專利名稱：一種液體發(fā)酵生產(chǎn)富含鍺的靈芝菌絲體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物液體發(fā)酵領(lǐng)域。
微量元素鍺(Ge)對人體健康影響極大。無機(jī)鍺是很難被人直接利用和吸收的，只有存在于靈芝、人參、枸杞子等生物有機(jī)體中的鍺才能很好地被人吸收利用。但上述生物有機(jī)體中鍺的含量有限，且上述生物有機(jī)體的栽培比較麻煩，生長周期也較長，不適合于工業(yè)化大生產(chǎn)。而目前利用液體發(fā)酵(又稱液體培養(yǎng)、深層發(fā)酵和深層培養(yǎng))大量培養(yǎng)大型真菌的菌絲體工藝已很成熟。(中國專利CN 1034957A)這使迅速、經(jīng)濟(jì)地獲得大量富含鍺的有機(jī)體細(xì)胞成為可能。
本發(fā)明的目的就是利用液體發(fā)酵方法大量繁殖某些能吸收、富集鍺元素，并為人體所食用的生物有機(jī)體細(xì)胞，如靈芝菌絲體，以解決人類食物結(jié)構(gòu)中鍺元素?cái)z入不足的問題。
本發(fā)明所采用的工藝步驟如下一、發(fā)酵菌種的選擇已知一些名貴中藥材如靈芝子實(shí)體、人參、枸杞子等的細(xì)胞中都含有一定數(shù)量的鍺。這表明它們的細(xì)胞具有從環(huán)境中吸收、富集鍺的能力。通過測定又得知這幾種藥材中以靈芝含鍺量最高(是人參的3-6倍)，說明靈芝細(xì)胞吸收鍺的能力相對較強(qiáng)。另外靈芝屬微生物中的大型真菌，它的菌絲體是可以通過液體發(fā)酵繁殖的，便于工業(yè)化大生產(chǎn)，因此我們選擇了靈芝屬的菌株作為發(fā)酵菌種。
二、鍺源的選擇、發(fā)酵培養(yǎng)基中鍺元素的加入量及鍺的測定1.鍺源的選擇單質(zhì)鍺(鍺粉或鍺塊)或鍺的化合物(如鍺的氧化物及鍺鹽、鍺酸)，只要能直接溶于水或經(jīng)過氧化劑或酸、堿處理后能溶于水的，都可選作為鍺源。
如鍺粉不溶于水，可用10%的過氧化氫在pH7-8的條件下促使其溶于水。
又如，二氧化鍺有一定的溶解度，可直接溶于水形成一定濃度的溶液。也可用0.5～5.0N的氫氧化鈉溶液溶解，或用1N的硫酸、酒石酸、草酸溶液溶解后配成一定濃度的溶液。
2.發(fā)酵培養(yǎng)基中鍺元素的加入量根據(jù)含鍺溶液鍺元素的濃度，取一定體積的溶液，加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，使發(fā)酵培養(yǎng)基中按重量計(jì)鍺元素的濃度為8ppm-12ppm。
3.鍺的測定采用日本島津AA-670型原子吸收儀石墨爐原子吸收法測定。
三、液體發(fā)酵操作步驟如下a.菌種活化將冷藏的菌種接種到斜面培養(yǎng)基上，于24-28℃溫箱中培養(yǎng)活化7-10天，直到斜面長滿菌絲為止。
要求斜面培養(yǎng)基中應(yīng)含有適合靈芝菌絲體利用的碳源(如葡萄糖、蔗糖、淀粉、麥夫皮等)、氮源(如豆餅、蛋白胨、麥夫皮、銨鹽等)、維生素(如酵母膏、VB1)、鉀和磷等。
b.一級搖瓶培養(yǎng)(500ml)在500ml的三角瓶中裝入100ml搖瓶培養(yǎng)基，滅菌后，冷卻至室溫，在無菌條件下移入斜面菌種，于24°-28℃搖床培養(yǎng)7-10天，搖床為往復(fù)式，每分鐘振動(dòng)100-200次。搖瓶培養(yǎng)基成份要求含有碳源(如葡萄糖、蔗糖、麥夫皮、馬鈴薯浸出液等)、氮源(如豆餅粉、麥夫皮浸出液、銨鹽等)、鉀離子及維生素(如VB1等)，PH6.0-6.5。
c.二級搖瓶培養(yǎng)(500ml)在5000ml的三角瓶中裝入1000-1500ml培養(yǎng)基(成份同“b”)，滅菌，接入“b”培養(yǎng)物，然后于24°-28℃搖床培養(yǎng)2-3天。
d.一級種子罐培養(yǎng)菌種(50L)在50L不銹鋼種子罐中注入30-35L培養(yǎng)基(成份同“b”)，實(shí)罐消毒后冷卻至24°-28℃，利用壓差法接入“c”培養(yǎng)物，然后通元菌空氣(通氣量為1∶0.3～0.6)，培養(yǎng)溫度為24°-28℃，攪拌轉(zhuǎn)速100-200r.p.m，培養(yǎng)2天。
