專(zhuān)利名稱(chēng)：血紅蛋白的純化方法
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)是1998年7月10號(hào)提交的申請(qǐng)U.S.S.N 09/113,953的繼續(xù)申請(qǐng)，申請(qǐng)U.S.S.N 09/113,953是1995年6月7日提交的申請(qǐng)U.S.S.N 08/473,497的部分繼續(xù)申請(qǐng)，申請(qǐng)U.S.S.N 08/473,497是1995年6月2日提交的申請(qǐng)U.S.S.N 08/458,916的部分繼續(xù)申請(qǐng)，申請(qǐng)U.S.S.N 08/458,916是1995年3月23日提交的申請(qǐng)U.S.S.N08/409,337的繼續(xù)申請(qǐng)，這些申請(qǐng)的教導(dǎo)通過(guò)在此引述而合并于本文。
人血紅蛋白，作為一種血液替代物，具有滲透活性和運(yùn)輸和傳遞氧的能力，但它具有通過(guò)腎路線和經(jīng)過(guò)血管壁的循環(huán)中迅速消除的缺點(diǎn)，導(dǎo)致一種很短的，因此，典型地不令人滿(mǎn)意的半衰期。進(jìn)一步地，人血紅蛋白也常常被有毒水平的內(nèi)毒素、細(xì)菌和/或病毒污染。
非人類(lèi)血紅蛋白也具有如人血紅蛋白同樣的缺陷。此外，源于非人類(lèi)來(lái)源的血紅蛋白也常常被蛋白質(zhì)，例如抗體污染，抗體能引起接受者免疫系統(tǒng)反應(yīng)。
先前，已經(jīng)采用了至少四種其它類(lèi)型的血液代用品，包括全氟化化合物、合成血色素類(lèi)似物、脂質(zhì)—膠囊化血色素，和化學(xué)改性的血色素。然而，這些血液代用品中的許多常常具有短的血管內(nèi)保留時(shí)間，被循環(huán)系統(tǒng)作為外來(lái)物質(zhì)清除，或者貯存在肝臟、脾臟和其它器官。許多這些血液代用品都在生物學(xué)上不相容于生物系統(tǒng)。
在一項(xiàng)實(shí)施方案中，這種方法包括血紅蛋白溶液裝上陰離子交換色譜柱。將至少一種三(羥基甲基)氨基甲烷丙酮緩沖液注入該柱，該緩沖溶液pH低于柱的pH，由此純化的血紅蛋白產(chǎn)物自該柱洗脫。
在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，將血紅蛋白溶液裝上陰離子交換色譜柱。該色譜柱初始飽和至pH大于8.7，至少一種緩沖鹽溶液注入該柱，該緩沖鹽溶液pH小于8.6，由此純化的血紅蛋白產(chǎn)物自該柱洗脫。
在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，將血紅蛋白溶液上陰離子交換色譜柱。然后，將至少十一柱體積的pH范圍大約在8.2和8.6之間的飽和緩沖溶液注入該柱。接著將一種pH低于飽和緩沖溶液pH的緩沖溶液注入該柱，由此純化的血紅蛋白產(chǎn)物自該柱洗脫。
在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，將血紅蛋白溶液上陰離子交換色譜柱，該色譜柱pH開(kāi)始校準(zhǔn)至大于大約8.7。然后，將至少十一柱體積的pH范圍大約在8.2和8.6之間的三(羥基甲基)氨基甲烷醋酸鹽飽和緩沖溶液注入該柱。接著將pH低于大約8.2的三(羥基甲基)氨基甲烷醋酸鹽緩沖溶液注入該柱，由此純化的血紅蛋白產(chǎn)物自該柱洗脫。
本發(fā)明的方法有益于獲得基本上不含有如碳酸酐酶的頑固蛋白質(zhì)材料的血紅蛋白產(chǎn)品。本方法也可以從含有許多雜質(zhì)的溶液中獲得相對(duì)高收率的血紅蛋白。因而，自一種物種中提取的血紅蛋白可以作為血液代用品成功地用于各種物種中，而且受體不會(huì)感受明顯副作用。本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的方法的特征和其它的細(xì)節(jié)將參照附圖
給予更為具體的描述并在權(quán)利要求中指出。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的具體實(shí)施方案是以說(shuō)明性給出的，它們不是對(duì)本發(fā)明的限制。本發(fā)明的原則特征在不背離本發(fā)明范圍的情況下可以應(yīng)用于各種實(shí)施方案中。
本發(fā)明涉及到采用色譜柱制備基本不含有其它血液蛋白成分和雜質(zhì)的純化血紅蛋白產(chǎn)品的方法。該方法的特征在于采用pH梯度以洗脫血紅蛋白成分。
從紅細(xì)胞的破壞、分段和/或超濾得到的濃縮的Hb溶液，導(dǎo)入一個(gè)或更多個(gè)平行的色譜柱中以通過(guò)高性能液體色譜進(jìn)一步使血紅蛋白和其它雜質(zhì)離析，例如抗體、內(nèi)毒素、磷脂、酶(例如碳酸酐酶)、病毒和可傳播的海綿狀的腦病介質(zhì)。該色譜柱含有一種適合于從非血紅蛋白蛋白質(zhì)中分離Hb的陰離子交換介質(zhì)。適合的陰離子交換介質(zhì)包括，例如，硅膠、氧化鋁、二氧化鈦凝膠、交聯(lián)的葡聚糖、瓊脂糖或者衍生部分，例如聚丙烯酰胺、聚羥基—甲基丙烯酸或者苯乙烯二乙烯基苯離子交換樹(shù)脂，它衍生于陽(yáng)離子化學(xué)官能團(tuán)，例如二乙基乙胺或季乙胺基團(tuán)。用于選擇吸附和解吸Hb的適宜的陰離子交換介質(zhì)和相應(yīng)的洗脫劑，與其它的很可能是溶化的紅細(xì)胞相的蛋白質(zhì)和雜質(zhì)比較，是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能輕易確定的。
在一項(xiàng)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，采用這樣一種方法由硅膠制備陰離子交換介質(zhì)，該硅膠經(jīng)熱處理以增加孔徑，與γ-氧化環(huán)氧丙酸丙基硅烷接觸以形成活性環(huán)氧基團(tuán)，接著與C3H7(CH3)2NCl接觸以形成季氨離子交換介質(zhì)。色譜法周刊，120321-333(1976)描述了此方法，該文通過(guò)在此引述而全部合并于本文。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，色譜柱，或者各個(gè)色譜柱，初始飽和至pH大于8.7。優(yōu)選地，色譜柱pH飽和范圍在大約8.7和大約10.0之間。在一項(xiàng)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，pH飽和范圍在大約8.7和大約9.3之間，最優(yōu)選是范圍是大約8.9和大約9.1之間。優(yōu)選地，采用的開(kāi)始飽和色譜柱的緩沖液是三(羥基甲基)氨基甲烷醋酸鹽(三-醋酸鹽)，濃度是大約20毫摩爾/升(mM/l)。
血紅蛋白溶液，優(yōu)選地，已經(jīng)逆純水(U.S.P)透析，并且，優(yōu)選地，具有大約280μS/cm的導(dǎo)電性和大約6.75至大約7.75之間的pH，然后注入色譜柱介質(zhì)中，從而將血紅蛋白裝柱。裝柱的血紅蛋白溶液的濃度通常的范圍是大約90至大約200克/升之間。優(yōu)選地，血紅蛋白溶液的濃度范圍是大約90至大約110克/升之間。優(yōu)選地，在注入濃縮的Hb溶液后，色譜柱以三-醋酸鹽洗脫大約十分鐘(4柱體積)，以洗脫不能結(jié)合于介質(zhì)的非血紅蛋白成分，并促進(jìn)血紅蛋白與介質(zhì)更強(qiáng)的結(jié)合。
在色譜柱中采用梯度pH以由Hb中分離出蛋白質(zhì)雜質(zhì)，例如碳酸酐酶、磷酯、抗體和內(nèi)毒素。梯度pH可以是連續(xù)的梯度或者梯級(jí)的梯度。具有各種pH值的緩沖溶液隨后注入該柱以產(chǎn)生洗脫時(shí)間內(nèi)的pH梯度。優(yōu)選在注入之前過(guò)濾緩沖液，例如以合適的10,000道爾頓的去除熱原膜進(jìn)行過(guò)濾。緩沖液應(yīng)該是一價(jià)的緩沖鹽，它具有低離子強(qiáng)度以致于Hb和非血紅蛋白雜質(zhì)的洗脫主要依賴(lài)于pH而不是明顯依賴(lài)于離子強(qiáng)度。通常，大約50mM，或者更少離子濃度的緩沖鹽，具有低離子強(qiáng)度。
優(yōu)選地，通過(guò)以梯級(jí)梯度從色譜柱洗脫分離血紅蛋白溶液的雜質(zhì)和血紅蛋白，其中采用的緩沖劑pH在血紅蛋白上柱時(shí)的pH和血紅蛋白從柱中洗脫下來(lái)的最終pH之間。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，梯級(jí)梯度包括注入一種合適的緩沖溶液至柱中。該緩沖溶液pH低于血紅蛋白裝柱時(shí)初始的柱pH。該柱以緩沖溶液飽和。優(yōu)選地，至少大約六柱體積的緩沖溶液注入該柱中。這里定義的“柱體積”，是柱的體積，并不包括填充材料。通常，用于本發(fā)明的合適的填充材料，即交換介質(zhì)，引起大約0.525總柱體積的空隙度。六柱體積，因此，等于大約11.7“柱空隙體積”。一般地，至少11柱空隙體積的緩沖溶液注入該柱中。
優(yōu)選地，緩沖溶液的pH低于大約8.6。更優(yōu)選地，緩沖溶液的pH在大約8.2和大約8.4之間。在一項(xiàng)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，緩沖溶液是三(羥基甲基)氨基甲烷醋酸鹽(三-醋酸鹽)。通過(guò)以這種方式飽和柱，血紅蛋白溶液的雜質(zhì)自柱中洗脫。
其后，緩沖劑注入該柱以洗脫血紅蛋白。優(yōu)選地，緩沖溶液是三(羥基甲基)氨基甲烷醋酸鹽。更優(yōu)選地，三-醋酸鹽溶液的pH范圍為大約6.5和大約7.5之間。該血紅蛋白洗脫物是純化的血紅蛋白產(chǎn)品。
在一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，廢棄最開(kāi)始的3％至4％Hb洗脫物和最末尾的3％至4％Hb洗脫物，以確保Hb洗脫物的純度。通過(guò)無(wú)菌濾器濾過(guò)Hb洗脫物是優(yōu)選的。適合的無(wú)菌濾器包括0.22μm濾器，例如Sartorius Sartobran Cat# 5232507 G1PH濾器。
在重復(fù)使用這里的色譜柱時(shí)，需要通過(guò)第四緩沖液洗脫殘留在柱上的非-血紅蛋白蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素雜質(zhì)。合適的緩沖溶液的實(shí)例是NaCl/三-醋酸鹽溶液(濃度大約1.0M NaCl和大約20mM三-醋酸鹽；pH大約8.4至大約9.4，優(yōu)選大約8.9-9.1)。在一項(xiàng)最優(yōu)選地實(shí)施方案中，所有緩沖溶液都是三(羥基甲基)氨基甲烷醋酸鹽。通常，在大約0℃至大約50℃之間使用該緩沖溶液。緩沖液溫度優(yōu)選地是大約12.4±1.0℃。此外，該緩沖液通常在大約9℃至大約11℃之間貯存。
如這里描述的，血液代用品是用于人類(lèi)、哺乳動(dòng)物和其它脊椎動(dòng)物的、一種血紅蛋白基氧原子運(yùn)載成分，它適于運(yùn)輸和轉(zhuǎn)移氧原子至重要的器官和組織，至少，能保持充分的血管內(nèi)膨脹壓。脊椎動(dòng)物是如經(jīng)典定義的，包括人類(lèi)，或任何其它的在循環(huán)系統(tǒng)中采用血液傳遞氧原子至組織的脊椎動(dòng)物。此外，循環(huán)系統(tǒng)的定義是如經(jīng)典定義的，由心臟、動(dòng)脈、靜脈和包括如毛細(xì)血管的小血管結(jié)構(gòu)的微循環(huán)組成。
通過(guò)本發(fā)明的方法制備的血液代用品優(yōu)選按照本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)施方案制備，它含有的內(nèi)毒素、磷酯、外源性蛋白質(zhì)和其它的雜質(zhì)含量不會(huì)引起嚴(yán)重的免疫系統(tǒng)反應(yīng)，并且它對(duì)受體是無(wú)毒的。優(yōu)選地，血液代用品是超純的?！俺?，”如這里定義的，意指含用少于0.5EU/ml的內(nèi)毒素、少于3.3nmoles/ml的磷酯和少量以致不能檢測(cè)到的非血紅蛋白蛋白質(zhì)，例如血清清蛋白和抗體。
