中的植物激素進行篩選和優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)將iba加入到增殖培養(yǎng)基中能夠提高所述生根培養(yǎng)基的生根率。本發(fā)明還對生根培養(yǎng)基中iba的含量進行優(yōu)化，使用本發(fā)明上述組成和含量的增殖培養(yǎng)基可以進一步提高不定根的生根率。在一些實施方式中，所述獼猴桃選自徐香獼猴桃、翠香獼猴桃、海沃德獼猴桃、米良一號獼猴桃、金桃獼猴桃、金艷獼猴桃、瓊露獼猴桃、軟棗獼猴桃、毛花獼猴桃、紅陽獼猴桃，優(yōu)選地，所述獼猴桃選自瓊露獼猴桃。本發(fā)明還涉及上述方法在培植獼猴桃幼苗中的應(yīng)用。由上述應(yīng)用培植獲得的幼苗具有生長健壯、根系發(fā)達，移栽成活率高的優(yōu)點。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：1)、本發(fā)明所述方法以獼猴桃葉柄為外植體，愈傷組織的誘導(dǎo)率以及不定芽的發(fā)生率都顯著高于以獼猴桃葉片或莖段為外植體的組培方法。2)、本發(fā)明所述方法選用的獼猴桃葉柄無需消毒即可保持高度無菌的狀態(tài)，直接用于誘導(dǎo)愈傷組織的形成，避免獼猴桃葉柄由于多毛而消毒不徹底，也避免消毒劑對葉柄切口處的毒害作用。3)、本發(fā)明所述方法優(yōu)選地通過培養(yǎng)滅菌的帶腋芽莖段、誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)形成帶葉柄的葉片從而獲得無菌葉柄，所述獲得無菌葉柄的方式簡便、高效。4)、本發(fā)明所述方法采用激素種類和含量均經(jīng)過優(yōu)化的培養(yǎng)基進行獼猴桃的組培，可以顯著提高腋芽的萌發(fā)率、愈傷組織的誘導(dǎo)率和質(zhì)量以及不定芽的形成率和形成個數(shù)、繼代芽增殖系數(shù)和質(zhì)量以及不定芽的生根率。5)、本發(fā)明所述方法特別適合瓊露獼猴桃的組織培養(yǎng)。6)、由本發(fā)明所述組培方法獲得的獼猴桃幼苗具有植株生長健壯、根系發(fā)達、移栽成活率高的優(yōu)點。下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例1外植體的選擇本發(fā)明采用瓊露獼猴桃春天剛發(fā)芽的新稍葉柄、葉片和莖段作為外植體材料，進行消毒以及愈傷組織的誘導(dǎo)。1、外植體的選取與滅菌采集“瓊露”當年生新梢枝條，用小軟毛刷在洗潔精水溶液中刷洗5～10min，用清水沖洗3～4h，分別剪下葉片、葉柄，將枝條剪成2～3cm的莖段(不含腋芽)。在超凈工作臺用75％酒精對葉片、葉柄、莖段分別滅菌30s，無菌水沖洗一遍，再用0.1％升汞滅菌40s～1min，無菌水沖洗4～5遍。用無菌濾紙吸干水分，分別將葉片沿橫截葉脈剪成0.2cm寬的細長條，將葉柄剪成0.5cm長，將莖段剪成0.5～1cm長供接種用。2、愈傷組織的誘導(dǎo)和不定芽的再生分別將葉片、葉柄和莖段接種到ph5.8、包含0.5mg·l-1zt、30g/l蔗糖和7g/l瓊脂的ms培養(yǎng)基中，先暗培養(yǎng)7d，然后每天光照16h，光照強度2500lx，室溫28℃條件下培養(yǎng)25d；再將形成的愈傷組織剪成0.5cm2大小，轉(zhuǎn)接到ph5.8、包含0.5g·l-1zt、30g/l蔗糖和7g/l瓊脂的ms培養(yǎng)基中，每天光照16h，光照強度2500lx，室溫28℃條件下培養(yǎng)30d。統(tǒng)計葉片、葉柄和莖段在培養(yǎng)過程中的污染率、愈傷組織誘導(dǎo)率和外觀、不定芽的再生率、再生不定芽數(shù)，具體結(jié)果參見表1。其中，污染率＝污染外植體數(shù)目/接種外植體數(shù)目；愈傷組織誘導(dǎo)率＝形成愈傷組織的未污染接種外植體數(shù)目/未污染接種外植體數(shù)目；不定芽再生率＝形成不定芽的愈傷組織數(shù)目/接種愈傷組織數(shù)目；再生不定芽數(shù)為每個生芽愈傷組織的平均不定芽數(shù)量。