領域本公開涉及用于改善單子葉植物或谷類植物(包括玉米)的性狀(諸如抗倒伏性和增加的產(chǎn)量)的組合物和方法。相關領域赤霉素(gibberellin)(赤霉酸(gibberellic?acid)或ga)是調(diào)節(jié)許多主要植物生長和發(fā)育過程的植物激素。在20世紀，半矮化小麥、水稻和高粱植物品種中g(shù)a水平的控制導致這些谷類作物產(chǎn)量的增加和倒伏的減少，這主要是造成綠色革命的原因。然而，在其他谷類作物諸如玉米中，還沒有通過ga途徑的操縱實現(xiàn)成功的產(chǎn)量增加。事實上，ga途徑基因中的一些突變與玉米中與產(chǎn)量不相容的各種異型相關聯(lián)，這使得研究人員不再通過操縱ga途徑來尋找半矮化高產(chǎn)玉米品種。本領域需要開發(fā)具有增加的產(chǎn)量和/或抗倒伏性的單子葉或谷類作物植物，諸如玉米。

背景技術(shù)：

技術(shù)實現(xiàn)思路

技術(shù)特征：

1.一種重組dna構(gòu)建體，其包含編碼非編碼rna分子的可轉(zhuǎn)錄dna序列，其中所述非編碼rna分子包含與編碼單子葉植物或谷類植物或植物細胞中的內(nèi)源ga氧化酶蛋白的mrna分子的至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26個或至少27個連續(xù)核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互補的序列，所述內(nèi)源ga氧化酶蛋白與seq?id?no:30、33或173至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一，并且其中所述可轉(zhuǎn)錄dna序列可操作地連接到植物可表達啟動子。

2.如權(quán)利要求1所述的重組dna構(gòu)建體，其中所述非編碼rna分子包含與seq?id?no:28、29、31、32、171或172的至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26個或至少27個連續(xù)核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互補的序列。

3.如權(quán)利要求1所述的重組dna構(gòu)建體，其中所述植物可表達啟動子是維管啟動子。

4.如權(quán)利要求3所述的重組dna構(gòu)建體，其中所述維管啟動子包括以下各項中的一項：蔗糖合酶啟動子、蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白啟動子、sh1啟動子、鴨跖草黃斑駁病毒(coymv)啟動子、小麥矮化雙生病毒(wdv)大基因間區(qū)域(lir)啟動子、玉蜀黍條斑雙生病毒(msv)外殼蛋白(cp)啟動子、水稻類黃色條紋1(ys1)啟動子、或水稻黃色條紋2(osysl2)啟動子。

5.如權(quán)利要求3所述的重組dna構(gòu)建體，其中所述維管啟動子包含與seq?id?no:67、seqid?no:68、seq?id?no:69、seq?id?no:70或seq?id?no:71中的一者或多者、或其功能部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的dna序列。

6.如權(quán)利要求1所述的重組dna構(gòu)建體，其中所述植物可表達啟動子是rtbv啟動子。

7.如權(quán)利要求6所述的重組dna構(gòu)建體，其中所述植物可表達啟動子包含與seq?id?no:65或seq?id?no:66中的一者或多者、或其功能部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的dna序列。

8.如權(quán)利要求1所述的重組dna構(gòu)建體，其中所述植物可表達啟動子是葉啟動子。

9.如權(quán)利要求8所述的重組dna構(gòu)建體，其中所述葉啟動子包括以下各項中的一項：rubisco啟動子、ppdk啟動子、fda啟動子、nadh-gogat啟動子、葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因啟動子、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(pepc)啟動子、或myb基因啟動子。

10.如權(quán)利要求8所述的重組dna構(gòu)建體，其中所述葉啟動子包含與seq?id?no:72、seqid?no:73或seq?id?no:74中的一者或多者、或其功能部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的dna序列。

11.如權(quán)利要求1所述的重組dna構(gòu)建體，其中所述植物可表達啟動子是組成型啟動子。

12.如權(quán)利要求11所述的重組dna構(gòu)建體，其中所述組成型啟動子選自由以下組成的組：肌動蛋白啟動子、camv?35s或19s啟動子、植物泛素啟動子、植物gos2啟動子、fmv啟動子、cmv啟動子、mmv啟動子、pclsv啟動子、emu啟動子、微管蛋白啟動子、胭脂堿合酶啟動子、章魚堿合酶啟動子、甘露堿合酶啟動子、或玉蜀黍醇脫氫酶，或其功能部分。

