專利名稱：:在植物汁液中產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法本發(fā)明涉及產(chǎn)生能表達所需基因產(chǎn)物的遣傳上轉(zhuǎn)化過的植物的方法，也涉及具有相同能力的所說遺傳上轉(zhuǎn)化過的植物的克隆。具體的說，所涉及的植物是一類產(chǎn)生豐富汁液(fluid)的植物，并且，靶基因產(chǎn)物在所說汁液中被表達。更優(yōu)選的，所說植物是橡膠(三葉橡膠屬)植物，所說的基因是編碼有藥用價值蛋白質(zhì)產(chǎn)物的外源基因，所說的蛋白質(zhì)產(chǎn)物能從植物產(chǎn)生的膠乳中獲得并能從中回收。以通過表達“外源”基因產(chǎn)生特異蛋白質(zhì)為目的的各種微生物(如酵母、真菌和細菌)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是眾所周知的。然而，微生物需要維治其生存和繁殖的合適條件，例如，通常需要小心控制環(huán)境溫度、pH值和通氣量，同時營養(yǎng)物必須以小心校準過的劑量加入到培養(yǎng)基中，并要移去廢產(chǎn)物。必須有嚴格的滅菌步驟以避免外來微生物的污染。因而，微生物通常在復(fù)雜的發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，而且這些發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器被設(shè)置在昂貴維持的工廠中。上述費用被蛋白質(zhì)終產(chǎn)物的高價格反映出來。最近，人們的注意力已轉(zhuǎn)向?qū)⑼庠椿蛞氲街参?例如煙草)中。本申請的基因轉(zhuǎn)化技術(shù)使得改進作物和可提取的、有價值的外源蛋白質(zhì)(例如抗體)生物技術(shù)產(chǎn)物的各種重要的遺傳特征相結(jié)合。與微生物不同，植物傾向于滿足自身的需要，僅需要陽光、水和基本的園藝投入，并且很容易在高效益的條件下培育。已開發(fā)出了幾種不同的技術(shù)能使外源基因引入到各種植物的品種中，這些技術(shù)包括——土壤桿菌屬微生物載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)涉及用已插入外源基因的細菌(土壤桿菌屬)感染植物組織。用土壤桿菌屬微生物轉(zhuǎn)化植物細胞的許多方法是公知的(Vancanneytetal.，1990；Horschetal.，1985；Bevan，1984和Herrera-Estrellaetal.，1983)；——生物排列(biolistic)或粒子槍方法。這一方法通過用包衣DNA微粒轟擊(bombarding)可再生組織(例如分生組織或胚胎形成愈傷組織)使遺傳物質(zhì)直接傳送到完整細胞或組織中。微粒透過植物細胞，作為被引入遺傳物質(zhì)的惰性載體(Gordon-Kammetal.，1990和Sanfordetal，1987)。胚形成懸浮培養(yǎng)物微彈轟擊被證實能成功地產(chǎn)生黃楊屬植物(Daytonetal，1992)，棉花(Finer和McMullen，1990)、玉米(Gordon-Kammetal，1990)和大豆(McMullen和Finer，1990)的轉(zhuǎn)基因植物。影響經(jīng)粒子轟擊的DNA傳送的各種參數(shù)己被限定(Kleinetal，1988；Wangetal，1988)；——通過將外源基因吸入到植物組織中(Simon，1974)；和——-electroporation然而，當(dāng)采用這一方法時，靶產(chǎn)物的回收涉及到整個植物或至少植物的主要部分收獲和破裂。即使植物不是整體被采收，在可以進行下一次收獲之前它也需要長的恢復(fù)期再生長。此外，從植物例如煙草中(實際上也從大多數(shù)通常用于這些目的的微生物中)提取蛋白質(zhì)產(chǎn)物涉及到組織固體的勻化作用。這會是相對困難和低效率的操作。巴西橡膠樹HeveabrasiliensisMuell-Arg屬于Euphorbiaceae家族，己被商業(yè)性開發(fā)用于產(chǎn)生天然橡膠約一個世紀。事實上在三葉橡膠屬中有九個品種，但Heveabrasiliensis被最廣泛地種植并獲得商業(yè)價值，因它給出最高的膠乳產(chǎn)量。膠乳傳統(tǒng)地用稱作“割膠”“的方法從橡膠樹抽取。