術(shù)語(yǔ)“內(nèi)毒素”指細(xì)胞結(jié)合的脂多糖，作為部分革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的外層產(chǎn)生，它在許多情況下是毒性的。注射入動(dòng)物時(shí)，內(nèi)毒素會(huì)導(dǎo)致發(fā)燒、腹瀉、出血性休克，以及其它的組織損傷。1983年美國(guó)藥典3014頁(yè)定義了內(nèi)毒素單位(EU)，如含有0.1毫微克美國(guó)參考標(biāo)準(zhǔn)份額EC-5的活性。一小瓶的EC-5含有10,000EU。檢測(cè)血液代用品中內(nèi)毒素濃度的合適的方法的實(shí)例包括“Kinetic/Turbidimetric Limuus Amebocytic Lystate(LAL)5000Methodology”，它由馬塞諸塞Associates of Cape Cod，Woods Hole發(fā)現(xiàn)。
“穩(wěn)定的聚合血紅蛋白，”如這里定義的，是血紅蛋白基氧原子運(yùn)載成分，適合的貯存溫度下兩年或更多的貯存期間，它的分子量分布和/或高鐵血紅蛋白成分并不能充分的增加或減少，低氧環(huán)境下時(shí)優(yōu)選兩年或更多的期間。適于貯存一年或更多年的適合的貯存溫度在大約0℃和大約40℃之間。優(yōu)選的貯存溫度范圍是大約0℃和大約25℃之間。
適合的低氧環(huán)境，或者基本無(wú)氧的環(huán)境，定義為在至少大約二個(gè)月的貯存期，與血液代用品接觸的蓄積的氧原子量，優(yōu)選至少大約一年，或者更優(yōu)選至少大約二年，它會(huì)引起在血液代用品內(nèi)高鐵血紅蛋白濃度小于大約15重量％。氧原子的蓄積量包括滲入血液代用品包裝的氧原子和血液代用品及包裝的原始氧原子含量。
通過(guò)這種方法，從紅細(xì)胞(RBC)收集直至血紅蛋白聚合，將細(xì)菌生長(zhǎng)充分地減到最少或抑制生物的條件下，保持血液、紅細(xì)胞和血紅蛋白，例如溫度保持在20℃之下0℃之上。優(yōu)選地，溫度保持在大約15℃甚至更低。更優(yōu)選地，溫度保持在10±2℃。
在這種方法中，用于制備穩(wěn)定聚合血紅蛋白的血液代用品的方法的成分部分，充分消毒以制備無(wú)菌產(chǎn)品。無(wú)菌如本領(lǐng)域的定義，特別地，溶液符合USP XXII美國(guó)藥典，第71章，1483-1488頁(yè)對(duì)無(wú)菌的要求。進(jìn)一步，加入工藝物料流的成分部分，通常制造或包上一層不會(huì)與工藝物料流反應(yīng)或污染的材料。這些材料包括不銹鋼和其它的鋼合金，例如因鋼。
適合的RBC來(lái)源包括人血、牛血、綿羊血、豬血、其它脊椎動(dòng)物血和轉(zhuǎn)基因制造的血紅蛋白，例如BIO/TECHNOLOGY，1255-59(1994)描述的轉(zhuǎn)基因Hb。
血液可以從肝臟或新鮮的屠殺的供體收集。Rausch等人在美國(guó)專(zhuān)利第5,084,558和5,296,465號(hào)中描述了一種收集牛全血的方法。以衛(wèi)生方式收集血液是優(yōu)選的。
收集或收集后不久，血液與至少一種抗凝劑混合以抑制血液明顯的凝固。適合于血液的抗凝劑本領(lǐng)域公知，包括，例如，枸椽酸鈉、乙烯基二元胺四醋酸和肝素?；旌涎簳r(shí)，抗凝劑可以是固體形式，例如粉末，或者是水溶液。
可以理解血液溶液可以源自新鮮收集的樣品或陳樣品，例如血庫(kù)期滿(mǎn)的人血。進(jìn)一步地，血液溶液可以預(yù)先保持在凍結(jié)和或液態(tài)。血液用于該方法之前并沒(méi)有凍結(jié)是優(yōu)選的。
在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，向血液溶液加入抗凝劑之前，分析血液中的抗生素含量。通過(guò)檢驗(yàn)供體的血液樣品沒(méi)有受抗生素處理，檢測(cè)血液溶液中的抗生素含量以提供血液樣品沒(méi)有感染微生物的確信程度。分析抗生素適合的實(shí)例包括采用名為“牛奶中青霉素的快速檢測(cè)”方法的青霉素分析試劑盒(Difco，Detroit，MI)。血液溶液青霉素含量小于或等于大約0.008單位/ml是優(yōu)選的?？梢赃x擇地，可以采用監(jiān)控?zé)o疾病或抗生素處理的家畜的群體管理程序。
優(yōu)選地，血液溶液先于或者在抗凝步驟作用期間濾過(guò)，例如通過(guò)過(guò)濾，以清除大的聚集物和顆粒。適合的濾器的實(shí)例是600目篩。
血液溶液中的紅細(xì)胞然后通過(guò)適合的方法洗滌，例如通過(guò)滲濾法或通過(guò)以至少一種溶液，例如等張溶液，合用分散稀釋和濃縮步驟，以使紅細(xì)胞從細(xì)胞外血漿蛋白，例如血清清蛋白或抗體(即，免疫球蛋白(IgG))離析。以分批或連續(xù)流入模式洗滌紅細(xì)胞是可理解的。
可接受的等張溶液在本領(lǐng)域是公知的，包括溶液，例如枸椽酸/鹽溶液，該溶液的pH和滲透克分子量不會(huì)破裂紅細(xì)胞膜并可以替代全血的血漿部分。優(yōu)選的等張溶液具有中性pH和大約285-315mOsm的滲透克分子量。在一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，等張溶液由枸椽酸鈉二水合物(6.0g/l)和氯化鈉(8.0g/l)的水溶液組成。
可用于本發(fā)明的方法的水包括蒸餾水、去離子水、注射用水(WFI)和/或低熱原水(LPW)。WFI，它是優(yōu)選的，是符合美國(guó)藥典注射用水規(guī)定去離子的蒸餾水。Pharmaceutical Engineering，11，15-23(1991)進(jìn)一步描述了WFI。LPW，它是優(yōu)選的，是含有少于0.002EU/ml的去離子水。
等張溶液在加入到血液溶液之前過(guò)濾是優(yōu)選的。合適的濾器的實(shí)例包括10,000道爾頓微孔的超濾膜，例如Millipore Cat # CDUF050 Gl濾器或A/G Technology中空纖維，10,000道爾頓(Cat #UFP-10-C-85)。
在一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)滲濾法洗滌血液溶液中的紅細(xì)胞。合適的滲濾法包括多微孔膜，其孔徑能從充分細(xì)小的血液溶液成分中分離出紅細(xì)胞，例如0.1μm至0.5μm濾器(例如，0.2μm中空纖維濾器，Microgon Krosflo II微濾筒)。同時(shí)，以一種等于經(jīng)滲濾法濾過(guò)的速率(或體積)的速率，附加地連續(xù)(或者分批)過(guò)濾等張溶液作為補(bǔ)充。在洗滌紅細(xì)胞期間，直徑明顯小于紅細(xì)胞的血液溶液的成分，或者液體如血漿，透過(guò)透濾器的透析過(guò)濾壁。保留紅細(xì)胞、血小板和稀釋的血液中的較大的物質(zhì)，例如白細(xì)胞，并與等張溶液混合，它們持續(xù)或者分批添加以制備透析過(guò)的血液溶液。
在一項(xiàng)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，滲濾槽中該體積血液溶液開(kāi)始通過(guò)添加體積的濾過(guò)的等張溶液至滲濾槽中稀釋。優(yōu)選地，加入的等張溶液大約等于血液溶液開(kāi)始的體積。
在一項(xiàng)可以選擇的實(shí)施方案中，通過(guò)一系列連續(xù)的(或反相連續(xù)的)稀釋液和濃縮步驟洗滌紅細(xì)胞，其中通過(guò)添加至少一種等張溶液稀釋血液溶液，并通過(guò)流經(jīng)濾器濃縮，因此制備透析過(guò)的血液溶液。
當(dāng)染有紅細(xì)胞的血漿蛋白質(zhì)的含量基本上減少時(shí)(通常至少大約90％)，紅細(xì)胞洗滌結(jié)束。通常地，由滲濾器34流出的濾出液的體積，等于大約以濾過(guò)的等張溶液稀釋的血液溶液之前的滲濾槽中的血液溶液的體積的300％，或者更多時(shí)，紅細(xì)胞洗滌結(jié)束。額外的紅細(xì)胞洗滌可進(jìn)一步地將細(xì)胞外血漿蛋白質(zhì)與紅細(xì)胞離析。例如，以6體積的等張溶液膜過(guò)濾可以從血液溶液中清除至少大約99％的IgG。
透析過(guò)的血液溶液接著實(shí)施在透析過(guò)的血液溶液中將紅細(xì)胞與白細(xì)胞和血小板離析的方法，例如通過(guò)離心。
可以理解，也可以采用其它的在本領(lǐng)域公知的使紅細(xì)胞與其它血液成分離析的方法。例如，沉降，其中該分離方法不會(huì)損傷顯著數(shù)量的紅細(xì)胞的細(xì)胞膜，如少于大約30％的紅細(xì)胞，在紅細(xì)胞與其它血液成分離析之前。
紅細(xì)胞的分離之后，紅細(xì)胞通過(guò)溶解紅細(xì)胞的方法溶解，以從紅細(xì)胞中釋放出血紅蛋白以制備含有血紅蛋白的溶液。溶解指采用各種溶解方法，例如機(jī)械溶解、化學(xué)溶解、低張溶解或其它公知的溶解方法，這些方法能釋放血紅蛋白，無(wú)需明顯地?fù)p壞Hb的運(yùn)輸和釋放氧原子的能力。
在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，重組制備血紅蛋白，例如Nature，356258-260(1992)描述的重組制備血紅蛋白，它可以在本發(fā)明的方法中取代紅細(xì)胞。從染有上述物的物中洗滌和分離含有血紅蛋白的細(xì)菌細(xì)胞。然后這些細(xì)菌通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法細(xì)胞機(jī)械破裂，例如球磨機(jī)，以從細(xì)胞中釋放血紅蛋白并制備溶解的紅細(xì)胞相。
在溶解之后，溶解的紅細(xì)胞相接著超濾以清除大的細(xì)胞碎片，例如分子量超過(guò)大約100,000道爾頓的蛋白質(zhì)。通常地，細(xì)胞碎片包括一切完整和片段的細(xì)胞成分，除了Hb、較小的細(xì)胞蛋白質(zhì)、電解質(zhì)、輔酶和有機(jī)代謝中間體?？山邮艿某瑸V包括，例如，Millipore(Cat # CDUF 050 H1)和A/G Technology(Needham，MA.；No.UFP100E55型)的100,000道爾頓濾器。
持續(xù)超濾直至溶解紅細(xì)胞相中的Hb濃度小于8克/升(g/l)，以增加用于聚合的血紅蛋白的收率，這是優(yōu)選的。也可以采用其它的從溶解的紅細(xì)胞中分離出Hb的方法，包括沉降、離心或微孔過(guò)濾。
接著超濾Hb超濾液，以從Hb超濾液中清除較小的細(xì)胞碎片，例如電解質(zhì)、輔酶、代謝中間體和分子量小于30,000道爾頓的蛋白質(zhì)，以及水。合適的超濾器包括30,000道爾頓的超濾器(MilliporeCat # CDUF 050 T1和/或Armicon，#540 430)。
然后如上面詳細(xì)描述的，將濃縮的Hb溶液直接上一個(gè)或多個(gè)并聯(lián)的色譜柱。
由色譜步驟得到的Hb洗脫物優(yōu)選脫氧，即在聚合制備脫氧的Hb溶液(下文中為脫氧-Hb)之前，通過(guò)不明顯減小Hb洗脫物中Hb運(yùn)輸和釋放氧原子能力而又基本上除去Hb氧的方法來(lái)進(jìn)行，也就是避免例如由變性或形成氧化血紅蛋白(met Hb)發(fā)生的運(yùn)輸和釋放氧原子能力的降低。
在一項(xiàng)實(shí)施方案中，Hb洗脫物通過(guò)經(jīng)過(guò)相膜的惰性氣體的氣體轉(zhuǎn)移進(jìn)行脫氧的。這些惰性氣體包括，例如，氮?dú)?、氬氣和氦?？梢岳斫?，可采用其它的、本領(lǐng)域公知的脫氧血紅蛋白溶液的方法，以除去Hb洗脫物的氧。這些其它的方法，包括，例如，氮?dú)鈬娚銱b洗脫物，脫氧劑化學(xué)清掃，例如N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)、半胱氨酸、連二亞硫酸或抗壞血酸的鈉鹽，或者光分解作用。