e.二級種子罐進(jìn)一步增殖菌種(500L)在500L罐中裝入300L-350L培養(yǎng)基(成份同“b”)，實(shí)罐消毒后冷卻至24°-28℃，然后將一級種子罐培養(yǎng)物壓入罐中，隨后進(jìn)行通氣培養(yǎng)。通氣比為1∶0.3-0.6，攪拌速度100-200r.p.m，溫度為24°-28℃，時(shí)間為2天。
f.5000L發(fā)酵罐大量培養(yǎng)富鍺菌絲體發(fā)酵罐容積5000L，裝料3000-3500L，培養(yǎng)基中碳源盡可能采用廉價(jià)原料，如淀粉、麥夫皮等，其它成份同“b”，PH6.0～6.5。實(shí)罐消毒后冷卻至24°-28℃，然后從接種口以無菌操作注入含鍺元素的溶液，使鍺在發(fā)酵液總量中濃度達(dá)8-12p.p.m，開動(dòng)攪拌幾分鐘，取樣檢查PH值，用稀硫酸或稀氫氧化鈉溶液將PH值調(diào)到6.0-6.5，然后用無菌壓縮空氣將“e”培養(yǎng)物壓入發(fā)酵罐，接著進(jìn)行通氣培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度、攪拌速度、通氣比、發(fā)酵時(shí)間均同“e”。
g.菌絲體的收集與處理發(fā)酵醪用離心或板框壓濾的方法收集菌絲體，并用無離子水洗去菌絲體表面吸附的無機(jī)鍺，然后使菌絲于50°-70℃烘干，并粉碎到一定粒度(可過80-200目的銅篩網(wǎng))。所得粉末即為含鍺量達(dá)3000ppm以上的菌絲體。該產(chǎn)物可直接用作保健食品的添加劑。
本發(fā)明由于采用了適于工業(yè)化大生產(chǎn)的工藝路線，簡單地將無機(jī)鍺溶液加入到靈芝菌絲體的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基廉價(jià)易得，經(jīng)過培養(yǎng)可迅速得到大量富含有機(jī)鍺的靈芝菌絲體，并能為人食用。這與天然中草藥靈芝子實(shí)體、人參、枸杞子相比，不僅在有機(jī)鍺含量上還是在生產(chǎn)周期上皆具有明顯優(yōu)勢。從而為人類更經(jīng)濟(jì)、迅速地獲得富含鍺的營養(yǎng)保健品提供了可能。
下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步說明本發(fā)明方法的技術(shù)與步驟。
實(shí)施例1一、菌種的選擇以大型真菌中靈芝屬(Ganoderma)的靈芝種(G、lucidum)作為發(fā)酵菌株。
二、鍺溶液的配制及發(fā)酵液中鍺的含量選鍺粉為鍺源，按發(fā)酵液總體積3500L，鍺濃度10ppm計(jì)，稱出需加入鍺粉的重量35克，用足量的10%過氧化氫溶解后，全部按步驟加入到5000L發(fā)酵罐中。
三、液體發(fā)酵的步驟a.菌種活化將冷藏的靈芝種菌株接于試管斜面培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)10天，至斜面長滿菌絲，待用。
斜面培養(yǎng)基成份葡萄糖2%，酵母膏0.2%，蛋白胨0.2%，KH2PO40.1%，瓊脂2%，其余為自來水，PH自然。
b.在500ml的三角瓶中裝入100ml搖瓶培養(yǎng)基(其成份為葡萄糖2%，麥夫皮浸出液10%，硫酸銨0.2%，KH2PO40.2%，PH6.3)。滅菌后冷卻至室溫，在無菌操作下接入斜面菌種。置于往復(fù)式搖床上以每分鐘振動(dòng)150次的頻率在26℃下培養(yǎng)8天。
c.在5000ml三角瓶中裝入1500ml搖瓶培養(yǎng)基(成份同實(shí)施例1中“b”)，滅菌冷卻后，在無菌室中接入上一步培養(yǎng)的菌液，然后在26℃于150p.p.m的往復(fù)式搖床上培養(yǎng)3天。
d.往50L不銹鋼一級種子罐中注入35L種子罐培養(yǎng)基(成份同實(shí)施例1中“b”)，實(shí)罐消毒后冷卻至26℃，利用壓差法接入前一步“c”的培養(yǎng)物，然后通入無菌空氣，通氣比是1∶0.5，攪拌轉(zhuǎn)速150r.p.m，26℃下培養(yǎng)2天。