這可以兩種技術(shù)進行，其一是樹皮切除技術(shù)，其中一塊樹皮從樹上割下以便膠乳流出(后續(xù)的割漿通過在相同切割處切除樹皮的一薄層進行)，其二是樹皮切入技術(shù)，按照這一技術(shù)在樹皮上鉆一個或多個孔使膠乳流出。因此，割膠是膠乳回收的非破環(huán)性方法，它可重復(fù)性地并在有規(guī)律的間隙(通常是每隔一天)進行。天然橡膠構(gòu)成膠乳的約1/3，并且很容易用各種分離技術(shù)(如離心)抽提。產(chǎn)生豐富的樹液或流出物，即膠乳，橡膠樹是最重要的，膠乳可連續(xù)收獲而無有害影響，本發(fā)明利用橡膠樹的這一性質(zhì)以及遺傳工程技術(shù)，提供了一種產(chǎn)生有藥用價值的蛋白質(zhì)和其它靶產(chǎn)物的新的和有利的路線。按照本發(fā)明，這里提供了一種產(chǎn)生遺傳上轉(zhuǎn)化過的產(chǎn)汁液植物的方法，該方法包括i)向植物組織插入控制靶產(chǎn)物表達的基因或基因片斷，和ii)從所說組織再生一種植物，該遺傳上轉(zhuǎn)化過的植物能夠在其所產(chǎn)生的汁液中表達靶產(chǎn)物。按照本發(fā)明的另一個實施方案，這里提供了一種植物克隆，該克隆在其細胞中含有包括控制靶產(chǎn)物表達的一個啟動子和一個基因或基因片斷的染色體插入物，以便所說靶產(chǎn)物在其所產(chǎn)生的汁液中被表達或能夠被表達。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種三葉橡膠屬植物克隆，該克隆在其細胞中含有包括控制靶產(chǎn)物表達的一個啟動子和一個基因或基因片斷的染色體插入物，以便所說靶產(chǎn)物在其膠乳中被表達或能夠被表達。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生前面提到類型的克隆的方法，該方法包括芽的稼接法種植、取出一個切條(takingacutting或另外進行一種適合遺傳上轉(zhuǎn)化的植物的營養(yǎng)繁殖。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生蛋白質(zhì)或其它產(chǎn)物的方法，該方法包括i)從遺傳上轉(zhuǎn)化過的產(chǎn)汁液樹或植物或其克隆收獲汁液，和ii)從所說汁液中回收靶蛋白質(zhì)或其它產(chǎn)物。該方法可用于三葉橡膠屬的所有品種，本文所提及的三葉橡膠屬植物和樹將相應(yīng)地被理解，但Heveabrasiliensis是特別優(yōu)選的。三葉橡膠屬植物很適合用于本發(fā)明中，因為它們產(chǎn)生的汁液(即膠乳)易于非破壞性的采收，易于處理，并且是天然蛋白質(zhì)豐富的(而且因此可在轉(zhuǎn)基因植物中控制外源蛋白質(zhì)產(chǎn)生)。然而，將會理解到其它產(chǎn)生(即保留或排出)豐富汁液或樹液的植物也適用于本發(fā)明，例子包括——龍舌蘭屬植物。一些品種能從它們挖空的樹心(hollowed-outpith)每天產(chǎn)生高達一升的流出物?！訕?。其花朵可被采收，導(dǎo)致流水物的大量流出。——植物器官，它們不排出但保留相當(dāng)體積的汁液，例如，未成熟的椰子汁液(即“水”或“奶”)的液體胚乳可被大量收獲。本發(fā)明范圍內(nèi)的方法分成三個主要階段i)植物的遺傳轉(zhuǎn)化過程，其中代表編碼靶蛋白質(zhì)或其它產(chǎn)物的基因的DNA分子被插入到植物組織的遺傳補體中。所述基因也需要啟動子的伴隨是合意的。只要所謂的“通用”啟動子(它們是非組織特異性的，通常在所有植物組織包括樹液或汁液中啟動基因表達)可被使用，該啟動子就是更優(yōu)選的汁液特異性的。就橡膠植物來說，該啟動子是最優(yōu)選的膠乳特異性的。各種向植物引入基因的技術(shù)是已知的，如上述所提到的，這些技術(shù)中的任何一種均可被使用。特別優(yōu)選的是土壤桿菌屬微生物載體系統(tǒng)，這一系統(tǒng)涉及用一種已插入所需基因進行生物排列或粒子槍轟擊的土壤桿菌屬微生物感染植物組織，按這一方法，所需基因以一種微粒形式被推進到植物組織中。帶有插入基因或基因片斷的植物組織被稱作轉(zhuǎn)化過的或轉(zhuǎn)基因組織。就橡膠植物來說，轉(zhuǎn)化在花藥派生的愈傷組織上完成，所說愈傷組織是從三葉橡膠屬植物上花的雄蕊柱狀物取得的。被轉(zhuǎn)化技術(shù)引入的啟動子和基因或基因片斷對所涉及的植物來說可以是自生的或外源的。通過修飾啟動子或插入自身基因的多重復(fù)制體來提高該基因的表達是可能的。