專利名稱：減少水培中細(xì)菌沾染的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過用殺菌劑處理活的飼用生物體來減少水培中加入這些生物體引起的細(xì)菌沾染的方法。
在實(shí)踐中，使用例如輪蟲和隨后的鹵蟲幼體作為供水培的活的飼用生物體，更具體地說作為早期海生幼蟲飼養(yǎng)中的活的飼料。已經(jīng)知道在實(shí)踐中這些鹵蟲幼體尤其被孵化過程中繁殖旺盛的細(xì)菌嚴(yán)重沾染，可達(dá)大于107/g濕重的量。由于這種細(xì)菌菌群主要由弧菌屬的種(潛在的魚/蝦病原體)組成，可以認(rèn)為鹵蟲幼體是可能的病原菌攜帶者，這種細(xì)菌在幼蟲培養(yǎng)中，尤其當(dāng)幼蟲受脅迫時能引起疾病/死亡爆發(fā)。
進(jìn)行了某些研究以使用化療劑(尤其是使用抗生素)減少細(xì)菌的荷載。然而，由于細(xì)菌抗性的危險(xiǎn)性，應(yīng)該避免使用抗生素。另一方面，發(fā)現(xiàn)其它廣譜化療劑(如作為例子的二氧化氯)對活的飼用生物體自身十分有害。
因此本發(fā)明的目的是提供一種新的方法，其中的細(xì)菌沾染可被有效地減少而不抑制飼用生物體的生長。
由此，按照本發(fā)明的方法的特征在于所說的飼用生物體用殺菌的異噻唑啉衍生物處理。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用殺菌的異噻唑啉衍生物可使細(xì)菌(尤其是弧菌)的數(shù)目顯著地減少而對飼用生物體無副作用。
已知預(yù)期使用的異噻唑啉衍生物原來已作為抗生劑用于例如啤酒廠滅菌輸送管道等。關(guān)于包含在此類殺菌的異噻唑啉衍生物內(nèi)的化合物，參照GB-A-1,224,661；US-A-3,523,121；US-3,761,488和US-A-4,150,026(這些文獻(xiàn)包含的本文中作為參考文獻(xiàn))。
異噻唑啉衍生物優(yōu)選的是4-異噻唑啉-3-酮衍生物。
本發(fā)明還涉及用殺菌劑處理的供水培的活的飼用生物體的孢囊。按照本發(fā)明，所說的孢囊(尤其是鹵蟲孢囊)用殺菌的異噻唑啉衍生物包裹。
本發(fā)明也涉及制備供水培的活的飼用生物體的富集培養(yǎng)基的富集產(chǎn)物。這種富集產(chǎn)物的特征在于它包含有效劑量的殺菌的異噻唑啉衍生物，這種劑量的衍生物可減少在所說的富集培養(yǎng)基中細(xì)菌的生長。
從下列按照本發(fā)明的方法、孢囊和富集產(chǎn)物的某些具體實(shí)施方案的描述，會明顯看出本發(fā)明的另外的優(yōu)點(diǎn)和特征。
按照本發(fā)明的方法預(yù)期通過減少與活的飼用生物體有關(guān)的細(xì)菌數(shù)量來抑制水培中的細(xì)菌沾染。這些活的飼用生物體如輪蟲和鹵蟲，但其它的活的飼用生物體也可考慮在內(nèi)。在下面部分中，尤其涉及鹵蟲?；畹娘曈蒙矬w可以用于各種水培，尤其用于甲殼綱、軟體動物門和魚類的培養(yǎng)。
按照本發(fā)明，活的飼用生物體用殺菌的異噻唑啉衍生物處理。這些異噻唑啉衍生物先前是已知的。為了本發(fā)明特定的應(yīng)用，應(yīng)基于抗與活的飼用生物體有關(guān)的細(xì)菌以及它們對活的飼用生物體的可能作用進(jìn)行選擇。
殺菌的異噻唑啉衍生物的優(yōu)選類型是4-異噻唑啉-3-酮衍生物。尤其優(yōu)選的是5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮，2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮或這兩種化合物的組合。異噻唑啉衍生物也可以以如US-A-4,150,026中所述的金屬鹽復(fù)合物使用。
當(dāng)鹵蟲用作供水培的活的飼用生物體時是作為孢囊出售的。這些孢囊在孵化培養(yǎng)基中孵化，如在海水中28℃下孵化約24小時，通常在隨后在富集培養(yǎng)基中進(jìn)一步用維生素、脂肪酸等富集，也進(jìn)行大約24小時。然后富集的鹵蟲幼體能夠用作供水培的活的生物體。
在按照本發(fā)明的具體實(shí)施方案的方法中，把有效濃度的異噻唑啉衍生物加入生長培養(yǎng)基(即孵化培養(yǎng)基中)中和在將此衍生物用于富集培養(yǎng)基中時，能夠減少其中細(xì)菌的生長。事實(shí)上，已經(jīng)觀察到細(xì)菌(包括可能的病原菌，如弧菌屬的種)在這些培養(yǎng)基中生長得很好。
為抑制孵化培養(yǎng)基中的細(xì)菌沾染，可以直接向其中加入殺菌的異噻唑啉衍生物。