在得到色譜柱洗脫之后，優(yōu)選濃縮Hb洗脫物以提高該方法的效率。通過(guò)超濾器再循環(huán)Hb洗脫物，濃縮Hb洗脫物，制備濃縮的Hb洗脫物。合適的超濾器包括，例如，30,000道爾頓或更小的超濾器(Millipore Helicon，Cat # CDUF050G1和/或Armicon Cat # 540430)。通常，Hb濃度在大約100至大約120g/l之間時(shí)，Hb洗脫物的濃縮結(jié)束。濃縮Hb洗脫物時(shí)，Hb洗脫物溫度優(yōu)選保持在近似8-12℃。
然后將緩沖劑加入Hb溶液，該溶液優(yōu)選濃縮的，以調(diào)整Hb溶液的離子強(qiáng)度，增強(qiáng)Hb的脫氧作用。離子強(qiáng)度優(yōu)選調(diào)節(jié)至大約150meq/l至大約200meq/l之間，以減小Hb溶液中Hb的氧親和力。適合的緩沖劑包括這樣的緩沖劑，它的pH不會(huì)引起明顯的Hb蛋白質(zhì)變性，但具有充分高的離子強(qiáng)度以促進(jìn)Hb脫氧作用。適合的緩沖液的實(shí)例包括pH范圍為大約6.5至大約8.9的鹽溶液。優(yōu)選的緩沖液是1.0M NaCl水溶液，pH大約8.9的20mM三-醋酸鹽溶液。
優(yōu)選地，所得的緩沖Hb溶液然后通過(guò)超濾器再循環(huán)，再濃縮Hb溶液以提交該方法的效率。在一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，Hb濃度在大約100g/l至大約120g/l之間時(shí)，Hb洗脫物的濃縮結(jié)束。
脫氧作用期間，Hb溶液通過(guò)適合的相轉(zhuǎn)移膜循環(huán)。適當(dāng)?shù)南噢D(zhuǎn)移膜包括，例如，0.05μm的聚丙乙烯中空纖維微孔濾器(例如，Hoechst-Celanese Cat # 5PCM-107)。同時(shí)，惰性氣體的逆流經(jīng)過(guò)該相轉(zhuǎn)移膜。適合的惰性氣體包括，例如，氮?dú)?、氬氣和氦氣。?jīng)過(guò)相轉(zhuǎn)移膜的氣體交換因此從Hb溶液中汽提出氧氣。
脫氧作用持續(xù)，直至Hb溶液的pO2減少至Hb溶液中氧化Hb(氧合血紅蛋白或HbO2)成分含量為大約20％或更少。在一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，Hb溶液中HbO2成分大約是10％或更少。
在脫氧作用期間，Hb溶液的溫度通常保持在可平衡脫氧作用速率與高鐵血紅蛋白形成速率的水平。保持溫度以限制高鐵血紅蛋白含量小于20％。最優(yōu)化的溫度應(yīng)導(dǎo)致高鐵血紅蛋白成分含量小于大約5％，優(yōu)選高鐵血紅蛋白成分含量小于大約2.5％，同時(shí)Hb溶液仍然進(jìn)行脫氧作用。通常，脫氧作用期間，Hb溶液溫度維持在大約19℃和大約31℃之間。
脫氧作用期間，和隨后的遍及本發(fā)明方法的剩余步驟，Hb保持在低氧的環(huán)境中以最小化Hb的氧逸出，并保持HbO2含量小于大約20％，優(yōu)選小于大約10％。
然后優(yōu)選以低氧含量的、含有巰基化合物的貯存緩沖液，飽和脫氧的Hb，以制備一種氧化作用穩(wěn)定的脫氧Hb。合適的巰基化合物包括無(wú)毒的還原劑，例如N-乙?；?L-半胱氨酸(NAC)D，L-半胱氨酸、γ-谷氨酰-半胱氨酸、谷胱甘肽、2，3-二巰基-1-丙醇、1，4-二巰基丁烷、巰基乙酸鹽，和其它的生物學(xué)上相容的巰基化合物。低氧含量貯存緩沖液的氧含量必需足夠低，以便不能明顯減少緩沖液中巰基化合物的濃度，并限制氧化作用穩(wěn)定的脫氧-Hb的氧合血紅蛋白含量在大約20％或更少，優(yōu)選小于于大約10％。通常，貯存緩沖液的pO2小于大約50托。
在一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，貯存緩沖液應(yīng)具有適于平衡Hb聚合和高鐵血紅蛋白形成的pH，通常在大約7.6和7.9之間。
與脫氧-Hb混合的巰基化合物的量足夠大，以便于提高聚合期間Hb分子內(nèi)的交聯(lián)，同時(shí)它的量也充分低，以便不能明顯的減小Hb分子的分子內(nèi)交聯(lián)，由于高離子強(qiáng)度。通常地，大約1摩爾的巰基官能團(tuán)(-SH)，對(duì)穩(wěn)定氧化大約0.25摩爾至大約5摩爾之間的脫氧-Hb必需。
在一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，貯存緩沖液含有大約25-35mM磷酸鈉緩液鹽(pH7.7-7.8)，并且NAC含量如此，即氧化作用穩(wěn)定的脫氧-Hb中NAC的濃度按重量計(jì)，為大約0.003％至大約0.3％之間。更優(yōu)選地，氧化作用穩(wěn)定的脫氧-Hb中NAC濃度按重量計(jì)為大約0.05％至大約0.2％。
優(yōu)選地，在與脫氧-Hb混合之前過(guò)濾貯存緩沖液，例如通過(guò)10,000道爾頓的超濾膜(Millipore Helicon Cat # CDUF050G1或A/GTechnology Maxcell Cat # UFP-10-c-75)。
在一項(xiàng)實(shí)施方案中，氧化作用穩(wěn)定的脫氧-Hb接著流經(jīng)可選的濾器。合適的濾器包括0.2μm聚丙烯預(yù)濾器和0.5μm無(wú)菌的微過(guò)濾器(Pall Profile II，Cat # ABIY00527或Gelman Supor)。脫氧-Hb保持在基本上無(wú)氧的氣體中。該步驟可以這樣完成，例如，在填充氧化作用穩(wěn)定的脫氧-Hb之前和之后，通過(guò)以一種惰性氣體，如氮?dú)猓祾吆透采w操作儀器。
任選地，氧化作用穩(wěn)定的脫氧-Hb轉(zhuǎn)移至聚合之前，適合量的水加入聚合反應(yīng)器中。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，水的適合量是指氧化作用穩(wěn)定的脫氧-Hb加入聚合反應(yīng)器時(shí)，會(huì)導(dǎo)致溶液Hb濃度為大約10至大約100g/l的量。優(yōu)選地，該水貧氧。
聚合步驟中，在水的pO2含量減少至充分限制HbO2含量至大約20％，通常小于大約50托之后，聚合反應(yīng)器以一種惰性氣體，例如氮?dú)飧采w。氧化作用穩(wěn)定的脫氧-Hb接著轉(zhuǎn)入聚合反應(yīng)器中，同時(shí)覆蓋有適合的流動(dòng)的惰性氣體。
聚合反應(yīng)器中，氧化作用穩(wěn)定的脫氧-Hb與交聯(lián)劑接觸時(shí)，氧化作用穩(wěn)定的脫氧-Hb溶液的溫度升至優(yōu)化聚合反應(yīng)的溫度。通常地，氧化作用穩(wěn)定的脫氧-Hb的溫度大約是25℃至大約45℃，整個(gè)聚合反應(yīng)中優(yōu)選大約41℃至大約43℃。適用于加熱聚合反應(yīng)器的可接受的熱傳遞方法的實(shí)施是加套的加熱系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過(guò)引導(dǎo)熱乙二醇流經(jīng)該套加熱。
接著氧化作用穩(wěn)定的脫氧-Hb在充分聚合氧化作用穩(wěn)定的脫氧-Hb的溫度下，與合適的交聯(lián)劑反應(yīng)，在大約2小時(shí)至大約6小時(shí)的期間內(nèi)制備聚合的血紅蛋白[聚(Hb)]溶液。
合適的交聯(lián)劑的實(shí)例包括能交聯(lián)Hb蛋白質(zhì)的多官能劑，例如戊二醛、丁二醛、活性形態(tài)的聚氧環(huán)乙烷和葡聚糖，α-羥基醛，例如羥乙醛、N-馬來(lái)酰亞胺-6-氨基己酰(2′-硝基，4′-磺酸)-苯基酯、m-馬來(lái)酰亞胺苯甲酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯、琥珀酰亞胺4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸鹽、硫代琥珀酰亞胺4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸鹽、m-馬來(lái)酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯、m-馬來(lái)酰亞胺苯甲酰-N-羥基硫代琥珀酰亞胺酯、N-琥珀酰亞胺(4-碘代乙酰)氨基苯甲酸酯、硫代琥珀酰亞胺(4-碘代乙酰)氨基苯甲酸酯、琥珀酰亞胺4-(p-馬來(lái)酰亞胺苯基)丁酸鹽、硫代琥珀酰亞胺4-(p-馬來(lái)酰亞胺苯基)丁酸鹽、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)鹽酸碳二亞胺、N，N′-亞苯基二馬來(lái)酰亞胺，和其它類(lèi)化合物中，屬于雙亞胺類(lèi)、酰二嗪農(nóng)類(lèi)或芳基二鹵化物類(lèi)。
交聯(lián)劑適合的含量可允許穩(wěn)定Hb的分子間交聯(lián)和形成Hb聚合物的分子間交聯(lián)，由此提高血管滯留。通常地，交聯(lián)劑適合的含量如下，其中交聯(lián)劑對(duì)Hb的摩爾比例超過(guò)大約2∶1。優(yōu)選地，交聯(lián)劑對(duì)Hb的摩爾比例是在大約20∶1至40∶1之間。
優(yōu)選地，該聚合反應(yīng)在pH在大約7.6至大約7.9之間、氯離子濃度小于或等于大約35毫摩爾的緩沖液中進(jìn)行。
在一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，適合量的交聯(lián)劑加入至氧化作用穩(wěn)定的脫氧-Hb，接著通過(guò)以低速剪切機(jī)攪拌的方式混合。適合的低速剪切攪拌方法包括靜態(tài)混合器。適合的靜態(tài)混合器是，例如，購(gòu)自Chemineer，Inc.的“Kenicx”靜態(tài)混合器。
在一項(xiàng)實(shí)施方案中，通過(guò)靜態(tài)混合器的氧化作用穩(wěn)定的脫氧-Hb和交聯(lián)劑的再循環(huán)導(dǎo)致紊流情況，與交聯(lián)劑和氧化作用穩(wěn)定的脫氧-Hb的通常均勻混合一起，由此減少了制備含有高濃度交聯(lián)劑的脫氧-Hb料袋(pockets)的潛力。交聯(lián)劑和氧化作用穩(wěn)定的脫氧-Hb的通常均勻混合減少了高分子量Hb聚合物的形成，即聚合物分子量超過(guò)500,000道爾頓，并且亦許可聚合期間快速混合交聯(lián)劑和氧化作用穩(wěn)定的脫氧-Hb。此外，Hb聚合期間，由于巰基化合物，優(yōu)選NAC的存在，會(huì)導(dǎo)致顯著的Hb分子間交聯(lián)。巰基化合物與戊二醛和/或Hb相互作用的準(zhǔn)確機(jī)理并不清楚，人們假定，巰基化合物以一種方式影響Hb/交聯(lián)劑化學(xué)鍵，這種方式至少部分抑制高分子量Hb聚合物的形成，并且優(yōu)選地形成穩(wěn)定的Hb四聚物。
聚(Hb)定義為具有顯著的分子內(nèi)交聯(lián)，如果聚(Hb)中大量部分(即，至少大約50％)的Hb分子化學(xué)鍵合，并且高分子量聚合血紅蛋白鏈內(nèi)含有僅僅少量Hb分子，例如小于大約15％。高分子量聚(Hb)分子是這樣的分子，例如，分子量在大約500,00道爾頓之上。
在一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，戊二醛用作交聯(lián)劑。通常地，每公斤氧化作用穩(wěn)定的Hb采用大約10至大約70克的戊二醛。更優(yōu)選的，在超過(guò)5小時(shí)的期間加入戊二醛，直至每公斤氧化作用穩(wěn)定脫氧-Hb加入近似29-31克的戊二醛。
聚合之后，聚合反應(yīng)器中聚(Hb)溶液的溫度通常減少至大約15℃至大約25℃。
當(dāng)采用的交聯(lián)劑并不是醛時(shí)，制成的聚(Hb)一般是穩(wěn)定的聚(Hb)。當(dāng)采用的交聯(lián)劑是醛時(shí)，制成的聚(Hb)一般是不穩(wěn)定的，直至與合適的還原劑混合，以減少還原聚(Hb)中不穩(wěn)定鍵，形成更穩(wěn)定鍵。適合的還原劑實(shí)例包括硼氫化鈉、氰基硼氫鈉、連二亞硫酸鈉、三甲基胺、t-丁基胺、嗎啉硼烷和吡啶硼烷。加入還原劑之前，聚(Hb)溶液可通過(guò)超濾任意地濃縮，直至聚(Hb)溶液濃度升高至大約75和大約85g/l之間。適合的超濾器的實(shí)例是30,000道爾頓濾器(例如，MiLLipore Helicon，Cat # CDUF050LT和Amicon，Cat # 540430)。