外源基因可被導(dǎo)入，這些基因編碼多種以蛋白質(zhì)為基體的產(chǎn)物，最優(yōu)選的是具有藥用價值的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。ii)從轉(zhuǎn)化過的組織再生植物，種植并養(yǎng)護至成熟。例如，通過組織培養(yǎng)技術(shù)，三葉橡膠屬的轉(zhuǎn)化過的愈傷組織被再生，經(jīng)胚胎階段到小植株，該植株是轉(zhuǎn)因基的，在其遺傳補體中帶有被插入的基因。以后，小植株成熟至完全發(fā)育的轉(zhuǎn)基因橡膠樹，由被插入基因表達的靶蛋白質(zhì)和其它產(chǎn)物存在于其膠乳中。iii)在由植物或樹產(chǎn)生的汁液中的靶蛋白質(zhì)或其它產(chǎn)物的采集及回收。就三葉橡膠屬植物來說，收獲的汁液理所當(dāng)然的將是膠乳。一旦轉(zhuǎn)基因橡膠植物生長至足夠成熟(通常是在2-5年之后)，就采割它們，在有規(guī)律的時間間隔收獲膠乳。然后，離心膠乳，以分離出天然橡膠，含水C-漿液和所謂的“底組分”。靶蛋白或其它產(chǎn)物可以包含在膠乳的任何部分，并且能經(jīng)一般方法(例如制備型柱層析)提取和純化，較好情況下它們存在于C-漿液或底組分(bottomfraction)中，后者主要包括黃色體，黃色體是含有其自身漿液(B-漿液)的膜結(jié)合泡囊?？赏ㄟ^使用洗滌劑(如TritonX-100)裂開它們的膜或通過交替冷凍或解凍使B-漿液從黃色體釋放。膠乳中可以結(jié)合到生物膜上的任何靶蛋白質(zhì)或其它產(chǎn)物都可通過用洗滌劑(例如十二烷基硫酸鈉)加溶的方法收回。本發(fā)明提供了一種合成許多蛋白質(zhì)產(chǎn)物和非蛋白質(zhì)產(chǎn)物的新的和有利的路線。它特別適合于有藥用價值的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的制備，從原理上講，倘若編碼其表達的基因是已知的，該技術(shù)應(yīng)能應(yīng)用于實質(zhì)上任何以蛋白質(zhì)為基質(zhì)的產(chǎn)物的合成。由被插入基因直接編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物能在植物體由自身催化不同終產(chǎn)物的產(chǎn)生是所期望的。然后，后面的(蛋白質(zhì)的或非蛋白質(zhì)的)產(chǎn)物作為有商業(yè)價值的終產(chǎn)物被收獲。可以由轉(zhuǎn)基因植物或樹產(chǎn)生的產(chǎn)物的例子如下(a)治療糖尿病的胰島素(b)治療血友病(haemophilia)的血凝塊因子(c)治療心臟病的血塊溶解激活劑(d)治療腫瘤的腫瘤壞死因子(e)治療貧血的紅細胞生成素(f)生產(chǎn)疫苗的病毒包衣蛋白(g)“PHB”，一種類似于聚丙烯的塑料，用于制造瓶子，包裝材料等。本發(fā)明中的特異橡膠樹的使用具有許多明顯的優(yōu)點，其中，下列特別值得注意——生產(chǎn)是連續(xù)的，因為含有靶蛋白或其它產(chǎn)物的膠乳在有規(guī)律的間隙收獲，并且產(chǎn)物回收簡單，因膠乳是一種汁液，靶產(chǎn)物的回收不涉及組織勻化?！摲椒ㄅc環(huán)境協(xié)調(diào)，過程由太陽所驅(qū)動，因而是能量效率高的，并且基本上無污染?！鹉z樹除要日常的園藝學(xué)養(yǎng)護外，不需要任何特別關(guān)注，因而它們的使用是低耗費的?！摷夹g(shù)能用于許多靶產(chǎn)物——從橡膠樹流出的乳膠完全沒有細菌和動物病毒，這一點與在使用遺傳上轉(zhuǎn)化過的微生物和動物時需采用的嚴格的滅菌操作正好相反?！鹉z樹易于克隆或營養(yǎng)繁殖，大多數(shù)通常是經(jīng)芽的嫁接種殖。其它方法包括取出一個切條，壓條繁殖或組織培養(yǎng)。這樣，無數(shù)的遺傳性相同的植物(克隆)可從單個轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生——所有這些都將在它們的膠乳中表達所需產(chǎn)物?！鹉z樹有實用的生命期，約30年，在此其間，除產(chǎn)生靶產(chǎn)物外，遣傳上轉(zhuǎn)化過的樹當(dāng)然在其膠乳中連續(xù)產(chǎn)生天然橡膠，天然橡膠自身是有價值的商品。當(dāng)其最終被砍伐時，該樹也產(chǎn)出了有價值的熱帶木材(橡膠木)，它是出口和制造家具非常需要的。適用于本發(fā)明的其它產(chǎn)汁液植物具有這些優(yōu)點中的一些。附圖1，用色素底物X-gluc處理后三葉橡膠屬植物組織中的GUS活性。