然而，在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，異噻唑啉衍生物粘附到鹵蟲孢囊上，其數(shù)量達(dá)到孵化培養(yǎng)基中所需的有效濃度。在這方面，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用這種滅菌過程的孢囊可以保存幾個月而對孵化效率和抗菌活性無任何副作用。
為抑制富集培養(yǎng)基中的細(xì)菌沾染，如果使用這種培養(yǎng)基，最好首先洗滌活的飼用生物體。按照本發(fā)明，也以減少其中細(xì)菌生長有效的量進(jìn)一步把殺菌的異噻唑啉衍生物加入到富集培養(yǎng)基中。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，殺菌異噻唑啉衍生物包含在制備富集培養(yǎng)基的富集產(chǎn)物中。這類富集產(chǎn)物包含如維生素和脂肪酸，尤其是濃縮的乳劑形式。它的一個例子是來自比利時鹵蟲系統(tǒng)S.A.的商品富集乳劑SuperSelco。
在兩種生長培養(yǎng)基(即孵化培養(yǎng)基和富集培養(yǎng)基)中，優(yōu)選地加入異噻唑啉衍生物直到濃度達(dá)到1-7ppm。這種濃度更優(yōu)選的是1.5-4ppm，使用約2ppm的濃度可獲得良好的結(jié)果。然而對于輪蟲，使用更低的濃度可能是必需的。
下列實(shí)施例證明了通過按照本發(fā)明的方法(尤其是使用按照本發(fā)明的孢囊和富集產(chǎn)物)所獲得的對活的飼用生物體的細(xì)菌沾染的作用。
實(shí)施例1000g的鹵蟲孢囊(GSL-菌株)用7.5g從S.A.SOPURA N.V.買到的Pastosept包裹，Pastosept包含5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(10.4％)和2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(3.5％)。孢囊干燥到5-8％的濕度含量后，真空包裹，在4℃下保存。一批相同的孢囊作為對照。
在不同的時間間隔，即分別在2、4、8和12周后，處理的和對照的孢囊都在標(biāo)準(zhǔn)的條件下孵化，即在28℃下海水中孵化24小時。更具體地說，把2g孢囊加到1升海水中。24小時后收獲幼體，用孵化培養(yǎng)基的樣品和提取漂洗的幼體測定海瓊脂(MA，Difco)上的總量和TCBS(Oxoid)上的弧菌屬種的量。同時測定孵化效率(幼體的數(shù)目/g)。
為試驗(yàn)富集過程中的抗菌活性，滅菌組和對照組的孵化幼體轉(zhuǎn)移到富集箱中，用商品富集乳劑SuperSelco(比利時鹵蟲系統(tǒng)S.A.)富集。處理的Selco包含30g/l Pastosept，稀釋2000倍得到富集培養(yǎng)基。24小時后，漂洗幼體并取樣進(jìn)行細(xì)菌學(xué)和脂類分析。
表1鹵蟲孢囊(對照和處理)溫育24小時后和用SuperSelco(對照和處理)富集24小時后MA1和TCBS2上的CFU/g或/ml數(shù)目
1海瓊脂-海細(xì)菌生長的普通培養(yǎng)基2TCBS-弧菌屬的一個種生長的特異性培養(yǎng)基3N＝以CUF/g幼體表示的數(shù)目4HW＝以CUF/ml孵化水表示的數(shù)目5EW＝以CUF/ml富集水表示的數(shù)目接受滅菌過程的鹵蟲孢囊孵化成與對照幼體比較沾染較少的幼體中。24小時后，對照幼體包含多達(dá)106-107個細(xì)菌/g，而在滅菌的幼體中總數(shù)目減少到103-104個細(xì)菌/g?；【鷮俚姆N的減少甚至更劇烈(表1)。
這種不同在孵化水中是也是清晰可見的孵化24小時后，由于細(xì)菌的生長孵化水有一定的濁度，進(jìn)行滅菌后水完全澄清。
當(dāng)考慮細(xì)菌數(shù)量的變化是時間的函數(shù)時，很明顯，在4℃下3個月的貯存期數(shù)目沒有發(fā)生大的變化。如在


圖1中看到的，那段時期后抗菌活性仍存在。此圖顯示了細(xì)菌數(shù)目的變化作為4℃下處理和保存期的函數(shù)。對照和滅菌的孢囊之間在孵化效率上沒有明顯的差別。當(dāng)富集過程中也應(yīng)用滅菌處理時，可觀察到類似的細(xì)菌數(shù)目的減少。富集24小時后，在幼體上仍有100到1000倍的減少(表1)。這導(dǎo)致更“干凈者”富集而在箱壁上沒有粘液形成。