聚(Hb)溶液的pH接著調(diào)節(jié)至堿性pH范圍，以保護(hù)還原劑并抑制氫氣生成，它在隨后的反應(yīng)期間可使Hb變性。
在一項(xiàng)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)pH大于10。聚合期間或之后，通過(guò)加緩沖溶液至聚(Hb)溶液調(diào)節(jié)pH。通常純化聚(Hb)以清除非聚合血紅蛋白。它可通過(guò)滲濾法或羥基磷灰石色譜法完成(參見(jiàn)，例如共懸未決的美國(guó)5,691,453，1997年11月25日出版，其教導(dǎo)通過(guò)在此引述而合并于本文)。
調(diào)節(jié)pH之后，至少一種還原劑，優(yōu)選硼氫化鈉溶液，一般通過(guò)脫氧循環(huán)加入聚合步驟中。一般地，聚(Hb)內(nèi)每摩爾Hb四聚物(每64,000道爾頓Hb)加入大約5至大約18摩爾的還原劑。在一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合子系統(tǒng)98中每九升的聚(Hb)溶液，以0.1至0.12lpm的速率加入1升0.25M的硼氫化鈉溶液。
然后恢復(fù)穩(wěn)定聚(Hb)的pH和電解質(zhì)至生理學(xué)水平，以制備穩(wěn)定的聚合血紅蛋白血液代用品，通過(guò)以具有適合的pH和生理學(xué)電解質(zhì)水平的滲濾溶液滲濾該穩(wěn)定的聚(Hb)。優(yōu)選地，該滲濾溶液是緩沖溶液。
對(duì)通過(guò)還原劑還原的聚(Hb)，滲濾溶液具有酸性pH，優(yōu)選在大約4至大約6之間。
無(wú)毒的巰基化合物也可作為氧清除劑加入穩(wěn)定的聚(Hb)溶液，以增強(qiáng)最終的聚合血紅蛋白血液代用品的穩(wěn)定性。巰基化合物可作為滲濾溶液的部分加入和/或單獨(dú)加入。加入一定量的巰基化合物，以產(chǎn)生巰基溶液，它會(huì)清除氧以保持貯存期內(nèi)高鐵血紅蛋白含量小于大約15％。優(yōu)選地，巰基化合物是NAC。通常地，按重量計(jì)，加入的巰基化合物量能充分形成大約0.05％至大約0.2％之間的巰基濃度。
在一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在無(wú)菌操作條件下包裝血液代用品，該條件下，聚合反應(yīng)器和殘留物運(yùn)輸器內(nèi)，保持惰性的、基本上不含氧的氣體的壓力。
通過(guò)本發(fā)明的方法制備適合的穩(wěn)定的聚合血紅蛋白血液代用品的說(shuō)明如表I所示。
表I
a-Hb聚合前測(cè)量接著在短期的貯藏容器或無(wú)菌貯藏容器貯存穩(wěn)定的血液代用品，每個(gè)都具有如上描述的低氧環(huán)境。貯藏容器也應(yīng)對(duì)水汽通道充分不能滲透，以抑制貯存期內(nèi)通過(guò)蒸發(fā)血液代用品顯著濃縮。血液代用品顯著濃縮導(dǎo)致該血液代用品的一種或多種參數(shù)高于規(guī)定。
穩(wěn)定聚合血紅蛋白血液代用品的合成、按照本發(fā)明的制備，在美國(guó)專(zhuān)利No.5,296,465進(jìn)一步描述。
通過(guò)本發(fā)明的方法可制備、得到血液代用品的脊椎動(dòng)物包括哺乳動(dòng)物，例如人、非人的靈長(zhǎng)類(lèi)、狗、貓、大鼠、馬或綿羊。進(jìn)一步地，可得到所述的血液代用品的脊椎動(dòng)物，包括胎兒(出生以前的脊椎動(dòng)物)、出生后的脊椎動(dòng)物，或者出生時(shí)的脊椎動(dòng)物。
通過(guò)一種或多種注射方法，本發(fā)明的血液代用品經(jīng)直接注射該血液代用品給藥入循環(huán)系統(tǒng)和/或間接給藥入脊椎動(dòng)物循環(huán)系統(tǒng)。直接注射方法的實(shí)例包括血管注射，例如靜脈和動(dòng)脈內(nèi)注射，和心內(nèi)注射。間接注射方法的實(shí)例包括腹膜內(nèi)注射、皮下注射，這樣通過(guò)淋巴系統(tǒng)血液代用品會(huì)運(yùn)輸循環(huán)系統(tǒng)，通過(guò)套管針或?qū)Ч茏⑸淙牍撬?。血液代用品?yōu)選靜脈給藥。
血液代用品注入之前、期間和/或之后，待處置的脊椎動(dòng)物血量正常、血容量過(guò)多或血容量減少。通過(guò)如自頂裝入和交換方法，血液代用品可直接進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。
血液代用品治療學(xué)上給藥，以治療許多不同的病因引起的脊椎動(dòng)物內(nèi)組織缺氧，包括部分或全部循環(huán)系統(tǒng)流動(dòng)的RBC減少，貧血和休克。進(jìn)一步地，該血液代用品可預(yù)防地給藥，以預(yù)防脊椎動(dòng)物內(nèi)組織缺氧，該病可能或預(yù)計(jì)由流向組織或遍及脊椎動(dòng)物循環(huán)系統(tǒng)的RBC減少引起。治療或預(yù)防治療低氧癥的血紅蛋白給藥的進(jìn)一步討論，特別由部分動(dòng)脈障或部分微循環(huán)阻滯引起的，以及其中使用的劑量，都由1995年3月23日提交的、序列號(hào)No.08/409,337的共懸未決的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)峁?，它通過(guò)參考完整地附在這里。
一般地，血液代用品適合的劑量，或者合用的劑量，當(dāng)血漿內(nèi)含有它時(shí)，該劑量會(huì)引起脊椎動(dòng)物血液的血紅蛋白總濃度在大約0.1至大約10克Hb/dl之間，如果需要彌補(bǔ)大量的失血，或者更多。
現(xiàn)在通過(guò)下列的實(shí)施例進(jìn)一步和詳細(xì)地描述本發(fā)明。
收集后每個(gè)血液溶液樣品保持在大約2℃的溫度，接著以600目篩過(guò)濾以清除大的聚集體和顆粒。
合并之前，采用名為“牛奶中青霉素的快速檢測(cè)”的方法，以購(gòu)自Difco，底特律，密歇根的分析試劑盒測(cè)定每個(gè)血液溶液樣品中青霉素的含量，確保該血液溶液中的青霉素含量≤0.008單位/ml。
血液溶液樣品然后合并，并與去熱源的(depyrogenated)枸椽酸鈉水溶液混合，在牛全血中制備按重量計(jì)0.2％枸櫞酸鈉溶液(此后的“0.2％枸櫞酸鈉血液溶液”)。
該0.2％枸櫞酸鈉血液溶液接著串聯(lián)地通過(guò)800μm和50μm聚丙烯，以清除大的、直徑大約50μm或者更大的血液溶液碎片。
然后洗滌紅細(xì)胞以將細(xì)胞外血漿蛋白質(zhì)與紅細(xì)胞分離，例如BSA或者IgG，為了洗滌血液溶液中含有的紅細(xì)胞，開(kāi)始通過(guò)加入相等體積的濾過(guò)的等張溶液至滲濾槽，稀釋滲濾槽內(nèi)血液溶液的體積。以Millipore(Cat # CDUF 050 G1)10,000道爾頓超濾膜過(guò)濾該等張溶液。這種等張溶液由注射用水(WFI)中6.0g/l脫水枸椽酸鈉和8.0g/l氯化鈉組成。
稀釋的血液溶液接著通過(guò)0.2μm中空纖維(Microgon Krosflo II微孔過(guò)濾筒)透濾器，濃縮至其開(kāi)始的體積。同時(shí)，以等于通過(guò)該0.2μm滲濾器濾失量速率的速率，連續(xù)加入濾過(guò)的等張溶液，作為補(bǔ)充。滲濾期間，稀釋的血液溶液內(nèi)直徑比紅細(xì)胞明顯小的成分，或者液體，例如血漿，與濾出液一起透過(guò)0.2μm透濾器壁。保留紅細(xì)胞、血小板和稀釋的血液中較大的物質(zhì)，例如白細(xì)胞，并連續(xù)加入等張溶液，以制備透析過(guò)的血液溶液。
紅細(xì)胞洗滌期間，稀釋過(guò)的血液溶液保持在大約10至25℃的溫度之間，透濾器入口的流體壓力保持在大約25psi至大約30psi之間，以提高方法的效率。
透濾器流出的濾出液的體積等于以濾過(guò)的等張溶液稀釋之前的血液溶液體積的大約600％時(shí)，紅細(xì)胞洗滌結(jié)束。
透析過(guò)的血液溶液接著以近似4lpm的速率，連續(xù)泵吸至#AS-16型、裝配有#28 ringdam的廈普勒斯超速離心機(jī)。流入透析過(guò)的血液溶液同時(shí)，運(yùn)行該離心機(jī)，以將紅細(xì)胞與白細(xì)胞和血小板分離。操作期間，離心機(jī)以能將紅細(xì)胞充分分離至重的紅細(xì)胞相的速率旋轉(zhuǎn)，同時(shí)也將足夠部分的白細(xì)胞(WBCs)和血小板分至輕的白細(xì)胞相，尤其是大約15,000rpm的速率。操作期間，紅細(xì)胞相和白細(xì)胞相成分分別并連續(xù)從離心機(jī)中排出。
紅細(xì)胞分離之后，溶解紅細(xì)胞以制備含有血紅蛋白的溶液。紅細(xì)胞從離心機(jī)中排出時(shí)，機(jī)械地溶解大部分的紅細(xì)胞。紅細(xì)胞的細(xì)胞膜以一種對(duì)離心出的紅細(xì)胞相流出方向成的角度，沖擊在紅細(xì)胞相排出管線壁上破裂，因此由紅細(xì)胞釋放血紅蛋白(Hb)至紅細(xì)胞相。
溶解的紅細(xì)胞相然后經(jīng)紅細(xì)胞相排出管線，流入靜態(tài)混合器(Chemineer，Inc.的1/2英寸6元件Kenics)。同時(shí)轉(zhuǎn)移紅細(xì)胞相至靜態(tài)混合器，等量的WFI也注入該靜態(tài)混合器，其中WFI與紅細(xì)胞相混合。紅細(xì)胞相和WFI注入靜態(tài)混合器的流速每個(gè)大約為0.25lpm。
靜態(tài)混合器內(nèi)混合紅細(xì)胞相和WFI，制備溶解的紅細(xì)胞膠體。溶解的紅細(xì)胞膠體接著從靜態(tài)混合器轉(zhuǎn)移至廈普勒斯超速離心機(jī)(#AS-16型，Sharples Eivision of Alfa-Laval Separation，Inc.)，該離心機(jī)適合于將Hb與非血紅蛋白紅細(xì)胞成分分離。離心機(jī)以能將溶解的紅細(xì)胞膠體充分離心成輕Hb相和重相的速率旋轉(zhuǎn)。輕相由Hb組成，并且也含有濃度近似等于或小于Hb濃度的非血紅蛋白成分。
Hb相經(jīng)0.45μm Millipore Pellicon Cassette，Cat # HVLP 000 C5微孔濾器從離心機(jī)中連續(xù)排出，并排入預(yù)備Hb純化的接受罐。接著細(xì)胞基質(zhì)與滲余物從微孔濾器返回至接受罐。微孔過(guò)濾期間，接受罐內(nèi)的溫度保持在10℃或更低。為了提高效率，當(dāng)微孔濾器入口的流體壓力從開(kāi)始的大約10psi升高至大約25psi時(shí)，微孔過(guò)濾結(jié)束。Hb微孔濾出液然后從微孔濾器轉(zhuǎn)移至微孔濾出液罐。
隨后，經(jīng)100,000 Millipore Cat # CDUF 050 H1超濾器泵吸Hb微孔濾出液。將包含在該Hb微孔濾出液內(nèi)的大部分的Hb和水，滲透100,000道爾頓超濾器以形成Hb超濾液，較大的細(xì)胞碎片，例如蛋白質(zhì)和分子量在大約100,000道爾頓以上的，留存并再循環(huán)至微孔濾出液罐。同時(shí)，WFI連續(xù)加入微孔濾出液罐作為超濾時(shí)損失的水的補(bǔ)充。一般地，細(xì)胞碎片包括一切完整和分段的細(xì)胞外成分，除了Hb、較小的細(xì)胞蛋白質(zhì)、電解質(zhì)、輔酶和有機(jī)代謝中間體之外。持續(xù)超濾直到微孔濾出液罐內(nèi)Hb的濃度小于8克/升(g/l)。超濾Hb時(shí)，微孔濾出液罐的內(nèi)部溫度保持在大約10℃。
Hb超濾液轉(zhuǎn)移至超濾罐，其中Hb超濾液接著經(jīng)過(guò)30,000道爾頓Millipore Cat # CDUF 050 T1超濾器再循環(huán)，以從Hb超濾液中清除較小的細(xì)胞碎片，例如電解質(zhì)、輔酶、代謝中間體和分子量小于30,000道爾頓的蛋白質(zhì)，以及水，由此形成濃縮的含有大約100gHb/l的Hb溶液。