(A)對照愈傷組織。(B)從3周齡轟擊過的花藥愈傷組織取得的細胞。(C)對照胚狀體。(D)粒子轟擊后的胚狀體。所有照片放大倍數(shù)是25倍。附圖2，顯示與對照值(U.T.E)相比，在經(jīng)轟擊過的三葉橡膠屬植物胚狀體(T.E)中GUS活性的桿狀圖。以平均值±s.d給出結(jié)果；n＝20個胚狀體。附圖3，與對照值相比在轟擊過的愈傷組織中的NPTII蛋白質(zhì)水平。給出了含有NPTII基因的三種不同質(zhì)粒(參見前述方法)的結(jié)果，以平均值±s.d.給出值；n＝x次重復(fù)。附圖4，顯示預(yù)先經(jīng)質(zhì)粒pDE10轟擊過的三葉橡膠屬植物組織中CAT活性的放射自顯影。表示了〔14C〕氯霉素(CAP)、〔14C〕1-乙?；让顾?1-CAP)和〔14C〕3-乙?；让顾?3-CAP)的位置。第1道用作陽性對照的商品CAT(Sigma)；第二道陰性對照(僅含緩沖液)；第3道對照(未經(jīng)轟擊的)花藥愈傷組織，第4-6道用硫酸卡那霉素選擇3周后的不同轉(zhuǎn)化過的花藥愈傷組織；第7道從在硫酸卡那霉素存在下經(jīng)轟擊的愈傷組織再生的胚狀物組織。附圖5，由X周齡抗菌選擇性的三葉橡膠屬植物愈傷組織中分離的DNA的gus基因的擴增。第1道1Kb梯。第2道500ngDNA，第3道100ngDNA。第4道20ngDNA.第5道4ngDNA.第6道0.8ngDNA。附圖6，(E)從附圖1所示的經(jīng)粒子轟擊過的組織生長出的三葉橡膠屬植物的小植株，用色素底物X-gluc處理后的GUS活性。(F)對照根。(G)從轉(zhuǎn)化的胚狀體再生的根，所有照片放大25倍。附圖7，用從再生Heveabrasiliensis植物分離的基因組DNA的PCR進行的gus基因檢測。第1道1Kb梯，第2道從對照(未經(jīng)轟擊的)植物獲得的4.0ngDNA；第3道從轉(zhuǎn)化的愈傷組織獲得的4.0ngDNA；第4道從轉(zhuǎn)化的胚狀體獲得的4.0ngDNA。第5道從轉(zhuǎn)化的三葉橡膠膠屬小植株的單葉分離出的4.0ngDNA。附圖8，(H)在X-gluc中培養(yǎng)的葉樣品的表面。未轉(zhuǎn)化的樣品端部未被染色，而轉(zhuǎn)化的樣品(下部)被染成藍色，照片放大倍數(shù)為10倍。(I)在X-gluc中培養(yǎng)的葉樣的截面，未轉(zhuǎn)化的樣品(端部)未被染色，而轉(zhuǎn)化的樣品(下部)被染成蘭色。照片放大倍數(shù)為31倍?，F(xiàn)在以下列實施例進一步說明本發(fā)明，實施例1涉及用粒子槍法的Heveabrasiliensis的遺傳轉(zhuǎn)化，而實施例2和3分別說明了土壤桿菌屬微生物載體系統(tǒng)和吸入技術(shù)的用途，葡萄糖醛酸酶用作靶蛋自質(zhì)的一個例子，但相同的步驟可通用于其它產(chǎn)物，只是用靶蛋白質(zhì)的合適基因代替控制葡萄糖醛酸酶產(chǎn)生的基因。實施例中引用了下列縮寫詞MB＝三葉橡膠屬花藥培養(yǎng)起始培養(yǎng)基GUS/gus＝β-葡萄糖醛酸酶NPTII/nptII＝新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶CAT/cat＝氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶PCR＝聚合酶鏈反應(yīng)ELISA＝酶聯(lián)免疫吸附試驗CaMV＝花椰菜花葉病毒實施例1植物材料的組織培養(yǎng)從雄蕊柱狀物的單個花藥取出胚發(fā)生三葉橡膠屬植物花藥愈傷組織，將該愈傷組織在25℃置入并保持在MB培養(yǎng)基(Chenetal，1984)中，并在四周后用于在該培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)化，所有組織培養(yǎng)步驟基本上按照Chenelal，(1984)所描述的方案。植物表達載體下列質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化含有β-葡萄糖醛酸酶(gus)基因的pBI22I.I(Jefferson，1987)，含有g(shù)us和nptII基因的pMON9793(Gas-set，MonsantoCompany，未出版)，含有Cat和nptII基因的pDE10(Rhodes，Norwich，UK)和含有nptII基因的pHP23(Paszkowski和Saul，1988)。這些基因在強CaMV35S啟動子控制下。