表1“瓊露”葉片、葉柄和莖段愈傷組織和不定芽分化情況葉片葉柄莖段污染率40％42％15％愈傷組織誘導(dǎo)率80％92％56％愈傷組織外觀淡黃色致密黃綠色酥松黃白色致密不定芽再生率30％90％62％再生不定芽數(shù)3.66.04.1根據(jù)表1所示數(shù)據(jù)可知，常規(guī)的酒精和升汞消毒方法無法對獼猴桃葉片和葉柄進行徹底消毒，組培過程中葉片和葉柄的污染率高，但愈傷組織的誘導(dǎo)效果好。尤其是以葉柄為外植體，其愈傷組織誘導(dǎo)率高達92％，誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織外觀上呈黃綠色酥松狀態(tài)，生長狀況良好、有活力，不定芽再生率和再生不定芽數(shù)分別高達90％和6.0，無論是愈傷組織的誘導(dǎo)率和外觀，還是不定芽再生率和再生不定芽數(shù)都顯著高于葉片和莖段。而莖段的消毒效果比較好，其在愈傷組織誘導(dǎo)過程中引起的污染率顯著低于葉片和葉柄，但在愈傷組織和不定芽再生的誘導(dǎo)效果上都明顯遜于葉柄。因此，如果能夠克服葉柄容易污染的缺陷，葉柄將成為獼猴桃組培過程中誘導(dǎo)愈傷組織的最佳外植體。實施例2不同滅菌方式的比較為克服常規(guī)消毒方法對獼猴桃葉柄滅菌不徹底的缺陷，本申請采用不同方式對瓊露獼猴桃的葉柄進行處理，并評價不同處理方式下葉柄在組培過程中的污染率以及愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)效果。處理方式1：采集“瓊露”當年生新稍枝條，用小軟毛刷在洗潔精水溶液中刷洗5～10min，用清水沖洗3～4h，剪下葉柄，在超凈工作臺用75％酒精對葉柄滅菌30s，無菌水沖洗一遍，再用0.1％升汞滅菌2～3min，無菌水沖洗4～5遍。用無菌濾紙吸干水分，將葉柄剪成0.5cm長，參照實施例1所述方式接種到培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織的形成和不定芽的再生。處理方式2：采集“瓊露”當年生新稍枝條，去掉葉片后，用小軟毛刷在洗潔精水溶液中刷洗5～10min，用清水沖洗3～4h，剪成3cm左右的帶腋芽莖段，芽體位于中間，在超凈工作臺上用75％酒精滅菌30s,無菌水沖洗一遍，用0.1％升汞滅菌40s～1min，無菌水沖洗4～5遍，用無菌濾紙吸干水分，將新生枝條剪成3cm左右含腋芽的莖段，剪去上下兩端留1.5cm(腋芽位于枝條中上部)，供接種用。將處理后的莖段接種在培養(yǎng)基中進行腋芽萌發(fā)培養(yǎng)，接種后每天光照時間為16h，光照強度為2500lx，室溫28℃的條件下培養(yǎng)30d左右，直至腋芽萌發(fā)，形成帶葉柄的新葉，所述培養(yǎng)基為ph5.8、含0.5mg·l-16-ba、1.0mg·l-1iba、30g·l-1蔗糖和7g·l-1瓊脂的ms培養(yǎng)基。在無菌狀態(tài)下將葉柄剪成0.5cm長，按實施例1所述方式接種到培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織的形成和不定芽的再生。處理方式3(對照)：參照實施例1所述消毒方式對獼猴桃葉柄進行消毒，并參照實施例1所述方式接種到培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織的形成和不定芽的再生。比較三種不同處理方式下，葉柄的污染情況以及愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)情況，具體結(jié)果參見表2。表2獼猴桃葉柄的污染情況、愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)情況根據(jù)表2的數(shù)據(jù)可知，延長消毒劑處理葉柄的時間能夠在一定程度上提高獼猴桃葉柄的消毒效率，降低組培過程中的污染率，但同時由于與消毒劑長時間接觸，葉柄也受到極大傷害，其切口處出現(xiàn)褐變甚至死亡的情況，抑制愈傷組織的誘導(dǎo)和不定芽的再生。而如果以消毒莖段上的腋芽萌發(fā)而形成的葉柄作為外植體，則不但取得極佳的滅菌效果，在組培過程中的污染率遠遠低于處理方式1、3(對照)，而且不會對葉柄造成毒害作用，其誘導(dǎo)愈傷組織以及不定芽的效果不但優(yōu)于處理方式1，甚至還優(yōu)于處理方式3(對照)。