然后濃縮的Hb溶液直接從超濾罐裝上含有介質(zhì)的并聯(lián)的色譜柱(2尺長(zhǎng)，內(nèi)徑8英寸)，以通過(guò)高性能液體色譜法分離Hb。色譜柱含有適于將Hb與非血紅蛋白蛋白質(zhì)分離的離子交換介質(zhì)。該離子交換介質(zhì)由硅膠制成。硅膠與γ-氧化環(huán)氧丙酸丙基硅烷接觸以形成活性環(huán)氧基團(tuán)，接著與C3H7(CH3)2NCl接觸以形成季氨離子交換介質(zhì)。色譜法周刊，120321-333(1976)描述了這種處理硅膠的方法。
通過(guò)能促進(jìn)Hb結(jié)合的第一緩沖液(三-醋酸鹽)沖洗色譜柱，預(yù)處理每根柱子。緩沖液的pH大約是9.0±0.1。接著4.52升的濃縮Hb溶液注入每根色譜柱。注入濃縮的Hb溶液后，通過(guò)引入緩沖溶液經(jīng)過(guò)色譜柱接著洗脫該色譜柱，以從柱上制備梯級(jí)pH梯度洗脫物。每個(gè)緩沖液使用時(shí)的溫度大約是12.4℃。緩沖液在上色譜柱之前，經(jīng)過(guò)10,000道爾頓超濾膜預(yù)過(guò)濾。
尤其是，第一緩沖溶液，20mM三-羥基甲基氨基甲烷醋酸鹽(三-醋酸鹽)(pH大約8.4至大約9.4)，運(yùn)輸純水(U.S.P.)內(nèi)濃縮的Hb溶液至色譜柱內(nèi)的介質(zhì)以鍵合Hb。第二緩沖溶液，pH大約8.3，接著調(diào)節(jié)色譜柱內(nèi)pH以從該色譜柱洗脫非血紅蛋白成分雜質(zhì)，同時(shí)留下Hb。采用第二緩沖溶液以近似每柱3.56lpm的流速，或大約6.1柱體積(11.7空隙體積)連續(xù)飽和大約30分鐘。棄去第二緩沖液的洗脫物。第三緩沖液，50mM三-醋酸鹽(pH大約6.5至大約7.5)，然后從色譜柱洗脫作為純化血紅蛋白產(chǎn)物的Hb。
Hb洗脫物接著經(jīng)0.22μSartobran Cat # 5232507 G1PH濾器直接流入收集Hb洗脫物的罐。直接廢棄最開(kāi)始的3％至4％Hb洗脫物和最末尾的3％至4％Hb洗脫物。
如果該洗脫物含有小于0.05 EU/ml的內(nèi)毒素和含有小于3.3nmoles/ml的磷脂，它可以進(jìn)一步使用。向六十升、100g Hb/l濃度的超純洗脫物中加入9l的1.0M NaCl、20mM三(pH8.9)緩沖液，由此形成離子強(qiáng)度160mM的Hb溶液，以減小Hb溶液內(nèi)Hb的氧親和力。接著通過(guò)經(jīng)超濾器再循環(huán)，尤其是10,000道爾頓Millipore Helicon，Cat # CDUF050G1濾器，在10℃濃縮Hb溶液，直至Hb濃度為110g/l。
然后該Hb溶液脫氧化，直至Hb溶液的pO2減少至HbO2含量大約為10％的水平，通過(guò)以12lpm，經(jīng)0.05μm Hoechst-CelaneseCorporation Cat # G-240/40)聚丙烯微孔過(guò)濾相轉(zhuǎn)移膜，再循環(huán)Hb溶液，以形成脫氧的Hb溶液(在這里為“脫氧-Hb”)。同時(shí)，60lpm流速的氮?dú)庵苯恿鹘?jīng)該相轉(zhuǎn)移膜的相反側(cè)。脫氧作用期間，Hb溶液的溫度保持在大約19℃和大約31℃之間。
脫氧作用期間，以及隨后的整個(gè)過(guò)程，Hb保持在低氧環(huán)境，以最小化Hb的氧逸出，并保持脫氧Hb內(nèi)氧化的Hb(氧合血紅蛋白或HbO2)含量小于大約10％。
60l脫氧Hb，與含有0.2wt％N-乙?；?L-半胱氨酸、33mM磷酸鹽緩沖液(pH7.8)、pO2小于50托的180l貯存緩沖液，接著經(jīng)超濾器滲濾，以制備氧化作用穩(wěn)定的脫氧-Hb。與脫氧-Hb混合之前，貯存緩沖液以10,000道爾頓Millipore Helicon，Cat #CDUF050G1去熱源(depyrogenating)超濾器去熱源。
貯存緩沖液以近似等于超濾器濾失量的速率連續(xù)加入。持續(xù)滲濾直至經(jīng)超濾器滲濾濾失的體積大約三倍于脫氧-Hb開(kāi)始的體積。此時(shí)貯存該物。
轉(zhuǎn)移氧化作用穩(wěn)定的脫氧-Hb至聚合反應(yīng)設(shè)備之前，加入貧氧的WFI至聚合反應(yīng)器清除聚合反應(yīng)設(shè)備的氧，以防止氧化作用穩(wěn)定的脫氧-Hb氧合。當(dāng)氧化作用穩(wěn)定的脫氧-Hb加入聚合反應(yīng)器時(shí)，加入至聚合反應(yīng)器的WFI量能導(dǎo)致Hb溶液濃度為大約40g Hb/l。然后經(jīng)整個(gè)聚合反應(yīng)設(shè)備的WFI再循環(huán)，通過(guò)0.05μm的聚丙烯微孔相轉(zhuǎn)移膜(Hoechst-Celanese Corporation Cat # 5PCM-108，80sq.ft.)對(duì)著加壓的氮?dú)饽媪?，進(jìn)行WFI脫氧。經(jīng)過(guò)相轉(zhuǎn)移膜的WFI和氮?dú)獾牧魉?，分別是大約18至20lpm和40至60lpm。
聚合反應(yīng)設(shè)備內(nèi)的WFI的pO2減少至小于大約2托pO2之后，聚合反應(yīng)器覆蓋氮?dú)猓獨(dú)庖源蠹s20lpm的流速進(jìn)入聚合反應(yīng)器液面上空間。然后氧化作用穩(wěn)定的脫氧-Hb轉(zhuǎn)入該聚合反應(yīng)器中。
在通過(guò)混合Hb溶液和水制備的，pH7.8、氯化物濃度小于或等于大約35mmolar的12mM磷酸鹽緩沖液中實(shí)施該聚合反應(yīng)。
氧化作用穩(wěn)定的脫氧-Hb和N-乙酰基半胱氨酸隨后與交聯(lián)劑戊二醛緩慢混合，5小時(shí)內(nèi)每公斤Hb特別采用29.4克戊二醛，同時(shí)加熱至42℃，通過(guò)6元件的Kenics 1-1/2英寸靜態(tài)混合器(Chemineer，Inc.)再循環(huán)Hb溶液，以形成聚合的Hb(聚(Hb))溶液。
經(jīng)靜態(tài)混合器對(duì)氧化作用穩(wěn)定的脫氧-Hb和戊二醛進(jìn)行再循環(huán)引起了渦流情況，使戊二醛和氧化作用穩(wěn)定的脫氧-Hb大體均勻地混合一起，由此減少了形成含有高濃度戊二醛的脫氧-Hb料袋的潛力。戊二醛和脫氧-Hb的大體均勻混合減少了高分子量聚(Hb)(分子量超過(guò)500,000道爾頓)的形成，并且亦允許快速混合戊二醛和脫氧-Hb。
此外，明顯的Hb分子內(nèi)交聯(lián)導(dǎo)致Hb聚合期間，N-乙?；腚装彼岷吭贖b聚合之上。
聚合反應(yīng)之后，聚合反應(yīng)器內(nèi)聚(Hb)溶液的溫度低至大約15℃和大約25℃的溫度之間。
接著通過(guò)超濾器再循環(huán)聚(Hb)溶液濃縮這種聚(Hb)溶液，直至聚(Hb)溶液濃度升高至大約85g/l。適合的超濾器的實(shí)例是30,000道爾頓濾器(例如，MiLLipore Helicon，Cat # CDUF050LT)。
隨后，該聚(Hb)溶液接著與66.75g硼氫化鈉溶液混合，通過(guò)靜態(tài)混合器又再循環(huán)該聚(Hb)溶液。特別地每九升的聚(Hb)溶液，以0.1至0.12lpm的速率加入1升0.25M的硼氫化鈉溶液。
向聚(Hb)溶液加入硼氫化鈉之前，通過(guò)調(diào)節(jié)pH至大約pH10，堿化聚(Hb)溶液pH，以保護(hù)硼氫化鈉和防止氫氣生成。聚(Hb)溶液通過(guò)與12mM近215l分離加熱的、脫氧硼酸鈉緩沖液一起滲濾，該緩沖液pH為大約10.4至大約10.6，調(diào)節(jié)聚(Hb)溶液的pH。聚(Hb)溶液通過(guò)從聚合反應(yīng)器中經(jīng)30KD超濾器再循環(huán)聚(Hb)溶液滲濾。加入聚(Hb)溶液的硼酸鈉的速率近似等于滲濾經(jīng)超濾器濾失的速率。持續(xù)滲濾直至經(jīng)超濾器滲濾濾失的體積大約三倍于聚合反應(yīng)器內(nèi)聚(Hb)溶液開(kāi)始的體積。
調(diào)節(jié)pH之后，向聚合反應(yīng)器內(nèi)加入硼氫化鈉溶液，以將聚(Hb)溶液內(nèi)的亞胺鍵還原成酮亞胺鍵并在溶液中形成穩(wěn)定的聚(Hb)。硼氫化鈉加入期間，聚合反應(yīng)器內(nèi)的聚(Hb)溶液經(jīng)靜態(tài)混合器和0.05μm聚丙烯微孔過(guò)濾器相轉(zhuǎn)移膜連續(xù)再循環(huán)，以清除溶液的氧原子和氫原子。迅速和有效地混合硼氫化鈉和聚(Hb)溶液條件下，流經(jīng)靜態(tài)混合器也導(dǎo)致硼氫化鈉紊流。聚(Hb)溶液和氮?dú)饨?jīng)過(guò)0.05μm相轉(zhuǎn)移膜的流速分別在大約2.0至4.0lpm和大約12至18lpm之間。硼氫化鈉加入完成之后，聚合反應(yīng)器內(nèi)連續(xù)還原，同時(shí)那里包含的攪拌器以大約每分鐘75轉(zhuǎn)的速度旋轉(zhuǎn)。
硼氫化鈉加入大約1小時(shí)后，聚合反應(yīng)器內(nèi)穩(wěn)定的聚(Hb)溶液經(jīng)30,000道爾頓超濾器再循環(huán)，直至該穩(wěn)定的聚(Hb)溶液濃度為110g/l。濃縮之后，為形成穩(wěn)定的聚合Hb血液代用品，通過(guò)經(jīng)30,000道爾頓超濾器，滲濾聚(Hb)溶液和濾過(guò)的、脫氧的低pH緩沖液，該緩沖液含有27mM乳酸鈉、12mM NAC、115mM NaCl、4mM KCl和1.36mM CaCl2(pH5.0)，穩(wěn)定聚(Hb)溶液的pH和電解質(zhì)恢復(fù)至生理學(xué)水平。連續(xù)滲濾，直至通過(guò)滲濾經(jīng)超濾器濾失的體積大約6倍于濃縮的Hb產(chǎn)物的滲濾前體積。
pH和電解質(zhì)恢復(fù)至生理學(xué)水平之后，通過(guò)向聚合反應(yīng)器加入濾過(guò)的、脫氫的低pH緩沖液，穩(wěn)定的聚合Hb血液代用品然后稀釋至5.0g/dl的濃度。稀釋的血液代用品接著再循環(huán)滲濾，通過(guò)從聚合反應(yīng)器經(jīng)靜態(tài)混合器和100,000道爾頓純化過(guò)濾器，逆著濾過(guò)的脫氧緩沖液，該緩沖液WFI內(nèi)含有27mM乳酸鈉、12mM NAC、115mMNaCl、4mM KCl和1.36mM CaCl2(pH7.8)。持續(xù)滲濾，直至分離條件下，血液代用品含有小于或等于大約10％的由GPC得到的改性Hb四聚物和未改性的四聚物。
純化過(guò)濾器在具有限制滲透線的低貫穿細(xì)胞膜壓力條件下運(yùn)行。充分量的改性Hb四聚物或未改性Hb四聚物清除之后，經(jīng)30,000道爾頓超濾器連續(xù)再循環(huán)血液代用品，直至血液代用品的濃度大約為130g/l。
穩(wěn)定的血液代用品然后在低氧環(huán)境和低氧無(wú)滲漏的適合的容器內(nèi)貯存。
顆粒的計(jì)數(shù)通過(guò)美國(guó)藥典，221596，1990“注射劑中的微粒物質(zhì)適于單次劑量注入的大體積注射劑”確定。
為檢測(cè)戊二醛的濃度，400μl血紅蛋白產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)樣品與二硝基苯肼衍生，然后100μl等分試樣的衍生溶液27℃下以1ml/min的速率梯度注入YMC AQ-303 ODS柱。梯度由兩個(gè)移動(dòng)相，0.1％三氟醋酸(TFA)水溶液和0.08％TFA乙腈溶液組成。梯度流由連續(xù)6分鐘的60％0.08％TFA乙腈溶液、12分鐘內(nèi)線性梯度增至85％0.08％TFA乙腈溶液、4分鐘內(nèi)線性梯度增至100％0.08％TFA乙腈溶液和100％0.08％TFA乙腈溶液保持兩分鐘以及再飽和兩分鐘的45％0.1％TFA水溶液組成。紫外檢測(cè)在@360nm檢測(cè)。
為測(cè)定NAC濃度，一等分試樣的血紅蛋白產(chǎn)品以脫氯的磷酸鈉水溶液稀釋至1∶100，并取50μl梯度注入YMC AQ-303 ODS柱。該梯度緩沖液由磷酸鈉水溶液和0.05％TFA和80％乙腈水溶液混合物組成。該梯度流由15分鐘100％磷酸鈉水溶液、然后5分鐘內(nèi)線性梯度增至100％并保持5分鐘的80％乙腈水溶液和0.05％TFA組成的混合物。該系統(tǒng)接著以100％磷酸鈉水溶液飽和20分鐘。