重組質(zhì)粒在大腸桿菌中生長，所說大腸桿菌是經(jīng)堿解(alkalilysis)分離并經(jīng)氯化絕/溴化3.8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓密度梯度離心(Sambrook，F(xiàn)ritschandManiatis，1989)純化的。質(zhì)粒DNA由其在260nm的吸收和凝膠電泳定量。微彈轟擊質(zhì)粒DNA如現(xiàn)有技術(shù)(Gordon-Kammetal，1990)所描述的沉淀在鎢粒子上。該沉淀混合物包括在總體積575μL中的1.30mg鎢粒子、25μg質(zhì)粒DNA，1.1MCaCl2.2H2O和8.7mM亞精胺。在以上述順序加入各組分后，混合物在4℃旋渦攪拌10分鐘，在500xg下離心5分鐘，然后棄掉550μL上清液，底部沉淀重新懸浮在剩下的25μL上清液中，并且其中的1μL鎢懸浮物被裝入微彈，用生物排列粒子槍(spearlineprecisionEngineeringLtd，UK)朝靶加速?；ㄋ幱鷤M織放置在Whatman1號濾紙片(7cm)的中央，該濾紙片在轟擊之前再放到含有MB培養(yǎng)基的塑料佩特里細菌培養(yǎng)皿(9cm直徑)的中央。將愈傷組織培養(yǎng)物放置在微彈終止板下5cm，且在終止板和組織之間的中途設(shè)置一個100-μm網(wǎng)眼不銹鋼篩以幫助鎢粒子分散。每塊板轟擊一次，然后將愈傷組織在25℃下的生長室中避光培養(yǎng)一會兒。轉(zhuǎn)化體的挑選在轟擊后25℃的避光培養(yǎng)后，從濾紙上輕輕移去愈傷組織并放置在含有MB培養(yǎng)基的新鮮的板上，在25℃避光繼續(xù)培養(yǎng)10天。將轟擊過的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有100μg硫酸卡那霉素/ml的MB選擇培養(yǎng)基上。在轟擊并轉(zhuǎn)移到含100g硫酸卡那霉素/ml的分化培養(yǎng)基上以及在25℃有光(250μEm-2s-1)培養(yǎng)四周后分離抗菌抑制性克隆。這刺激了芽和根的生長，然而，即使沒有抗菌選擇，僅有小部分(3％)的體細胞胚胎分化成小植株(Chenatal.，1981b)。酶試驗NPTII轉(zhuǎn)化組織的NPTII活性用ELISA試劑盒(5Prime-3Prime，Inc.，由CPLaborartories，UK獲得)測定，每個試驗使用約400μg的提取蛋白質(zhì)。GUS三葉橡膠屬的轉(zhuǎn)化花藥愈傷組織、胚狀體和根中。β-葡萄糖苷酸酶活性的組織化學(xué)分析按Jefferson(1987)的方案使用底物5-溴-4-氯-3-吲哚基葡糖苷酸(X-gluc)來完成。在加入X-gluc18-36小時后測定組織被染成藍色的細胞，使用NikonSZM-U1∶10倍雙筒顯微鏡用KodacolorTungsten160T膠片顯微照相，用底物4-甲基-umbelliferyl-β-D-葡糖苷酸完成GUS活性的螢光測定試驗(Jeffersonetal.，1987)。CAT按Gormanetal.，1982所描述的方法測定CAT活性。使用1單位的細菌CAT酶(Sigma)用轟擊過的組織樣品平行作陽性對照。陰性對照包括CAT緩沖液和未經(jīng)轟擊的胚狀體的提取物樣品。DNA分離和PCRDAN分離基因組DNA使用如Draperetal.，(1988)描述的蛋白酶方法分離。50mg凍干的三葉橡膠屬植物組織用碾槌和研缽磨成極細的粉末。然后，粉末狀組織與400μL蛋白酶緩沖液(100mMTris-HClPH8.5，100mMNaCl，50mMEDTApH8.0，2.0％SDS，0.1mg蛋白酶KmL-1)充分混合并且以偶然輕輕轉(zhuǎn)動在37℃下培養(yǎng)1-2小時。用80μL苯酚和80μL24∶1(V/V)氯仿/異戊醇提取組織/緩沖液勻漿。離心分離水相并重復(fù)提取步驟。第二次提取后合并的水相用0.54體積的異丙醇在-20℃下沉淀過夜。第二天，沉淀用70％乙醇洗滌并重新懸浮在50μLTE緩沖液(10mMTris-HClPH8.0，1.0mMEDTAPH8.0)中。為三葉橡膠屬植物基因組DNA的限制性，在限制性緩沖液中經(jīng)常包括2μL10×BSA/亞精胺)2.5mgBSAmL-1，40mM亞精胺以克服雜質(zhì)出現(xiàn)引起的問題。