13.如權(quán)利要求11所述的重組dna構(gòu)建體，其中所述組成型啟動子包含與seq?id?no:75、seq?id?no:76、seq?id?no:77、seq?id?no:78、seq?id?no:79、seq?id?no:80、seq?idno:81、seq?id?no:82或seq?id?no:83中的一者或多者、或其功能部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的dna序列。

14.如權(quán)利要求1所述的重組dna構(gòu)建體，其中由所述可轉(zhuǎn)錄dna序列編碼的所述非編碼rna分子是在植物細胞中被加工或切割以形成成熟mirna或sirna的前體mirna或sirna。

15.如權(quán)利要求1所述的重組dna構(gòu)建體，其中所述非編碼rna分子包含與編碼單子葉植物或谷類植物或植物細胞中的內(nèi)源ga3氧化酶蛋白的mrna分子的至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26個或至少27個連續(xù)核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互補的序列，所述內(nèi)源ga3氧化酶蛋白與seq?id?no:30至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一。

16.如權(quán)利要求15所述的重組dna構(gòu)建體，其中所述非編碼rna分子包含與seq?id?no:28或29的至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26個或至少27個連續(xù)核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互補的序列。

17.如權(quán)利要求1所述的重組dna構(gòu)建體，其中所述非編碼rna分子包含與編碼單子葉植物或谷類植物或植物細胞中的內(nèi)源ga3氧化酶蛋白的mrna分子的至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26個或至少27個連續(xù)核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互補的序列，所述內(nèi)源ga3氧化酶蛋白與seq?id?no:33至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一。

18.如權(quán)利要求17所述的重組dna構(gòu)建體，其中所述非編碼rna分子包含與seq?id?no:31或32的至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26個或至少27個連續(xù)核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互補的序列。

19.如權(quán)利要求1所述的重組dna構(gòu)建體，其中所述非編碼rna分子包含與編碼單子葉植物或谷類植物或植物細胞中的內(nèi)源ga3氧化酶蛋白的mrna分子的至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26個或至少27個連續(xù)核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互補的序列，所述內(nèi)源ga3氧化酶蛋白與seq?id?no:173至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一。

20.如權(quán)利要求19所述的重組dna構(gòu)建體，其中所述非編碼rna分子包含與seq?id?no:171或172的至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26個或至少27個連續(xù)核苷酸至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互補的序列。

21.一種轉(zhuǎn)化載體，其包含如權(quán)利要求1所述的重組dna構(gòu)建體。

22.一種轉(zhuǎn)基因谷類植物、植物部分或植物細胞，其包含如權(quán)利要求1所述的重組dna構(gòu)建體。

23.如權(quán)利要求22所述的轉(zhuǎn)基因谷類植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物相對于對照植物具有以下性狀中的一者或多者：較矮的植株高度、增加的稈/莖直徑、改善的抗倒伏性、減少的未成熟折斷、較深的根、增加的葉面積、較早的冠層郁閉、較高的氣孔導度、較低的穗高度、增加的葉片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正常或限氮或限水脅迫條件下葉中減少的花青素含量和面積、增加的穗重量、增加的收獲指數(shù)、增加的產(chǎn)量、增加的種子數(shù)量、增加的種子重量和/或增加的多產(chǎn)性。

24.如權(quán)利要求22所述的轉(zhuǎn)基因谷類植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物具有較矮的植株高度和/或改善的抗倒伏性。

25.如權(quán)利要求22所述的轉(zhuǎn)基因谷類植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物的高度比野生型對照植物矮至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。

26.如權(quán)利要求22所述的轉(zhuǎn)基因谷類植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在一個或多個莖節(jié)間處的稈或莖直徑比野生型對照植物在相同的一個或多個節(jié)間處的稈或莖直徑大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。

27.如權(quán)利要求22中的任一項所述的轉(zhuǎn)基因谷類植物，其中所述轉(zhuǎn)基因谷類植物是玉米植物，并且其中所述轉(zhuǎn)基因玉米植物在穗下方第一節(jié)間、第二節(jié)間、第三節(jié)間和/或第四節(jié)間中的一者或多者處的稈或莖直徑比野生型對照植物的相同節(jié)間大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。

28.如權(quán)利要求22所述的轉(zhuǎn)基因谷類植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物的莖或稈的至少一個節(jié)間組織中的一種或多種活性ga的水平低于野生型對照植物的相同節(jié)間組織。