磷脂分析通過(guò)基于包含在下列兩個(gè)文件中的方法完成Kolarovic等人，“適于生物來(lái)源的磷脂的分離的提取方法比較”，Anal.Biochem.，156244-250，1986和Duck-Chong，C.G.，“適于檢測(cè)包含有消化硝酸鎂的磷脂磷的快速靈敏方法”，Lipids，14492-497，1979。
滲透克分子量可通過(guò)先進(jìn)的低溫(Cryomatic)滲壓計(jì)分析檢測(cè)，該滲壓計(jì)為#3C2型，Advanced Instruments Inc.，Needham，馬塞諸塞。
總的血紅蛋白、高鐵血紅蛋白和氧合血紅蛋白濃度可通過(guò)共同血氧計(jì)檢測(cè)，型號(hào)為#482，馬塞諸塞，來(lái)克星頓，儀器實(shí)驗(yàn)室。
Na+、K+、Cl-、Ca++、pO2濃度可通過(guò)Nova生物醫(yī)學(xué)公司，Waltham，馬塞諸塞Novastat方案(profile)4檢測(cè)。
通過(guò)賓西法尼亞，Southhampton，TCS公司的Hemox-分析器檢測(cè)氧原子結(jié)合常數(shù)P50。
溫度和pH通過(guò)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的方法測(cè)定。
分子量(M.W.)通過(guò)在分離條件下對(duì)血紅蛋白產(chǎn)品實(shí)施凝膠滲透色譜法(GPC)檢測(cè)。為了分子量分布，分析血紅蛋白產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)樣品。血紅蛋白產(chǎn)品以50mM雙-三(pH6.5)，750mM MgCl2，和0.1mM EDTA的移動(dòng)相稀釋至4mg/ml。此緩沖服務(wù)從聚(Hb)中將Hb四聚物分解成二聚物，這樣不能通過(guò)分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)與其它的Hb二聚物交聯(lián)，稀釋過(guò)的樣品注入TosoHaas G3000SW柱。流速為0.5ml/min，紫外檢測(cè)280nm記錄。
表II和表III分別總結(jié)了上述畜用(OXYGLOBINTM)和人(HEMOPURETM2)的按照本發(fā)明的方法制備的Hb血液代用品試驗(yàn)的結(jié)果。
表II
a聚合前檢測(cè)Hb
表III
a聚合前檢測(cè)Hb實(shí)施例3犬活體內(nèi)腫脹效應(yīng)的檢測(cè)此項(xiàng)研究的目的是通過(guò)最大負(fù)荷劑量之后測(cè)量血漿的膨脹體積，檢測(cè)用于脾切除的小獵犬的畜用(OXYGLOBINTM)的血紅蛋白血液代用品的活體內(nèi)腫脹效應(yīng)，特別是服用每克血紅蛋白進(jìn)入血管內(nèi)空間的水的體積。此外，亦檢測(cè)對(duì)比劑量的(RHEOMACRODEXTM-Saline)，Pharmacia制造，它是10％葡聚糖40和0.9％鹽水。
兩只狗在常規(guī)健康篩選和至少四周的馴化期之后參加了本研究中。該狗治療之前脾切除了至少3天。它們以阿托品和HCl杜冷丁預(yù)先麻醉，并通過(guò)吸入異氟烷麻醉。外科手術(shù)期間以10-20ml/kg/hr的速率注入乳酸林格氏溶液。
這些狗經(jīng)任意的頭側(cè)導(dǎo)管以20ml/kg/hr速率吸收Hb血液代用品(40ml/kg)。給藥之前和給藥后1/4、1/2、1、2、3、4小時(shí)或者更長(zhǎng)時(shí)間測(cè)量血細(xì)胞比容，直至確立血細(xì)胞比容的最低點(diǎn)。
狗的脾被切除，以確保恒定的血漿容量和紅細(xì)胞量，以準(zhǔn)確測(cè)量給藥后血漿容量的變化。
采用下列公式可計(jì)算血漿容量的變化Δ%PV={Hct1(1-Hct2)Hct2(1-Hct1)-1}100]]>這里PV是血漿容量，Hct1是開(kāi)始的血細(xì)胞比容，Hct2是最終的血細(xì)胞比容。假定循環(huán)血容量?jī)?nèi)的紅細(xì)胞數(shù)目和平均紅細(xì)胞體積保持不變，該計(jì)算的結(jié)果基于血細(xì)胞比容的變化。
如表IV所示，兩只狗血細(xì)胞比容的最低點(diǎn)產(chǎn)生在給藥后兩小時(shí)。整個(gè)研究平均紅細(xì)胞體積(MCV)保持穩(wěn)定。
表IV
給藥后3503C狗和雄狗14血管內(nèi)流入的該體積液體分別是6ml/g血紅蛋白和9ml/g血紅蛋白。合成的膠體溶液(Rheomacrodex@-鹽水)的劑量，根據(jù)產(chǎn)生類(lèi)似腫脹效應(yīng)劑量計(jì)算。每克靜脈內(nèi)給藥從間質(zhì)組織得到大約22ml Rheomacrodex液體。
相對(duì)于30ml/kg和15ml/kg Hb血液代用品，Rheomacrodex計(jì)算出的對(duì)照劑量分別是14ml/kg和7ml/kg。
以(OxyglobinTM)Hb血液代用品方式流入血管內(nèi)的該體積液體是8ml H2O/克血紅蛋白。由于該體積的劑量是30ml/kg，該劑里中血紅蛋白的濃度是13g/dl，每劑量血紅蛋白的總量是3.9g/kg，并且以Hb血液代用品方式流入血管內(nèi)空間/劑量液體的總體積是31.2ml。
合成膠體溶液流出大約22ml水/克葡聚糖。每對(duì)照劑量的Hb血液代用品，膠體溶液內(nèi)葡聚糖的總量是1.4g。因而，流入血管內(nèi)空間的液體/對(duì)照劑量膠體溶液的總體積是14ml。實(shí)施例4犬用藥效果研究實(shí)施該研究，以檢測(cè)本發(fā)明的獸用(OXYGLOBINTM)Hb血液代用品的藥效和用藥效果，合成的膠體溶液作為對(duì)照，該膠體溶液(RHEOMACRODEXTM-鹽水)是10％的葡聚糖40和0.9％的鹽水，考慮到脾切除的小獵犬急劇的血量正常的血液稀釋之后60分鐘和24小時(shí)，動(dòng)脈氧的含量與犬紅細(xì)胞血紅蛋白和氧的運(yùn)輸有關(guān)。
急劇的血量正常的血液稀釋是一種模仿外科失血引起的臨床貧血癥狀的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。通過(guò)這種方法產(chǎn)生大貧血(Hct-9％，Hb-3g/dl)，導(dǎo)致徹底需要氧原子載體。氧的運(yùn)輸和氧的含量與大量出血一起急劇下降。
在進(jìn)展的血量正常的血液稀釋模型內(nèi)，人們發(fā)現(xiàn)或者通過(guò)單獨(dú)的體積膨脹，如對(duì)照組的狗實(shí)施的，或者通過(guò)與動(dòng)脈內(nèi)氧含量的增加相關(guān)的體積膨脹，如以血紅蛋白溶液治療的狗發(fā)生的，恢復(fù)氧運(yùn)輸?shù)闹委煴仨氃诖蠹s10分鐘內(nèi)到達(dá)9％的血細(xì)胞比容，以避免這些然后都會(huì)導(dǎo)致死亡的血液壓力和心輸出量不可逆下降。
給藥期間或之后，本研究里12只對(duì)照狗的2只死去，即使它們以葡聚糖40溶液擴(kuò)張的動(dòng)脈容量，在5分鐘內(nèi)到目標(biāo)的血細(xì)胞比容。這些狗的死亡是該實(shí)施模型的嚴(yán)重反映，它依次描繪了急性失血苛刻的臨床癥狀。
三十只狗在常規(guī)健康篩選和至少四周的馴化期之后參加了本研究中。采用三組狗平行測(cè)定(A、B和C)的治療是階段性的，每個(gè)平行測(cè)定包含一種狗/性別/組。在治療日的32天前狗隨機(jī)分為5組(6只狗/組，3雌3雄)。采用保證組間平均分布的方法，根據(jù)體重通過(guò)隨機(jī)確定，狗指定到各個(gè)組中。雄狗和雌狗分別隨機(jī)確定。任何一只具有不可接受的參數(shù)的狗，例如異常的臨床征象或臨床病毒學(xué)數(shù)據(jù)，由同樣環(huán)境條件下供養(yǎng)的備用狗取代。
通過(guò)單獨(dú)的靜脈輸入，給予試驗(yàn)/對(duì)照物。輸入速率通過(guò)輸入泵控制。每小時(shí)實(shí)際輸入體積依賴(lài)于每只狗最近的體重。
血紅蛋白溶液的最高劑量基于由血量正常的狗體積膨脹引起的急性心血管效應(yīng)的安全上限。選擇中等范圍的劑量以確定用藥效果曲線的形狀。最低劑量基于由狗的體積和血液動(dòng)力效應(yīng)決定的臨床相關(guān)劑量的下限。
每只狗在治療的至少七天前切除脾，以避免由脾萎縮引起的增加的循環(huán)的紅細(xì)胞量對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷挠绊?。以血紅蛋白溶液處理時(shí)，每只狗通過(guò)吸入異氟烷麻醉，并采用20-25ml/Kg潮流氣量的室內(nèi)空氣機(jī)械通風(fēng)。操作期間調(diào)節(jié)通風(fēng)速率以將動(dòng)脈的pCO2保持在大約40mmHg。測(cè)量和控制最終預(yù)計(jì)濃度的異氟烷，以提供一種狗對(duì)狗麻醉水平的有效對(duì)照。為了檢驗(yàn)血液動(dòng)力功能和氧運(yùn)輸參數(shù)，將這些狗安上儀器。由壓力和壓力記錄分析，確認(rèn)了肺動(dòng)脈內(nèi)裝置流向(flow-directed)導(dǎo)管。雙腔的導(dǎo)管，具有熱稀釋法心輸出量性能，置于股動(dòng)脈，以提供一種適于血壓監(jiān)控和血液的動(dòng)脈管道。為了補(bǔ)充體積和服用試驗(yàn)/對(duì)照物，一只導(dǎo)管置于頭側(cè)靜脈，或者其它的靜脈，如果需要。
手術(shù)之前一天，手術(shù)當(dāng)天和脾切除后3天，每只狗每天一次預(yù)防性地接受抗生素的肌肉注射(普魯卡因青霉素G)。V-Sporin，一種局部抗生素(多粘菌素B、桿菌肽、新霉素)，需要時(shí)每天涂至外科手術(shù)處。
儀器安裝之后，血液動(dòng)力穩(wěn)定至pCO2達(dá)到大約40mmHg，并且完成基準(zhǔn)測(cè)量的采集。為保持等張狀態(tài)，通過(guò)使狗出血并同時(shí)以大約1.6至2.3倍抽出體積的乳酸林格氏溶液取代，然后造成了急劇的血量正常的血液稀釋模型。通過(guò)保持肺動(dòng)脈嵌入壓在大約基準(zhǔn)值，達(dá)到了等張狀態(tài)。血液抽出/體積取代花費(fèi)大約45至90分鐘，直至血紅蛋白濃度大約為30g/l(3.0g/dl)。采用靜脈內(nèi)重力裝置和輸入袋周?chē)膲毫μ?，將乳酸林格氏溶液迅速輸入。如果在急性貧血發(fā)生之后和開(kāi)始給藥之前，收縮壓≤50mmHg并超過(guò)5分鐘，淘汰這只狗并由保持同樣環(huán)境狀態(tài)的備用狗代替。
服用的膠體對(duì)照和血紅蛋白溶液劑量如表V規(guī)定的。放血、給藥之前、給藥后立即、給藥60分鐘和24小時(shí)后進(jìn)行血液動(dòng)力測(cè)量。60分鐘時(shí)測(cè)量之后，狗由麻醉狀態(tài)恢復(fù)知覺(jué)，為了血液動(dòng)力測(cè)量，給藥24小時(shí)后實(shí)施重新安裝儀器。
表V
以放血前或給藥前的任一數(shù)值作為協(xié)方差，通過(guò)方差分析(ANOVA)或者協(xié)方差分析(ANCOVA)對(duì)所有血液動(dòng)力參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的分析。建立特別的線性對(duì)照，以試驗(yàn)給藥溶液的體積效應(yīng)、Hb血液代用品的效應(yīng)(藥效)，以及Hb血液代用品的用藥效果應(yīng)(用藥效果)。實(shí)施這些試驗(yàn)，僅僅為了實(shí)驗(yàn)組之間的參數(shù)，實(shí)驗(yàn)組間的差異是統(tǒng)計(jì)上顯著水平為0.05。在選擇時(shí)間點(diǎn)的指定的變動(dòng)的對(duì)照通過(guò)每組成對(duì)的t-檢驗(yàn)進(jìn)行。
動(dòng)脈氧含量是本研究中的一項(xiàng)效力標(biāo)準(zhǔn)。動(dòng)脈氧含量是細(xì)胞和血漿血紅蛋白的氧運(yùn)輸能力以及血漿中溶解的氧的量度標(biāo)準(zhǔn)。缺少血漿血紅蛋白，由通過(guò)飽和的細(xì)胞血紅蛋白運(yùn)輸?shù)难鹾亢臀胙醴謮?，?jì)算出動(dòng)脈內(nèi)氧含量。由于預(yù)計(jì)血漿血紅蛋白明顯有助于本研究的氧含量，采用Lex02Con-K儀器(Chestnus Hill，MA)直接測(cè)量氧含量。實(shí)驗(yàn)期間不能給予富含氧的空氣，因?yàn)樗遣槐匾?，并且為了避免增加的吸入氧濃度?duì)動(dòng)脈內(nèi)氧含量測(cè)量的混淆效應(yīng)。