PCR每一個PCR反應(yīng)在含有10mMTris-HClPH8.8，50mMKCl、1.5mMMgCl2、50μL礦物油、200μMdATP、200μMdTTP、200μMdCTP、200μMdGTP、Taq聚合酶(0.5-1.0U)、DNA(2-10ng)和寡核苷酸引物5’GGTGGGAAAGCGCGTTACAAG3’和5’GTTTACGCGTTGCTTCCGCCA3’(分別在GUS基因的400-420和1599-1579位，Jeffersonetal，1986)的50μL溶液中進行。在PCR反應(yīng)中每個引物使用100ng，Taq聚合酶從AmershamInternationalplc獲得。變性溫度是92℃(持續(xù)1分鐘)，退火溫度是55℃(持續(xù)1.5分鐘)，伸展溫度是72℃(持續(xù)2.0分鐘)，反應(yīng)設(shè)定為30個循環(huán)，使用可程序化的熱控器(TheHybaidThermalReactor)。經(jīng)使用TBE(0.9MTris-HCl，25mMEDTA，0.9mMH3BO3)作為顯層緩沖液(rμnningbuffer)將樣品在1.0％瓊脂糖/溴化3.8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓膠上顯層(running)后檢測DNA。結(jié)果轉(zhuǎn)化和再生在為研究過渡基因表達所建立的將基因引入到大麥胚胎的方法(M.G.K.Jones，Rothamsted，UK)之后采用了生物排列方案。供粒子轟擊的新使用的花藥愈傷組織是高度胚形成三葉橡膠屬植物克隆派生的(克隆登記號11)。一段將轟擊過的愈傷組織轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基中，卡那霉素抗性的微愈傷組織表現(xiàn)出生長緩慢，然而，這些轉(zhuǎn)化過的愈傷組織顯得健壯并在黑色和正在死亡的未經(jīng)轟擊的愈傷組織中間呈白色(附圖1)。使用質(zhì)粒pMON9793轟擊后一旦加入X-gluc，呈現(xiàn)藍色的抗菌選擇性的愈傷組織和胚胎的百分率在愈傷組織中達90％，胚胎中達80％。使用pBI221.2但未用卡那霉素選擇時，呈藍色的百分率愈傷組織達60％，胚胎達70％(表2)，使用質(zhì)粒pMON9793時在轟擊過的愈傷組織和胚胎中所表現(xiàn)出的高轉(zhuǎn)移效率很可能是由于卡那霉素選擇。表2表達GUS活性的愈傷組織和胚胎的百分率質(zhì)粒10轉(zhuǎn)化體10愈傷組織數(shù)9表達GUS愈傷組織數(shù)8百分率90pMON979310花藥愈傷組織10胚胎6pBI221.27花藥愈傷組織60胚胎70GUS的組織化學(xué)試驗常說明在保持未經(jīng)卡那霉素選擇的愈傷組織中的酶活性的異型，但是在經(jīng)卡那霉素選擇后的細胞中表現(xiàn)出同型。當(dāng)使用X-gluc時，沒有對照(未經(jīng)轟擊的)花藥愈傷組織、胚胎或根染成蘭色。這些實驗的結(jié)果總結(jié)在示于附圖1的顯微照片中。使用熒光活性試驗(附圖2)證實了從GUS活性的組織化學(xué)染色所獲得的結(jié)果。90％被分析的轉(zhuǎn)化過的胚胎中被證實有GUS熒光活性，與未經(jīng)轟擊的對照值相比轉(zhuǎn)化過的胚胎中的GUS活性總共增加4倍。使用ELISA技術(shù)(附圖3)對轉(zhuǎn)化過的愈傷組織中的NPIII水平定量。總的來說，NPTII蛋白質(zhì)水平高出本底對照值約4倍，范圍從每mg總蛋白質(zhì)28到32ngNPTII。除了使用gus作為報告基因(reportergene)外，我們還使用cat基因控制基因向三葉橡膠植物的傳遞。這些實驗的結(jié)果總結(jié)在附圖4所示的放射自顯影照片中。很明顯含有cat基因的質(zhì)粒能通過轟擊傳遞并在三葉橡膠屬植物愈傷組織和胚胎組織中有效地被表達。在未經(jīng)轟擊的對照組織(附圖4第3道)中僅觀察到CAT活性的很低水平。用PCR技術(shù)完成三葉橡膠屬植物愈傷組織中轉(zhuǎn)移的報告基因出現(xiàn)的直接檢測。Hamilletal.，(1991)的方法被用于擴增gus的內(nèi)序列。使用至少0.8ng模板DNA經(jīng)30個擴增循環(huán)后在瓊脂糖/溴化3.8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓膠上可見單個帶(附圖5)，該擴增帶大小與gus基因相同。最后，在粒子轟擊后，我們設(shè)法再生兩個三葉橡膠屬小植株(無菌生長)(附圖6)。該小植株表現(xiàn)得很正常，以X-gluc處理后其根染成蘭色。用在源于愈傷組織的DNA上完成的相同的PCR方案證實了在這些小植株的一個中出現(xiàn)gus基因。