e.在500L二級種子罐中，裝料350L(成份同實(shí)施例1中“b”)，實(shí)罐消毒后，冷卻至26℃，然后用無菌空氣將一級種子罐培養(yǎng)物壓入，通無菌空氣培養(yǎng)，通氣比為1∶0.5，溫度26℃，攪拌速度150r.p.m，時(shí)間2天。
f.在5000L發(fā)酵罐中裝入3500L發(fā)酵培養(yǎng)基(其成份為葡萄糖1.5%，麥夫皮浸出液10%，紅薯粉0.5%，KH2PO40.2%，(NH4)2SO40.2%，PH6.5)，實(shí)罐消毒后冷卻至26℃，然后從接種口以無菌操作注入該實(shí)施例配制的含鍺溶液，使發(fā)酵培養(yǎng)基總量中鍺含量達(dá)10p.p.m。開動(dòng)攪拌幾分鐘，取樣測PH為7.1，用0.05N硫酸溶液調(diào)至PH6.5，然后用無菌空氣將二級種子罐中培養(yǎng)物壓入，并進(jìn)行通氣培養(yǎng)，溫度始終保持26℃，攪拌轉(zhuǎn)速150r.p.m，通氣比1∶0.5，培養(yǎng)2天。
g.將發(fā)酵醪泵入板框壓濾機(jī)過濾除去水份，過濾完畢后再泵入少量70℃無離子水洗滌菌絲，當(dāng)流出液中檢查不出鍺元素以后停止洗滌，用無菌壓縮空氣吹干濾餅，拆開板框收集濾餅，攤在搪瓷盤中用遠(yuǎn)紅外線加熱干燥，待水分降至5%以下停止加熱。收集干菌絲，得到本發(fā)明方法生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)品，含鍺3000ppm以上的靈芝菌絲體。將此干菌絲用粉碎機(jī)粉碎，過120目篩網(wǎng)，網(wǎng)下粉末可作為保健食品添加劑。
實(shí)施例2除采用的鍺源和菌種不同外，其余皆同實(shí)施例1。
該實(shí)施例采用靈芝屬中的紫芝(G·joponicum)，鍺源用二氧化鍺。由于二氧化鍺在水中有一定的溶解度，所以可以固體形態(tài)直接投入發(fā)酵罐中。
權(quán)利要求
1.一種液體發(fā)酵生產(chǎn)富含鍺的靈芝菌絲體的方法，該方法采用了擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)、多孔菌科(Polyporaceae)、靈芝屬(Ganoderma)的菌種為發(fā)酵菌株，采取菌種由斜面到三角瓶到種子罐到發(fā)酵罐逐級擴(kuò)大培養(yǎng)的工藝步驟，實(shí)現(xiàn)靈芝菌絲體的大量增殖，本方法的特征在于在發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了含鍺元素的溶液，鍺在培養(yǎng)基總量中的濃度按重量計(jì)為8ppm～12ppm。
2.按1所述的靈芝屬的菌種，是靈芝種(G·lucidum)。
3.按1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了含鍺元素的溶液，鍺在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度按重量計(jì)為10ppm。
4.按1所述的含鍺元素的溶液是由單質(zhì)鍺或鍺的化合物直接溶于水配制而成，或者是經(jīng)過氧化劑處理、酸處理、堿處理后溶于水配制而成。
5.按4所述的單質(zhì)鍺為鍺粉。
6.按4所述的鍺的化合物為二氧化鍺。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用液體發(fā)酵生產(chǎn)富含鍺的靈芝菌絲體的方法。它采用吸收富集鍺能力較強(qiáng)的靈芝屬的菌種作發(fā)酵菌株，通過逐級擴(kuò)大培養(yǎng)，大量增殖靈芝菌絲體。由于在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了8～12ppm(按重量計(jì))的鍺，從而獲得了富含鍺的發(fā)酵產(chǎn)物——靈芝菌絲體。該發(fā)酵產(chǎn)品可直接用作保健食品的添加劑，也可提取出有效成分使用。
文檔編號A01G1/04GK1073572SQ9210637
公開日1993年6月30日 申請日期1992年1月17日 優(yōu)先權(quán)日1992年1月17日
發(fā)明者王玉萍, 王立民 申請人:山東大學(xué)