誘發(fā)貧血之后各組平均動(dòng)脈和靜脈氧含量分別下降大約4至8倍。與一切Hb血液代用品治療組給藥之前的值對(duì)比，給藥60分鐘之后動(dòng)脈氧含量顯著增加，并且中和高劑量組給藥24小時(shí)之后仍然顯著增加。任一對(duì)照組給藥之后動(dòng)脈或靜脈氧含量并不變化。
如圖2所示，與對(duì)照組相比，給藥60分鐘和24小時(shí)之后，血液代用品治療組的動(dòng)脈氧含量明顯增加。在給藥60分鐘和24小時(shí)之后，觀察到了線性的用藥效果。給藥60分鐘后檢測(cè)到了動(dòng)脈氧含量的顯著的體積效應(yīng)。
與對(duì)照組相對(duì)，給藥60分鐘和24小時(shí)之后，血液代用品治療組的靜脈氧含量也顯著增加。該增加顯示給藥之后60分鐘為線性用藥效果，但在24小時(shí)并非線性。
對(duì)于Hb血液代用品治療組給藥60分鐘之后動(dòng)脈-靜脈(A-V)氧含量差，觀測(cè)到的用藥效果歸因于顯著的體積效應(yīng)，該體積效應(yīng)基于缺乏藥效和對(duì)照組給藥60分鐘之后體積效應(yīng)的類(lèi)似觀察。與膠體對(duì)照組比較，Hb血液代用品治療組顯示在24小時(shí)A-V氧差顯著的增長(zhǎng)，并具有顯著的線性用藥效果。A-V差必須從心輸出量的角度解釋。給藥24小時(shí)之后，對(duì)照組的A-V差明顯低于Hb血液代用品治療組的。這種區(qū)別的一種解釋是對(duì)照組的狗必須依賴(lài)較高的心輸出量以滿(mǎn)足外周組織的氧消耗。Hb血液代用品治療組在給藥之后24小時(shí)保持足夠大的A-V差，以滿(mǎn)足外周組織的需要，且不會(huì)導(dǎo)致心輸出量增加。
除了動(dòng)脈氧含量之外，在本研究中檢測(cè)了與犬紅細(xì)胞血紅蛋白貢獻(xiàn)(CaO2/g紅細(xì)胞血紅蛋白)相關(guān)的正常的動(dòng)脈氧的總含量。由于所有組中紅細(xì)胞血紅蛋白是穩(wěn)定的，為了證明給藥組間動(dòng)脈氧含量的差異，進(jìn)行了此比較。血漿或血紅蛋白總濃度和動(dòng)脈氧含量潛在的相關(guān)性會(huì)提供一種有效的臨床療效檢測(cè)。如圖3所示，給藥之60分鐘和24小時(shí)后，所有Hb血液代用品治療組(除了24小時(shí)的低劑量組之外)相對(duì)于給藥前值，顯示在CaO2/g紅細(xì)胞血紅蛋白上顯著增加。給藥之前和給藥60分鐘或24小時(shí)之后，膠體對(duì)照組的與紅細(xì)胞血紅蛋白貢獻(xiàn)相關(guān)的動(dòng)脈氧含量并沒(méi)有顯著差異。
與膠體對(duì)照組相比，給藥60分鐘之后，Hb血液代用品治療組的與紅細(xì)胞血紅蛋白相關(guān)的動(dòng)脈氧總含量顯著增長(zhǎng)，并具有顯著的線性用藥效果。給藥之后24小時(shí)也發(fā)生具有明顯線性用藥效果的顯著的用藥效果，但該藥效并不十分顯著(P＜0.06)。
療效的另一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是氧運(yùn)輸?；趧?dòng)脈氧含量和心輸入量計(jì)算氧的運(yùn)輸。因此，氧運(yùn)輸受一切對(duì)心輸出量有影響的生理因素影響。本研究的選擇的對(duì)照是合成膠體(RHEOMACRODEXTM-鹽水，Pharmacia)，它是10％的葡聚糖40和0.9％的鹽水，由于它可擴(kuò)張血管內(nèi)體積而且公知不能運(yùn)輸氧。對(duì)照組對(duì)Hb血液代用品內(nèi)血紅蛋白的膠體性能可提供一種等價(jià)的體積膨脹對(duì)照。
由于每個(gè)劑量的Hb血液代用品預(yù)計(jì)產(chǎn)生直接的體積效應(yīng)，為了該體積效應(yīng)采用兩倍劑量的葡聚糖溶液作為對(duì)照，這樣數(shù)據(jù)才能反應(yīng)不同劑量的藥效。進(jìn)行低和中劑量的對(duì)照。膠體對(duì)照的劑量基于葡聚糖40的劑量選擇，該劑量提供體內(nèi)低和中劑量試驗(yàn)物腫脹效應(yīng)等價(jià)的對(duì)照，如由實(shí)施例2的結(jié)果決定的。
采用膠體中劑量(14ml/kg)和膠體低劑量(7ml/kg)之間平均值的差異，統(tǒng)計(jì)學(xué)上確定體積效應(yīng)。通過(guò)將每個(gè)Hb血液代用品治療組與其相對(duì)應(yīng)的膠體對(duì)照組比較，確定藥效。當(dāng)?shù)秃透邉┝縃b血液代用品治療組之間可見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性差異時(shí)，線性用藥效果確立。
按照該公式DO2＝CO×CaO2×10/kg計(jì)算氧運(yùn)輸，CO是心輸出量，CaO2為動(dòng)脈氧含量。如預(yù)期的，所有治療組貧血誘發(fā)之后，所有組的DO2平均下降二至三倍。氧含量的充分降低，不得不由增加心輸出量和提高氧的逸出以維持基準(zhǔn)氧消耗，導(dǎo)致較低的靜脈氧含量。如圖4所示，與給藥前的值相比，給藥60分鐘后，低劑量Hb血液代用品治療組氧運(yùn)輸增加了大約30％，中劑量和高劑量血液代用品治療組超過(guò)了100％。該差異對(duì)所有三組給藥組是顯著的(P＜0.05)。此時(shí)間，對(duì)照組并沒(méi)有顯示明顯差異。給藥后60分鐘時(shí)，具有顯著藥效和線性劑量反應(yīng)的DO2在所有組間明顯不同。24小時(shí)，所有組之間氧運(yùn)輸上無(wú)差異。所有Hb血液代用品治療組，與它們相對(duì)應(yīng)的膠體對(duì)照組相比，給藥60分鐘之后氧運(yùn)輸?shù)奶岣?，除了心輸出量的適度增加之外，主要?dú)w功于與動(dòng)脈氧含量提高有關(guān)的劑量。
按照該公式VO2＝CO×CaO2×10kg計(jì)算氧的消耗。所有治療組貧血誘發(fā)之后，所有組的DO2平均下降二至三倍。Hb血液代用品治療組或?qū)φ战M間或者同一組內(nèi)給藥前與給藥后的值比較，未記錄統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異。
貧血誘導(dǎo)之后，所有組的氧逸出速率(VO2/DO2)顯示大約增長(zhǎng)三倍。與對(duì)照組相比，給藥60分鐘之后，所有Hb血液代用品治療組的氧逸出速率以依賴(lài)于劑量的方式明顯減少。給藥24小時(shí)后，Hb血液代用品治療和對(duì)照組之間未見(jiàn)顯著差異。
誘發(fā)貧血之后所有組的平均心輸出量增加至10％和39％之間。給藥24小時(shí)之后，與放血前的值相比，膠體對(duì)照組的心輸出量顯著增加，并非Hb血液代用品治療組。歸因于低膠體組和中等劑量組之間心輸出量顯著差異的明顯的體積效應(yīng)，在給藥60分鐘后很明顯。心輸出量的增長(zhǎng)可能與給藥后血管內(nèi)體積膨脹引起的心搏量增長(zhǎng)，或者由嚴(yán)重貧血的應(yīng)激反應(yīng)引起的交感神經(jīng)音增強(qiáng)有關(guān)。給藥60分鐘之后，Hb血液代用品低劑量和高劑量組之間的劑量反應(yīng)明顯，但給藥24小時(shí)之后并不明顯。在給藥60分鐘或24小時(shí)之后，Hb血液代用品治療和膠體對(duì)照組之間心輸出量上未見(jiàn)差異。
貧血誘發(fā)期間，肺動(dòng)脈嵌入壓(PAWP)并沒(méi)有顯著變化。與給藥之前的數(shù)值相比，給藥60分鐘后，低劑量膠體組內(nèi)PAWP顯著減少，中劑量組內(nèi)保持不變。與給藥之前的數(shù)值相比，給藥60分鐘后，中和高劑量的Hb血液代用品治療組的PAWP以線性劑量反應(yīng)顯著增加。增加的PAWP反應(yīng)劑量依賴(lài)于給藥60分鐘后血管內(nèi)體積的增長(zhǎng)。給藥60分鐘或24小時(shí)之后，Hb血液代用品治療組和對(duì)照組之間未發(fā)現(xiàn)顯著的藥效。給藥60分鐘之后，在膠體對(duì)照組中發(fā)現(xiàn)了顯著的體積效應(yīng)。
貧血誘發(fā)之后，所有組的心收縮、心舒張和平均動(dòng)脈血壓明顯下降，然后給藥之后顯著升高。貧血誘發(fā)后動(dòng)脈心收縮壓的下降可能與由血液粘度下降——貧血的后果引起的外周血管阻力下降有關(guān)。給藥60分鐘之后，兩個(gè)膠體對(duì)照組的心收縮、心舒張和平均動(dòng)脈血壓與給藥前的值并無(wú)顯著不同。與給藥前的值相比，低劑量膠體對(duì)照組給藥24小時(shí)之后的心收縮、心舒張和平均動(dòng)脈血壓顯著增加。相反，與給藥前的值相比，所有Hb血液代用品治療組給藥60分鐘和24小時(shí)之后的心收縮、心舒張和平均血壓的增長(zhǎng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性。給藥之60分鐘后，Hb血液代用品治療組的心收縮、心舒張和平均血壓的顯著高于相對(duì)應(yīng)的膠體對(duì)照組，但并不是在給藥24小時(shí)之后。
與給藥前的值相比，給藥60分鐘之后，觀測(cè)到中等和高劑量Hb血液代用品治療組的心收縮、心舒張和平均動(dòng)脈壓的增長(zhǎng)。中等劑量Hb血液代用品治療組的肺動(dòng)脈心舒壓給藥之后24小時(shí)持續(xù)增長(zhǎng)。此外，與給藥前肺動(dòng)脈壓平均值相比，低劑量膠體組給藥24小時(shí)后顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性的增長(zhǎng)。此增長(zhǎng)可認(rèn)為具有臨床顯著性。與給藥前的值相比，Hb血液代用品給藥60分鐘之后，系統(tǒng)動(dòng)脈心收縮壓和舒張壓的增長(zhǎng)是該Hb血液代用品的直接的藥效。膠體對(duì)照組的心舒壓保持不變，這可能是的外周血管阻力的結(jié)果。
給藥60分鐘或24小時(shí)之后，Hb血液代用品治療和對(duì)照組之間，未發(fā)現(xiàn)肺動(dòng)脈心收縮壓有顯著差異。相反，給藥60分鐘之后，而不是24小時(shí)，與體積、藥物、用藥效果有關(guān)的肺收縮壓和平均動(dòng)脈壓顯著不同。
由于放血，血紅蛋白總量減少了大約四倍或更多。與相對(duì)應(yīng)的膠體對(duì)照組相比，給藥60分鐘和24小時(shí)后，Hb血液代用品治療組血紅蛋白總量顯示一種依賴(lài)于劑量的增長(zhǎng)。
與相對(duì)應(yīng)的膠體對(duì)照組相比，給藥60分鐘和24小時(shí)后，Hb血液代用品治療組的血漿血紅蛋白濃度以一種依賴(lài)于劑量的方式顯著增長(zhǎng)。給藥后所有Hb血液代用品治療組的血漿和總的血紅蛋白濃度的增長(zhǎng)，與它們相應(yīng)的膠體對(duì)照組相比，歸功于Hb血液代用品的血紅蛋白濃度。依賴(lài)劑量的顯著增長(zhǎng)持續(xù)24小時(shí)，伴隨著動(dòng)脈氧含量的持續(xù)增長(zhǎng)。
總之，以Hb血液代用品治療的該反應(yīng)是線性的，即，給藥60分鐘之后，Hb血液代用品的劑量越高，與相應(yīng)的膠體對(duì)照組相比，氧運(yùn)輸和血液動(dòng)力學(xué)的提高越大。保持的動(dòng)脈氧含量和正常的臨床征象，呼吸室內(nèi)空氣時(shí)，維持30ml/kg和45ml/kg劑量Hb血液代用品治療組內(nèi)持續(xù)24小時(shí)的Hb血液代用品的有益的生物效應(yīng)。Hb血液代用品的清除能解釋給藥24小時(shí)之后氧運(yùn)輸和血液動(dòng)力學(xué)效應(yīng)里觀察到的變化。最后，本研究的結(jié)果支持30至45ml/kg劑量范圍的選擇。這些給藥組中的兩個(gè)顯示療效的參數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著不同于相應(yīng)的膠體對(duì)照組，并且劑量反應(yīng)是線性的。