如附圖7所示，用少至4.0ng三葉橡膠屬植物葉片DNA達到了gus基因的成功擴增。我們不能使用上描述的相同的PCR條件在任何對照(未經(jīng)轟擊的)愈傷組織、胚胎或小植株中擴增gus基因。這些結(jié)果說明，如由報告基因試驗、卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化體回收和PCR技術(shù)使用所測定的，微彈/微粒能將外源DNA轉(zhuǎn)入到Heveabrasiliensis細胞中。被帶到細胞中的DNA明顯地從微彈表面釋放并經(jīng)某些被動或主動機制轉(zhuǎn)送到其基因可被表達的核中去。實施例2I愈傷組織轉(zhuǎn)化經(jīng)選擇的三葉橡膠屬栽培品種的雄性花用Chlorox(5.25％a.i.次氯酸鈉)消毒5分鐘，接著用無菌蒸餾水洗滌幾次?；ㄋ帍男廴镏鶢钗锴邢虏⒔臃N到MB培養(yǎng)基(20花藥/陪氏盤)中。培養(yǎng)物在25℃下避光培養(yǎng)。經(jīng)土壤桿菌屬微生物遺傳轉(zhuǎn)化4周齡的三葉橡膠屬植物花藥愈傷組織用帶有葡萄糖苷酸酶和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的根瘤病土壤桿菌感染。后者具有對抗生素卡那霉素的抗性。愈傷組織浸在根瘤病土壤桿菌的經(jīng)一夜培養(yǎng)的PH值為5.8的懸浮物中1分鐘，用含有7％蔗糖但沒有補充激素的MB培養(yǎng)基稀釋，以給出最終估計為3.7×108細胞/ml的細菌密度。菌群密度的估計通過測定培養(yǎng)一夜的培養(yǎng)物對在600nm的吸收來進行。過量的細菌懸浮物用無菌Whatman1號濾紙從愈傷組織吸收，該濾紙轉(zhuǎn)移到佩德里平碟供2天的共培植。將上述愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有抗生素氨噻頭孢菌素(250ug/ml)和鐵卡霉素(500ug/ml)的MB培養(yǎng)基中以殺滅其中土壤桿菌屬微生物。一周以后，上述愈傷組織置于選擇性平碟MB，Km100ug/ml)上，但仍保留氨噻頭孢菌素和鐵卡霉素。在一周間隙的后續(xù)繼代培養(yǎng)中，氨噻頭孢菌素和鐵卡霉素的濃度逐漸減低。II.轉(zhuǎn)化小植株的再生上述愈傷組織培養(yǎng)物置入MB培養(yǎng)基中并培養(yǎng)一周，然后每7天再移于到新鮮培養(yǎng)基(MB)中，3周后，培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到選擇分化培養(yǎng)基上。這一階段持續(xù)約2個月，其中包括30天后轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中。培養(yǎng)物再在25℃避光培養(yǎng)。起始培養(yǎng)基(MB)和分化培養(yǎng)基兩者均含有硫酸卡那霉素(100ug/ml)以選擇轉(zhuǎn)化過的細胞。在分化培養(yǎng)基中大約60天后，發(fā)育的胚狀體轉(zhuǎn)移至發(fā)育培養(yǎng)基中以形成莖干和根。該小植株種植在土壤中，然后養(yǎng)護至成熟。在用土壤桿菌屬微生物媒介插入GUS基因后，Heveabrasiliensis小植株成功地再生，該小植株表現(xiàn)得正常，且葉子的樣品經(jīng)用X-gluc處理后染成蘭色，表明GUS基因的表達。當(dāng)用X-gluc進行相似的處理時，從體外培養(yǎng)的未轉(zhuǎn)化過的三葉橡膠屬植物得來的葉子樣品不被染色。這些結(jié)果示于附圖8中。實施例3除了以如下的吸入方法，而不用土壤桿菌屬微生物載體系統(tǒng)完成遺傳轉(zhuǎn)化外，基本上按照實施例2的方法。4周齡的三葉橡膠屬花藥愈傷組織以將該組織置于37℃恒溫箱中30分鐘的方法脫水，該愈傷組織在含有編碼葡萄糖苷酸酶基因的DNA溶液(在無菌水中的100ugpBI221.1DNA)中吸漲30分鐘。該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到MB培養(yǎng)基中，接著轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中，然而與實施例2不同，培養(yǎng)基中不包含硫酸卡那霉素。參考文獻ChenZ(1984).