29.如權(quán)利要求22所述的轉(zhuǎn)基因谷類植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物的莖或稈的至少一個節(jié)間組織中的一種或多種活性ga的水平比野生型對照植物的相同節(jié)間組織低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。

30.如權(quán)利要求22所述的轉(zhuǎn)基因谷類植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在至少一個雌性器官或穗中不具有任何顯著的異型。

31.一種轉(zhuǎn)基因玉米植物、植物部分或植物細胞，其包含如權(quán)利要求1所述的重組dna構(gòu)建體。

32.一種用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因谷類植物的方法，其包括：(a)用如權(quán)利要求1所述的重組dna構(gòu)建體轉(zhuǎn)化外植體的至少一個細胞，以及(b)由所轉(zhuǎn)化的外植體再生或發(fā)育所述轉(zhuǎn)基因谷類植物。

33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述谷類植物通過土壤桿菌介導的轉(zhuǎn)化或粒子轟擊進行轉(zhuǎn)化。

34.一種重組dna構(gòu)建體，其包含編碼非編碼rna分子的可轉(zhuǎn)錄dna序列，其中所述非編碼rna分子包含第一靶向序列和第二靶向序列，其中所述第一靶向序列和所述第二靶向序列各自與編碼單子葉植物或谷類植物或植物細胞中的內(nèi)源ga氧化酶蛋白的mrna分子的至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26個或至少27個連續(xù)核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互補，所述內(nèi)源ga氧化酶蛋白與seq?id?no:30、33和173中的一者或多者至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一。

35.如權(quán)利要求34所述的重組dna構(gòu)建體，其中所述非編碼rna分子的所述第一靶向序列和所述第二靶向序列各自與seq?id?no:28、29、31、32、171和172中的一者或多者的至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26或至少27個連續(xù)核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互補。

36.一種玉米或谷類植物，其包含通過誘變技術(shù)引入的在內(nèi)源ga3氧化酶基因處或附近的突變，其中所述內(nèi)源ga3氧化酶基因的表達水平在所述玉米或谷類植物中降低或消除，并且其中所述玉米或谷類植物相對于野生型對照植物具有較矮的植株高度。

37.如權(quán)利要求36所述的玉米或谷類植物，其中包含所述突變的所述玉米或谷類植物相對于所述對照植物具有以下附加性狀中的一者或多者：增加的稈/莖直徑、改善的抗倒伏性、減少的未成熟折斷、較深的根、增加的葉面積、較早的冠層郁閉、較高的氣孔導度、較低的穗高度、增加的葉片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正?；蛳薜蛳匏{迫條件下葉中減少的花青素含量和面積、增加的穗重量、增加的收獲指數(shù)、增加的產(chǎn)量、增加的種子數(shù)量、增加的種子重量和增加的多產(chǎn)性。

38.如權(quán)利要求36所述的玉米或谷類植物，其中所述玉米或谷類植物的所述高度比所述對照植物矮至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。

39.如權(quán)利要求36所述的玉米或谷類植物，其中所述玉米或谷類植物在一個或多個莖節(jié)間處的稈或莖直徑比所述對照植物大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。

40.如權(quán)利要求36所述的玉米或谷類植物，其中所述玉米或谷類植物的稈或莖的至少一個節(jié)間組織中的一種或多種活性ga的水平低于所述對照植物的相同節(jié)間組織。

41.一種玉米或谷類植物，其包含經(jīng)由靶向基因組編輯技術(shù)在內(nèi)源ga3氧化酶基因的基因座處或附近引入的基因組編輯，其中所述內(nèi)源ga3氧化酶基因的表達水平在所述玉米或谷類植物中相對于對照植物降低或消除，并且其中所述經(jīng)編輯的玉米或谷類植物相對于所述對照植物具有較矮的植株高度。

42.如權(quán)利要求41所述的經(jīng)編輯的玉米或谷類植物，其中所述經(jīng)編輯的植物相對于所述對照植物具有以下附加性狀中的一者或多者：增加的稈/莖直徑、改善的抗倒伏性、減少的未成熟折斷、較深的根、增加的葉面積、較早的冠層郁閉、較高的氣孔導度、較低的穗高度、增加的葉片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正常或限氮或限水脅迫條件下葉中減少的花青素含量和面積、增加的穗重量、增加的收獲指數(shù)、增加的產(chǎn)量、增加的種子數(shù)量、增加的種子重量和增加的多產(chǎn)性。