因此，按照處理方式2處理葉柄是最佳選擇。實施例3腋芽萌發(fā)培養(yǎng)基的優(yōu)化為了提高腋芽萌發(fā)率，本申請以ph5.8、含有30g·l-1蔗糖和7g·l-1瓊脂的ms培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對植物激素的種類和含量進行優(yōu)化，以期獲得誘導(dǎo)效果最佳的腋芽萌發(fā)培養(yǎng)基。具體優(yōu)化方法如下：(1)將按表3配制的激素組合加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，制備不同的腋芽萌發(fā)培養(yǎng)基；(2)消毒“瓊露”獼猴桃的帶腋芽莖段并分別轉(zhuǎn)接至各培養(yǎng)基中進行無菌培養(yǎng)，消毒方式和培養(yǎng)條件參照實施例2處理方式2；(3)記錄腋芽的萌發(fā)情況。表3腋芽萌發(fā)培養(yǎng)基的激素組合配方表4腋芽萌發(fā)情況接種外植體數(shù)萌發(fā)腋芽數(shù)腋芽萌發(fā)率(％)配方1302583.3配方2302686.6配方3302480.0配方4302273.3配方5302893.3配方6302376.7配方7302583.3配方8302480.0根據(jù)表4所示數(shù)據(jù)可知，培養(yǎng)基中加入配方5所示激素組合，腋芽的萌發(fā)率最高，高于其他幾種激素組合，為腋芽萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基。實施例4誘導(dǎo)培養(yǎng)基的優(yōu)化為進一步提高愈傷組織與不定芽的誘導(dǎo)效果，本申請對用于誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽再生的培養(yǎng)基進行優(yōu)化，具體以ph5.8、含30g·l-1蔗糖和7g·l-1瓊脂的ms培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對植物激素的種類和含量進行優(yōu)化，優(yōu)化方法如下：(1)將按表5配制的激素組合加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。制備各種誘導(dǎo)培養(yǎng)基；(2)將實施例3獲得的葉柄(使用實施例3配方5培養(yǎng)基)分別接種到各誘導(dǎo)培養(yǎng)基，接種后暗培養(yǎng)7d，然后在每天光照16h，光照強度為2500lx，室溫28℃的條件下培養(yǎng)25d左右；(3)取出誘導(dǎo)形成的愈傷組織，剪成0.5cm2大小，再次分別轉(zhuǎn)接到與誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基組成完全相同的培養(yǎng)基中，在每天光照16h，光照強度為2500lx，室溫28℃的條件下培養(yǎng)30d左右；(4)統(tǒng)計愈傷組織的誘導(dǎo)率及其外觀、不定芽再生率以及再生不定芽數(shù)，具體結(jié)果參見表6。表5誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽的激素組合配方6-ba(mg·l-1)naa(mg·l-1)zt(mg·l-1)配方1000.5配方2000.8配方3001.0配方41.00.10配方52.00.10配方600.11.0配方700.12.0表6愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)情況根據(jù)表6所示數(shù)據(jù)可知，配方1～3所示激素組合能夠誘導(dǎo)獼猴桃葉柄形成黃綠色酥松的愈傷組織，愈傷組織的活力好，不定芽的再生率高，再生的不定芽數(shù)目多，而配方4～7所示的激素組合在愈傷組織的誘導(dǎo)率和外觀、不定芽再生率以及再生不定芽數(shù)都明顯遜于配方1～3。