-Rubber(Hevea)InSharpWR.EvansDA，AmmiratoPVandYamadhY(cds).Handbookofplantcellculture，Vol2Cropspecies，Macrnillan，NewYork:54(，571.DaytonWH，RichardBMandScottAM(1992).ExpressionofforeigngenesintransgenicYellow-PoplarPlants.PlantPhysiol.98114-120DraperD，ScottR.ArmitagePandWaldenR(1988).InPlantGeneticTransformationandGeneExpression-ALaboratoryManual.FinerJJandMcMullenMD(1990).Transformationofcotton(GossyDiumhirsutumL)vi2particlebombardment.PlantCellRep.8586-589.Gordon-KammWJ，SpencerTM，ManganoML.AdamsTR.DainesRJ，StartWG.OBrienJV，ChambersSA，AdamsWR，WilletsNG，RiceTB，MackeyCJ，KruegerRW.KauschAPandLemauxPG(1990).TransformationofmaizecellsandregeneuationoffertiletransgenicPlants.PlantCell2603-618.GormonCM，MoffatLFandHowardBH(1982).Mol.Cell.Biol.21044-1051.HamillJD.RounsleyS.SpencerA.ToddGandRhodesMJC(1991).Theuseofpolymerasechainreactioninplanttransformationstudies.PlantCellReports10221-224HarrisRR，DeRobertisGA.PierceDA，MoynihanMRandEvereitNP(1990).Heterogeneityofx-glucstainingintransgenicmaizecallus(abstract).InVitroCellDev.Biol.26(partII)69.JcffersonRA(1987).AssayingchimaericgenesinplantsTheGUSgenefusionsystem.PlantMolecBiol.Reporter5389-405.JeffersonRA，BurgessSMandHirshD(1986).BetaglucuronidasefromE.coliasagencfusionmarker.Proc.Natl.Acad.Sci.USA868447-8451.JeffersonRA，KavanagbTAandBevanMW(1987).GISfusionsbetaglucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplants.EMBOJ63901-3902.KleinTM，F(xiàn)rommME，WeissingerA，TomesD，SchaafS，SiettenMandSanfordJC(1987).Transferofforeigngenesintointactmaizecellswithhigh-velocitymicroprojectiles.Proc.Natl.Acad.Sci.854305-4309.KleinTM，GradzielT，F(xiàn)rommMEandSanfordJC(1988).FactorinfluencinggenedeliveryintoZeamayscellsbyhigh-velocitymicroprojectile.Bio/technology6559-573.KleinTM，KornsteinL，SanfordJCandFrommME(1989).GenetictransformationofmaizeccllsbyparticlebombardmentPlantPhysiol.91404-444.McMullenMDandFinerJJ(1990).Stabletransfornationofcottonandsoybeanembryogenicculturesviamicroprojectilebombardmeut(abstract).J.CellBiochem14E285.Mei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