43.如權(quán)利要求41所述的經(jīng)編輯的玉米或谷類植物，其中所述經(jīng)編輯的植物的所述高度比所述對照植物矮至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。

44.如權(quán)利要求41所述的經(jīng)編輯的玉米或谷類植物，其中所述經(jīng)編輯的植物在一個或多個莖節(jié)間處的所述稈或莖直徑比所述對照植物大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。

45.如權(quán)利要求41所述的經(jīng)編輯的玉米或谷類植物，其中所述經(jīng)編輯的植物的稈或莖的至少一個節(jié)間組織中的一種或多種活性ga的水平低于所述對照植物的相同節(jié)間組織。

46.如權(quán)利要求41所述的經(jīng)編輯的玉米或谷類植物，其中所述經(jīng)編輯的植物的稈或莖的至少一個節(jié)間組織中的一種或多種活性ga的水平比所述對照植物的相同節(jié)間組織低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。

47.如權(quán)利要求41所述的經(jīng)編輯的玉米或谷類植物，其中所述經(jīng)編輯的植物在至少一個雌性器官或穗中不具有任何顯著的異型。

48.如權(quán)利要求41所述的經(jīng)編輯的玉米或谷類植物，其中所述基因組編輯是使用大范圍核酸酶、鋅指核酸酶(zfn)、rna引導的核酸內(nèi)切酶、tale核酸內(nèi)切酶(talen)、重組酶或轉(zhuǎn)座酶引入的。

49.如權(quán)利要求41所述的經(jīng)編輯的玉米或谷類植物，其中所述基因組編輯包括相對于所述對照植物中的所述內(nèi)源ga3氧化酶基因的序列的一個或多個核苷酸的取代、缺失、插入或倒位。

50.一種組合物，其包含引導rna，其中所述引導rna包含與玉米或谷類植物的內(nèi)源ga3氧化酶基因的基因組基因座處或附近的靶dna序列的至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個或至少25個連續(xù)核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互補的引導序列。

51.如權(quán)利要求50所述的組合物，其中所述引導rna分子包含與seq?id?no:36、37、168、169或170、或其互補序列的至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個或至少25個連續(xù)核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互補的引導序列。

52.如權(quán)利要求50所述的組合物，其中所述引導rna分子包含與seq?id?no:28、29、31、32、171或172、或其互補序列的至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個或至少25個連續(xù)核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互補的引導序列。

53.如權(quán)利要求50所述的組合物，還包含rna引導的核酸內(nèi)切酶。

54.如權(quán)利要求53所述的組合物，其中所述rna引導的核酸內(nèi)切酶在所述引導rna分子的存在下在所述玉米或谷類植物的基因組中的所述靶dna序列處或附近導致雙鏈斷裂或切口。

55.如權(quán)利要求50所述的組合物，還包含重組dna供體模板，所述重組dna供體模板包含至少一個同源序列或同源臂，其中所述至少一個同源序列或同源臂與靶dna序列的至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少500個、至少1000個、至少2500個或至少5000個連續(xù)核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互補，其中所述靶dna序列是所述玉米或谷類植物的所述內(nèi)源ga3氧化酶基因的所述基因組基因座處或附近的基因組序列。

56.一種重組dna構(gòu)建體，其包含編碼非編碼引導rna分子的可轉(zhuǎn)錄dna序列，其中所述引導rna分子包含與玉米或谷類植物的內(nèi)源ga3氧化酶基因的基因組基因座處或附近的靶dna序列的至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個或至少25個連續(xù)核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互補的引導序列。

57.如權(quán)利要求56所述的重組dna構(gòu)建體，其中所述引導rna包含與seq?id?no:36、37、168、169或170、或其互補序列的至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個或至少25個連續(xù)核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互補的引導序列。

58.如權(quán)利要求56所述的重組dna構(gòu)建體，其中所述引導rna分子包含與seq?id?no:28、29、31、32、171或172、或其互補序列的至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個或至少25個連續(xù)核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互補的引導序列。