將配方1～3進行比較，則明顯可見配方2的效果明顯優(yōu)于配方1和配方3。實施例5增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化為增加不定芽的數(shù)目、獲得更多的獼猴桃幼苗、擴大組培規(guī)模，本申請對增殖培養(yǎng)基進行優(yōu)化，具體以含30g·l-1蔗糖和7g·l-1瓊脂的ms培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對增殖培養(yǎng)基中的植物激素種類和含量進行優(yōu)化，具體方法如下：(1)按表7所述配方配制不同的激素組合，并分別將其加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，制備增殖培養(yǎng)基；(2)將實施例4獲得的不定芽(使用實施例4配方2的激素組合)分別轉(zhuǎn)接到各增殖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，在每天光照時間為16h，光照強度為2500lx，室溫28℃的條件下培養(yǎng)30d左右，計算增殖系數(shù)，其中所述增殖系數(shù)按以下方式計算：增殖系數(shù)＝增殖培養(yǎng)結(jié)束后不定芽總個數(shù)/接種不定芽總個數(shù)。表7不同植物激素的組合對不定芽增殖的影響根據(jù)表7所示實驗數(shù)據(jù)可知，配方1～2的激素組合的增殖系數(shù)在6.2～6.8之間，而配方3～8的增殖系數(shù)在3.5～5.1之間，前者的增殖效果明顯優(yōu)于后者。由此可見，在增殖培養(yǎng)基中加入zt和ga的效果對不定芽的增殖效果明顯優(yōu)于加入其它植物激素。更進一步，配方1與配方2在增殖效果上的比較則表明，zt和ga的用量取1.0mg·l-1和1.0mg·l-1時，培養(yǎng)基取得最佳的增殖效果。實施例6生根培養(yǎng)基的優(yōu)化為進一步提高不定芽的生根情況，本申請對生根培養(yǎng)基進行優(yōu)化，具體以含30g·l-1蔗糖和7g·l-1瓊脂的1/2ms培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對植物激素的種類和含量進行優(yōu)化。優(yōu)化方法如下：(1)按照表8配置激素組合，并分別加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，制備生根培養(yǎng)基；(2)將實施例5中長至2～3cm的健壯不定芽(實施例5用配方1的激素組合)剪下接種在生根培養(yǎng)基中，在每天光照時間為16h，光照強度為2500lx，室溫28℃的條件下培養(yǎng)30d左右；(3)統(tǒng)計不定芽的生根率、平均生根數(shù)和平均根長，具體結(jié)果參見表8。其中，生根率＝生根的不定芽數(shù)目/接種不定芽數(shù)目；平均生根數(shù)為平均每個不定芽的生根數(shù)目；平均根長為平均每條根的長度。表8不同植物激素組合對生根的影響根據(jù)表8所示實驗數(shù)據(jù)可知，配方3～5的激素組合無論是在生根率、平均根數(shù)還是在平均根長上都顯著優(yōu)于配方1～2所示的激素組合，由此可見，iba對生根培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果顯著強于其他激素，并且表明iba在0.5～1.0mg·l-1范圍內(nèi)取得的生根效果較佳。實施例7煉苗與移栽將實施例六生根培養(yǎng)過程中長有3-4條根，根長至0.5-1cm的幼苗(使用實施例6配方5激素組合)移至日光溫室中遮陰3d，瓶口擰開半蓋放置3d，用清水洗凈根部培養(yǎng)基進行移栽，控制氣溫不超過30℃，空氣濕度在90％以上。移栽基質(zhì)為珍珠巖：草炭：細沙＝1：1：1。移栽成活率可達98％，獼猴桃幼苗外觀上表現(xiàn)出植株健壯、根系發(fā)達的特點。最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍。當前第1頁12