脂類分析表明在處理的和對照的鹵蟲中，高級不飽和脂肪酸的富集水平是相同的。從本實(shí)施例可以得出在鹵蟲孵化和富集過程中滅菌操作的使用導(dǎo)致幼體的細(xì)菌沾染(尤其弧菌屬的種)顯著減少。這意味著潛在的魚類病原體通過活的飼料轉(zhuǎn)移到捕食者的機(jī)會也減少。
接受滅菌操作的孢囊可以保存幾個月而對孵化效率和抗菌活性無任何副作用。
在以前的用海鱸幼蟲的飼喂實(shí)驗(yàn)中，飼喂滅菌的鹵蟲的效果使用存活、生長和脅迫抗性作為標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)。沒有表現(xiàn)出副作用。
很清楚，本發(fā)明并不限于以上所述的實(shí)施方案，而是可以使用一些在本發(fā)明范圍內(nèi)的改良方法。
就此而言，應(yīng)該注意到，在某些情況中優(yōu)選的是只向富集培養(yǎng)基加入殺菌的異噻唑啉衍生物，而不用它包裹鹵蟲孢囊。
權(quán)利要求
1.一種通過用殺菌劑處理活的飼用生物體來減少由于在水培中加入該生物體引起的細(xì)菌沾染的方法，其特征在于用殺菌的異噻唑啉衍生物處理所說的活的飼用生物體。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于在所說的活的飼用生物體加入所說的水培中之前，在生長培養(yǎng)基中，在減少其中細(xì)菌生長有效濃度的所說殺菌異噻唑啉衍生物存在下培養(yǎng)該生物體。
3.按照權(quán)利要求2的方法，其特征在于在加入了所說的殺菌的異噻唑啉衍生物的孵化培養(yǎng)基中從孢囊培養(yǎng)所說的活的飼用生物體。
4.按照權(quán)利要求3的方法，其特征在于以達(dá)到孵化培養(yǎng)基中所說的有效劑量的量將所說的異噻唑啉衍生物粘附到所說的孢囊上。
5.按照權(quán)利要求2或3的方法，其特征在于所說的有效劑量在1至7ppm之間，優(yōu)選地在1.5至4ppm之間，更具體地說是大約2ppm。
6.按照權(quán)利要求2到5任一之方法，其特征在于將所說的活的飼用生物體在富集培養(yǎng)基中進(jìn)一步富集，在此培養(yǎng)基中以減少其中細(xì)菌生長有效的量加入所說的殺菌的異噻唑啉衍生物。
7.按照權(quán)利要求6的方法，其特征在于將殺菌的異噻唑啉衍生物包含在用于制備所說的富集培養(yǎng)基的富集產(chǎn)物中。
8.按照權(quán)利要求1至7任一之方法，其特征在于所說的異噻唑啉衍生物是4-異噻唑啉-3-酮的衍生物。
9.按照權(quán)利要求8的方法，其特征在于所說的異噻唑啉衍生物包括5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮和/或2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮。
10.用殺菌劑處理的供水培的活的生物體的孢囊，其特征在于所說的孢囊用殺菌的異噻唑啉衍生物包裹。
11.按照權(quán)利要求10的胞囊，其特征在于所說的孢囊是鹵蟲孢囊。
12.按照權(quán)利要求10或11的孢囊，其特征在于所說的孢囊用有效量的所說異噻唑啉衍生物包裹，以在孵化培養(yǎng)基中達(dá)到所述衍生物的減少其中細(xì)菌生長的有效濃度。
13.用于制備供水培的活的飼用生物體的富集培養(yǎng)基的富集產(chǎn)物，其特征在于所說的富集產(chǎn)物包含減少所說富集培養(yǎng)基中細(xì)菌生長有效量的殺菌的異噻唑啉衍生物。
全文摘要
在按照本發(fā)明的方法中，用殺菌的異噻唑啉衍生物處理供水培的活的飼用生物體(如輪蟲，尤其是鹵蟲)以減少細(xì)菌沾染。所述異噻唑啉衍生物優(yōu)選的是4-異噻唑啉-3-酮衍生物，尤其是5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮和/或2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮衍生物。這類衍生物可以加到活的生物體的生長培養(yǎng)基中或包裹在生物體的孢囊上和/或包含在制備富集培養(yǎng)基的富集產(chǎn)物中。本發(fā)明也涉及用所述殺菌的異噻唑啉衍生物包裹的活的飼用生物體的孢囊和包含這類衍生物的富集產(chǎn)物。
文檔編號A23K1/18GK1164176SQ95196358
公開日1997年11月5日 申請日期1995年10月20日 優(yōu)先權(quán)日1994年10月21日
發(fā)明者M·德哈斯魁, B·德維里瑟, P·里格爾, P·索格洛斯 申請人:英弗水培公司