59.如權(quán)利要求56所述的重組dna構(gòu)建體，其中所述可轉(zhuǎn)錄dna序列可操作地連接到植物可表達啟動子。

60.如權(quán)利要求56所述的重組dna構(gòu)建體，其中所述引導rna分子是crispr?rna(crrna)或單鏈引導rna(sgrna)。

61.如權(quán)利要求56所述的重組dna構(gòu)建體，其中所述引導rna包含與所述谷類植物的基因組中存在的緊鄰所述內(nèi)源ga3氧化酶基因的基因組基因座處或附近的所述靶dna序列的原間隔序列鄰近基序(pam)序列互補的序列。

62.如權(quán)利要求56所述的重組dna構(gòu)建體，其中所述內(nèi)源ga3氧化酶基因編碼與seq?idno:30、33或173至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一的蛋白質(zhì)。

63.一種dna分子或載體，其包含如權(quán)利要求56所述的重組dna構(gòu)建體。

64.一種細菌或宿主細胞，其包含如權(quán)利要求56所述的重組dna構(gòu)建體。

65.一種玉米或谷類植物、植物部分或植物細胞，其包含如權(quán)利要求56所述的重組dna構(gòu)建體。

66.一種組合物，其包含如權(quán)利要求56所述的重組dna構(gòu)建體，其中所述組合物還包含rna引導的核酸內(nèi)切酶。

67.一種組合物，其包含如權(quán)利要求56所述的重組dna構(gòu)建體，其中所述組合物還包含第二重組dna構(gòu)建體，所述第二重組dna構(gòu)建體包含編碼rna引導的核酸內(nèi)切酶的第二可轉(zhuǎn)錄dna序列。

68.如權(quán)利要求67所述的組合物，包含含有所述重組dna構(gòu)建體和所述第二重組dna構(gòu)建體的dna分子或載體。

69.一種組合物，其包含第一dna分子或載體和第二dna分子或載體，其中所述第一dna分子或載體包含編碼靶向玉米或谷類植物的內(nèi)源ga3氧化酶基因的引導rna分子的重組dna構(gòu)建體，并且所述第二dna分子或載體包含編碼rna引導的核酸內(nèi)切酶的第二重組dna構(gòu)建體。

70.如權(quán)利要求50、66或69所述的組合物，還包含重組dna供體模板，所述重組dna供體模板包含至少一個同源序列或同源臂，其中所述至少一個同源序列或同源臂與靶dna序列的至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少500個、至少1000個、至少2500個或至少5000個連續(xù)核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互補，其中所述靶dna序列是玉米或谷類植物的內(nèi)源ga3氧化酶基因的基因組基因座處或附近的基因組序列。

71.一種重組dna供體模板，其包含至少一個同源序列，其中所述至少一個同源序列與靶dna序列的至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少500個、至少1000個、至少2500個或至少5000個連續(xù)核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互補，其中所述靶dna序列是玉米或谷類植物的內(nèi)源ga3氧化酶基因的基因組基因座處或附近的基因組序列。

72.如權(quán)利要求71所述的重組dna供體模板，其中所述至少一個同源序列相對于所述內(nèi)源ga3氧化酶基因的所述基因組基因座處或附近的所述靶dna序列的互補鏈包含至少一個突變。

73.如權(quán)利要求71所述的重組dna供體模板，其中所述至少一個同源序列與seq?id?no:36、37、168、169或170、或其互補序列的至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少500個、至少1000個、至少2500個或至少5000個連續(xù)核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互補。

74.如權(quán)利要求71所述的重組dna供體模板，其中所述至少一個同源序列與seq?id?no:28、29、31、32、171或172、或其互補序列的至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少500個、至少1000個、至少2500個或至少5000個連續(xù)核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互補。

75.一種重組dna供體模板，其包含兩個同源臂，所述兩個同源臂包括第一同源臂和第二同源臂，其中所述第一同源臂包含與第一側(cè)接dna序列的至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少500個、至少1000個、至少2500個或至少5000個連續(xù)核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互補的序列，其中所述第二同源臂包含與第二側(cè)接dna序列的至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少500個、至少1000個、至少2500個或至少5000個連續(xù)核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互補的序列，并且其中所述第一側(cè)接dna序列和所述第二側(cè)接dna序列是玉米或谷類植物的內(nèi)源ga3氧化酶基因的基因組基因座處或附近的基因組序列。

76.如權(quán)利要求75所述的重組dna供體模板，還包含位于所述第一同源臂與所述第二同源臂之間的插入序列。

77.如權(quán)利要求75所述的重組dna供體模板，其中每個同源臂與seq?id?no:36、37、168、169或170、或其互補序列的至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少500個、至少1000個、至少2500個或至少5000個連續(xù)核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互補。

78.如權(quán)利要求75所述的重組dna供體模板，其中每個同源臂與seq?id?no:28、29、31、32、171或172、或其互補序列的至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少500個、至少1000個、至少2500個或至少5000個連續(xù)核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互補。

79.一種玉米或谷類植物、植物部分或植物細胞，其包含如權(quán)利要求75所述的重組dna供體模板。

80.一種經(jīng)工程改造的位點特異性核酸酶，其與玉米或谷類植物的內(nèi)源ga3氧化酶基因的基因組基因座處或附近的靶標位點結(jié)合并在所述靶標位點處導致雙鏈斷裂或切口。

81.如權(quán)利要求80所述的經(jīng)工程改造的位點特異性核酸酶，其中所述位點特異性核酸酶是大范圍核酸酶或歸巢核酸內(nèi)切酶。

82.如權(quán)利要求80所述的經(jīng)工程改造的位點特異性核酸酶，其中所述位點特異性核酸酶是包含dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域和切割結(jié)構(gòu)域的鋅指核酸酶(zfn)。

83.如權(quán)利要求80所述的經(jīng)工程改造的位點特異性核酸酶，其中所述位點特異性核酸酶是包含dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域和切割結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶(talen)。

84.如權(quán)利要求80所述的經(jīng)工程改造的位點特異性核酸酶，其中由所述位點特異性核酸酶結(jié)合的所述靶標位點與seq?id?no:36、37、168、169或170、或其互補序列的至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少500個、至少1000個、至少2500個或至少5000個連續(xù)核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互補。

85.如權(quán)利要求80所述的經(jīng)工程改造的位點特異性核酸酶，其中由所述位點特異性核酸酶結(jié)合的所述靶標位點與seq?id?no:28、29、31、32、171或172、或其互補序列的至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少500個、至少1000個、至少2500個或至少5000個連續(xù)核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互補。

86.一種重組dna構(gòu)建體，其包含編碼位點特異性核酸酶的轉(zhuǎn)基因，其中所述位點特異性核酸酶與單子葉植物或谷類植物的內(nèi)源ga3氧化酶基因的基因組基因座處或附近的靶標位點結(jié)合并在所述靶標位點處導致雙鏈斷裂或切口。

87.如權(quán)利要求86所述的重組dna構(gòu)建體，其中所述轉(zhuǎn)基因可操作地連接到植物可表達啟動子。

88.如權(quán)利要求86所述的重組dna構(gòu)建體，其中所述位點特異性核酸酶是大范圍核酸酶或歸巢核酸內(nèi)切酶、鋅指核酸酶、或轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶(talen)。

89.一種玉米或谷類植物、植物部分或植物細胞，其包含如權(quán)利要求86所述的重組dna構(gòu)建體。

90.一種重組dna供體模板，其包含至少一個同源臂和插入序列，其中所述至少一個同源臂與玉米或谷類植物的基因組dna序列的至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少500個、至少1000個、至少2500個或至少5000個連續(xù)核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互補，并且其中所述插入序列包含含有編碼非編碼rna分子的可轉(zhuǎn)錄dna序列的重組dna構(gòu)建體，其中所述非編碼rna分子靶向單子葉植物或谷類植物或植物細胞中的一種或多種內(nèi)源ga3氧化酶基因進行遏制，并且其中所述可轉(zhuǎn)錄dna序列可操作地連接到植物可表達啟動子。

91.如權(quán)利要求90所述的重組dna供體模板，其中所述至少一個同源臂包含兩個同源臂，所述兩個同源臂包括第一同源臂和第二同源臂，

92.如權(quán)利要求90所述的重組dna供體模板，其中所述可轉(zhuǎn)錄dna序列可操作地連接到植物可表達啟動子。

93.如權(quán)利要求90所述的重組dna供體模板，其中所述非編碼rna分子包含與編碼ga氧化酶蛋白的mrna分子的至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26個或至少27個連續(xù)核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互補的序列，所述ga氧化酶蛋白與seq?id?no:30、33或173至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％同一。

94.一種轉(zhuǎn)基因玉米或谷類植物、植物部分或植物細胞，其包含如權(quán)利要求90所述的重組dna供體模板的插入序列。

95.一種用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因玉米或谷類植物的方法，其包括：(a)用如權(quán)利要求94所述的重組dna供體模板轉(zhuǎn)化外植體的至少一個細胞，以及(b)由所轉(zhuǎn)化的外植體再生或發(fā)育所述轉(zhuǎn)基因玉米或谷類植物，其中所述轉(zhuǎn)基因玉米或谷類植物包含所述重組dna供體模板的插入序列。

96.一種用于產(chǎn)生在內(nèi)源ga3氧化酶基因處或附近具有基因組編輯的玉米或谷類植物的方法，其包括：

97.如權(quán)利要求96所述的方法，其中所述引入步驟(a)還包括引入非編碼引導rna分子或包含編碼非編碼引導rna分子的可轉(zhuǎn)錄dna序列的第二重組dna構(gòu)建體，其中所述引導rna分子包含與玉米或谷類植物的內(nèi)源ga3氧化酶基因的基因組基因座處或附近的靶dna序列的至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個或至少25個連續(xù)核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互補的引導序列。

98.如權(quán)利要求96所述的方法，其中所述引入步驟(a)還包括引入包含至少一個同源序列或同源臂的dna供體模板，其中所述至少一個同源序列或同源臂與靶dna序列的至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少500個、至少1000個、至少2500個或至少5000個連續(xù)核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互補，其中所述靶dna序列是所述玉米或谷類植物的所述內(nèi)源ga3氧化酶基因的基因組基因座處或附近的基因組序列。

99.如權(quán)利要求96所述的方法，還包括：

100.如權(quán)利要求99所述的方法，其中所述選擇步驟(c)包括使用分子測定來確定所述內(nèi)源ga3氧化酶基因基因座是否被編輯。

101.如權(quán)利要求99所述的方法，其中所述選擇步驟(c)包括通過觀察植物表型來確定所述內(nèi)源ga3氧化酶基因是否被編輯。

102.一種經(jīng)修飾的玉米植物，其具有小于2000mm、小于1950mm、小于1900mm、小于1850mm、小于1800mm、小于1750mm、小于1700mm、小于1650mm、小于1600mm、小于1550mm、小于1500mm、小于1450mm、小于1400mm、小于1350mm、小于1300mm、小于1250mm、小于1200mm、小于1150mm、小于1100mm、小于1050mm、或小于1000mm的植株高度，以及(i)大于18mm、大于18.5mm、大于19mm、大于19.5mm、大于20mm、大于20.5mm、大于21mm、大于21.5mm、或大于22mm的平均莖或稈直徑，(ii)相對于野生型對照植物改善的抗倒伏性，或(iii)相對于野生型對照植物改善的耐旱性。

103.如權(quán)利要求102所述的經(jīng)修飾的玉米植物，其中所述玉米植物相對于野生型對照植物具有以下性狀中的一者或多者：增加的稈/莖直徑、改善的抗倒伏性、減少的未成熟折斷、較深的根、增加的葉面積、較早的冠層郁閉、較高的氣孔導度、較低的穗高度、增加的葉片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正?；蛳薜蛳匏{迫條件下葉中減少的花青素含量和面積、增加的穗重量、增加的收獲指數(shù)、增加的產(chǎn)量、增加的種子數(shù)量、增加的種子重量和/或增加的多產(chǎn)性。

104.如權(quán)利要求102所述的經(jīng)修飾的玉米植物，其中所述玉米植物的稈或莖的至少一個節(jié)間組織中的一種或多種活性ga的水平低于野生型對照植物的相同節(jié)間組織。

105.一種經(jīng)修飾的谷類植物，其具有相對于野生型對照植物降低的植株高度，以及(i)相對于野生型對照植物增加的莖或稈直徑，(ii)相對于野生型對照植物改善的抗倒伏性，或(iii)相對于野生型對照植物改善的耐旱性。

106.如權(quán)利要求105所述的經(jīng)修飾的谷類植物，其中所述谷類植物的莖或稈中的一種或多種活性ga的水平低于野生型對照植物。

107.一種經(jīng)修飾的玉米或谷類植物，其包含內(nèi)源ga3氧化酶基因的突變等位基因，其中所述經(jīng)修飾的玉米或谷類植物相對于對照植物具有較矮的植株高度。

108.如權(quán)利要求107所述的經(jīng)修飾的玉米或谷類植物，其中所述經(jīng)修飾的植物對于所述內(nèi)源ga3氧化酶基因的所述突變等位基因是純合的。

109.如權(quán)利要求107所述的經(jīng)修飾的玉米或谷類植物，其中所述經(jīng)修飾的植物包含所述內(nèi)源ga3氧化酶基因的兩個不相同的突變等位基因。

110.如權(quán)利要求107所述的經(jīng)修飾的玉米或谷類植物，其中所述經(jīng)修飾的植物對于所述內(nèi)源ga3氧化酶基因的所述突變等位基因是雜合的。

111.如權(quán)利要求107所述的經(jīng)修飾的玉米或谷類植物，其中所述內(nèi)源ga3氧化酶基因的所述突變等位基因包含通過誘變技術(shù)引入的所述內(nèi)源ga3氧化酶基因中的一個或多個突變。

112.如權(quán)利要求107所述的經(jīng)修飾的玉米或谷類植物，其中所述內(nèi)源ga3氧化酶基因的所述突變等位基因包含通過靶向基因組編輯技術(shù)引入的所述內(nèi)源ga3氧化酶基因中的一個或多個編輯或突變。

113.如權(quán)利要求112所述的經(jīng)編輯的玉米或谷類植物，其中所述一個或多個編輯或突變是使用大范圍核酸酶、鋅指核酸酶(zfn)、rna引導的核酸內(nèi)切酶、tale核酸內(nèi)切酶(talen)、重組酶或轉(zhuǎn)座酶引入的。

114.如權(quán)利要求107所述的經(jīng)編輯的玉米或谷類植物，其中所述突變等位基因包括相對于所述對照植物中的所述內(nèi)源ga3氧化酶基因的序列的一個或多個核苷酸的取代、缺失、插入或倒位。

115.如權(quán)利要求107所述的經(jīng)修飾的玉米或谷類植物，其中相對于對照植物，所述玉米或谷類植物中所述內(nèi)源ga3氧化酶基因的所述突變等位基因的活性和/或表達水平被降低或消除。

116.如權(quán)利要求107所述的經(jīng)修飾的玉米或谷類植物，其中所述經(jīng)修飾的植物相對于所述對照植物具有以下附加性狀中的一者或多者：增加的稈/莖直徑、改善的抗倒伏性、減少的未成熟折斷、較深的根、增加的葉面積、較早的冠層郁閉、較高的氣孔導度、較低的穗高度、增加的葉片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正?；蛳薜蛳匏{迫條件下葉中減少的花青素含量和面積、增加的穗重量、增加的收獲指數(shù)、增加的產(chǎn)量、增加的種子數(shù)量、增加的種子重量和增加的多產(chǎn)性。

117.如權(quán)利要求107所述的經(jīng)修飾的玉米或谷類植物，其中所述經(jīng)修飾的植物的所述高度比所述對照植物矮至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。

118.如權(quán)利要求107所述的經(jīng)修飾的玉米或谷類植物，其中所述經(jīng)修飾的植物在一個或多個莖節(jié)間處的稈或莖直徑比所述對照植物大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。

119.如權(quán)利要求107所述的經(jīng)修飾的玉米或谷類植物，其中所述經(jīng)修飾的植物的稈或莖的至少一個節(jié)間組織中的一種或多種活性ga的水平低于所述對照植物的相同節(jié)間組織。

120.如權(quán)利要求107所述的經(jīng)編輯的玉米或谷類植物，其中所述經(jīng)修飾的所述植物的稈或莖的至少一個節(jié)間組織中的一種或多種活性ga的水平比所述對照植物的相同節(jié)間組織低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。

121.如權(quán)利要求107所述的經(jīng)編輯的玉米或谷類植物，其中所述經(jīng)修飾的植物在至少一個雌性器官或穗中不具有任何顯著的異型。

技術(shù)總結(jié)
本公開提供了用于改變玉米或其他谷類植物中的赤霉素(GA)含量的組合物和方法。還提供了用于通過遏制、誘變和/或編輯GA20或GA3氧化酶基因的特定亞型來改變與赤霉素生物合成相關的基因的表達的方法和組合物。還提供了具有降低GA氧化酶基因的表達或活性的遏制元件或突變的經(jīng)修飾的植物細胞和植物，其包含降低的赤霉素水平和改善的特性，諸如降低的植株高度和增加的抗倒伏性，但沒有異型。

技術(shù)研發(fā)人員：T·帕西奧雷克,T·斯勒維斯基
受保護的技術(shù)使用者：孟山都技術(shù)公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10