此劑量范圍的臨床原理基于這個(gè)事實(shí)，嚴(yán)重貧血的狗(例如，標(biāo)有臨床征象的血細(xì)胞比容＜15％)會(huì)受益于較高的劑量，如通過(guò)提高的動(dòng)脈氧含量和氧運(yùn)輸量的線性劑量反應(yīng)描述的。然而，更多保守的適于狗的劑量會(huì)顯示，這些狗可能預(yù)先處置至血管內(nèi)體積負(fù)荷過(guò)多。Hb血液代用品治療組內(nèi)，給藥60分鐘之后，觀察到的肺動(dòng)脈嵌入壓和肺動(dòng)脈壓依賴(lài)劑量的瞬間增加，會(huì)限制更高劑量在此群體狗中使用。因此30-45ml/kg的劑量對(duì)廣群體的規(guī)定貧血程度和血管內(nèi)體積情況的狗有效。實(shí)施例5人體劑量反應(yīng)研究實(shí)施此研究，以評(píng)價(jià)Hb血液代用品(這里為HBOL)靜脈給藥漸增的速率，在人體血液動(dòng)力學(xué)、神經(jīng)內(nèi)分泌和血液學(xué)參數(shù)上的安全性和耐受性。試驗(yàn)者是正常健康的成年男性(70-90kg)，18-45歲之間。研究期間，控制試驗(yàn)者等熱量飲食，每天碳水化合物55％、脂肪30％(多不飽和與飽和脂肪比例為2∶1)、15％的蛋白蛋和150mEq鈉鹽。液體攝取量每天至少3000ml，并避免飲料中含有咖啡因。也要避免采用相伴的藥物治療。進(jìn)一步地，研究期間受試者不能飲酒吸煙。
研究的12個(gè)受試者，分成三個(gè)試驗(yàn)組。每個(gè)試驗(yàn)組內(nèi)，三個(gè)受試者接受HBOL，一個(gè)作為對(duì)照，接受乳酸林格氏溶液。每個(gè)試驗(yàn)組具有不同的HBOL輸入速率。單盲法實(shí)施該研究，三十天間隔后速率增加研究。
研究的第1天，住院階段期間，每個(gè)受試者具有一個(gè)植入非支配的手的橈動(dòng)脈的小規(guī)格的動(dòng)脈導(dǎo)管。植入的位置以抗菌溶液(乙醇和/或碘)清洗，然后少量1％至2％的利多卡因抗菌溶液隨后注入橈動(dòng)脈位置之上。植入動(dòng)脈導(dǎo)管以監(jiān)控血壓和促進(jìn)血液氣體評(píng)估。一至二小時(shí)后，大孔徑靜脈導(dǎo)管(肘窩需要16規(guī)格)放置在所有受試者一臂的靜脈上。接著每個(gè)受試者在小于15分鐘的時(shí)間內(nèi)以靜脈切開(kāi)術(shù)放出750ml(1.5單位)的全血，然后通過(guò)在2小時(shí)內(nèi)輸入2250ml乳酸林格氏溶液，進(jìn)行等張(isovolemic)血液稀釋。
采用無(wú)菌技術(shù)，接著靜脈輸入45克(346ml)的HBOL，按順序經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)80微米血液濾器、5微米濾器，和臂靜脈上大孔徑的靜脈導(dǎo)管，分別以0.5gm/分鐘、0.75gm/分鐘和1.0gm/分鐘的速率輸入試驗(yàn)組1、2和3的每個(gè)受試者。
同時(shí)，通過(guò)橈動(dòng)脈導(dǎo)管、連續(xù)的肺功能試驗(yàn)、心臟功能評(píng)價(jià)和多種血液學(xué)、化學(xué)以及尿分析實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)入侵性監(jiān)測(cè)每個(gè)受試者，它們開(kāi)始HBOL注入之后在第一個(gè)28小時(shí)之內(nèi)常規(guī)地和通常地實(shí)施。
隨后，門(mén)診階段(2-29天)，放血后頭四天每天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室研究、生命特征、ECGs和醫(yī)療結(jié)果，然后一個(gè)月內(nèi)每周進(jìn)行。
第1天期間，HBOL治療組(輸入之后)血液動(dòng)力學(xué)顯著，心收縮、舒張和平均動(dòng)脈壓高于對(duì)照組。盡管血壓數(shù)據(jù)伴隨患者行動(dòng)(例如，進(jìn)餐或使用浴室期間)和每日的節(jié)奏，具有明顯的可變性，僅第1天期間，HBOL-治療的受試者通常具有高于對(duì)照組的心收縮(大約5-15mmHg)、舒張(大約5-10mmHg)和平均動(dòng)脈壓(大約10mmHg)數(shù)值。8-12小時(shí)之間血壓值趨于達(dá)到峰值效應(yīng)，睡眠和緊接著除去動(dòng)脈導(dǎo)管期間返還至基準(zhǔn)。第1天期間，與對(duì)照組相比，所有HBOL-治療組脈搏搏通常低于10次。在輸入的開(kāi)始15分鐘之內(nèi)，可見(jiàn)脈搏曲線的最低點(diǎn)。24小時(shí)之后所有試驗(yàn)組的值相同。
輸入的第1小時(shí)期間，心臟指數(shù)降至大約1-2l/min/m2并保持相當(dāng)于1l/min/m2，經(jīng)4小時(shí)低于對(duì)照組，接著通過(guò)4小時(shí)恢復(fù)至基準(zhǔn)。在患者活動(dòng)期間，心臟指數(shù)也升高(如上)。
總的外周阻力平行于血液壓力變化，然而，2小時(shí)內(nèi)阻力值返回至基準(zhǔn)。系統(tǒng)血壓瞬間增加伴隨著總的外周阻力的增加以及心臟指數(shù)的下降，這并不是不希望的。聲明在服藥速率和血液動(dòng)力反應(yīng)大小上無(wú)差異以及指出沒(méi)有干預(yù)是重要的。
肺功能試驗(yàn)(包括呼吸量測(cè)定法和肺容量的多次測(cè)定)和動(dòng)脈血液氣體測(cè)量是不顯著的。值得注意的是HBOL-治療組觀察到的增強(qiáng)的擴(kuò)散容量。到24小時(shí)，擴(kuò)散容量10-15％的增長(zhǎng)與對(duì)照組10％的減少相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性。由于所有經(jīng)受放血和血液稀釋的組的數(shù)量，這些發(fā)現(xiàn)特別重要。
在血液學(xué)研究中，其它超出預(yù)料的，伴隨放血和血液稀釋過(guò)程的血紅蛋白、血細(xì)胞比容、紅細(xì)胞數(shù)和血清蛋白質(zhì)瞬間下降，血液學(xué)和血清化學(xué)實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)不顯著的。例外的是血清鐵和鐵蛋白，它們通過(guò)HBOL給藥后6和48小時(shí)分別顯示出峰值。
血清化學(xué)檢測(cè)是不明顯的，除了一個(gè)受試者(#10)之外，它在血清轉(zhuǎn)氨酶和脂酶上有瞬間升高。聲明這些酶升高時(shí)，該受試者沒(méi)有任何伴發(fā)的臨床顯著的醫(yī)療事件(例如，咽下困惑難或腹部疼痛)，這很重要。這些實(shí)驗(yàn)室異常的準(zhǔn)確的病因?qū)W不清楚，但以前的研究表明Oddi氏括約肌或其它的肝膽管和胰腺管系統(tǒng)的部分瞬間亞臨床的痙攣或許會(huì)包括。聲明這些變化是瞬間的(并不伴隨異常的不適)和不帶有明顯的后遺癥，這很重要。受試者#10給藥后膽囊超聲顯示沒(méi)有明顯的變化。
整個(gè)研究中尿的分析不顯著。研究期間未檢測(cè)到受試者的尿血紅蛋白。此外，如預(yù)料到的，肌酸酐的清除率略高，在血液稀釋期間，與蛋白質(zhì)結(jié)合的尿的腺苷脫氨酶、電解質(zhì)(鈉、鉀、氯)、鐵、微鋁、NAG(N-乙?；?β-葡糖基轉(zhuǎn)移酶)和尿的尿素氮不明顯。
作為給藥速率的函數(shù)，觀察到主要的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)沒(méi)有明顯變化。為了尺寸排阻(凝膠過(guò)濾)色譜法(SEC)分析總的血紅蛋白和血紅蛋白片段明顯的分子量，HBOL開(kāi)始輸入之前和之后，收集連續(xù)的血標(biāo)本和蓄積的尿標(biāo)本。僅觀察到離散的血漿二倍體部分濃度，排除了任何藥動(dòng)學(xué)分析。在四聚物體積分布(隨著速率的增高而下降)、四聚物達(dá)到的最大濃度(隨著速率的增高而上升)和四聚物最大濃度產(chǎn)生時(shí)(隨速率的增高而下降)，觀測(cè)到唯一的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性差異(p＜0.05)觀察到的醫(yī)療事件與預(yù)料到的發(fā)現(xiàn)一致，這些發(fā)現(xiàn)與靜脈切開(kāi)術(shù)(例如，血管迷走神經(jīng)發(fā)作)、眾多肺功能試驗(yàn)(吞氣癥、噯氣或腹部“氣體”)、動(dòng)脈管道植入(例如，植入部分疼痛和麻刺感)，或者腹部不適(例如，與鐵補(bǔ)充劑的攝取相關(guān)的)相關(guān)。盡管似乎具有不確定的背景，瞬間腹部“氣體”沒(méi)有明顯的腹部疼痛或咽下困難的情況。此外這些癥狀與血清轉(zhuǎn)氨酶或脂酶的任何選擇無(wú)關(guān)。
總之，HBOL能很好的耐受。血液動(dòng)力學(xué)是不顯著的，盡管輸入的第一個(gè)二小時(shí)期間，伴隨著心臟指數(shù)的等量下降，血壓和總的外周阻力上有小量瞬間升高。首個(gè)24小時(shí)期間，HBOL-治療組擴(kuò)散容量的提高明顯高于對(duì)照組。
所有放血750ml的受試者接著輸入林格氏乳酸鹽(3∶1)和自體輸血(ATX)或45克HBOL。ATX或HBOL以0.5gm/min速率給藥90分鐘。放血之前和ATX或HBOL輸入之后大約45分鐘進(jìn)行自行車(chē)運(yùn)動(dòng)應(yīng)力試驗(yàn)。一周后重復(fù)同樣的方法，并且受試者交換至相對(duì)的治療。
給藥的一天(第1天和第8天)，所有受試者在一個(gè)橈動(dòng)脈具有植入的動(dòng)脈管道，與心窩自動(dòng)測(cè)量記錄傳導(dǎo)和阻抗心動(dòng)描記器聯(lián)接，接著以靜脈切開(kāi)術(shù)放750ml的全血(＜15分鐘)。接著在兩小時(shí)內(nèi)輸入2250ml的林格氏乳酸鹽(RL)(等張(isovolemic)血液稀釋相)。然后受試者接受HBL(90分鐘內(nèi)45克[大約346-360ml]，速率為0.5gm/min)或者ATX(同樣速率和持續(xù)時(shí)間的110-120克血紅蛋白[大約750ml])。在任何一項(xiàng)輸入結(jié)束后大約45分鐘，實(shí)施BEST。在第1天和第8天的24小時(shí)周期，集中地進(jìn)行動(dòng)脈血液氣體、血液學(xué)、化學(xué)和尿試驗(yàn)的系列測(cè)量。在門(mén)診患者的基礎(chǔ)上在給藥和所有給藥結(jié)束之后一個(gè)月之間，重復(fù)系列試驗(yàn)。
HBOL和ATX期間受試者能夠運(yùn)動(dòng)至相同水平。厭氧閾耗氧量(VO2)和二氧化碳生成量(VCO2)基本相同。實(shí)際運(yùn)動(dòng)量在METS、功率、脈搏(作最大脈搏的％)、到達(dá)厭氧閾的時(shí)間、潮氣量(VT)和每分通氣量(VE)方面也相同。HBOL和ATX期間動(dòng)脈血液氣體值相同。乳酸升高時(shí)，pH和碳酸氫鹽的少量下降，這與厭氧閾預(yù)料的發(fā)現(xiàn)一致。這些自行車(chē)試驗(yàn)的結(jié)果顯示運(yùn)動(dòng)能力(定義為達(dá)到厭氧閾的時(shí)間和工作量)在基準(zhǔn)和輸入自體輸血或HBOL之后相同。特別地，在HBOL期間血液動(dòng)力學(xué)顯著，心收縮、舒張和平均動(dòng)脈血壓值輕微升高。通常在第一個(gè)4小時(shí)之內(nèi)，總外周阻力升高，與血壓升高相稱(chēng)。HBOL期心臟指數(shù)下降(-0.5l/min/M2)。HBOL時(shí)期脈搏搏動(dòng)低于ATX時(shí)期大約5-10次。在HBOL研究中可觀察到這些發(fā)現(xiàn)，并且不用臨床關(guān)注。
肺功能試驗(yàn)不明顯，除了ATX和HBOL輸入之后擴(kuò)散容量在基準(zhǔn)上增長(zhǎng)14％之外。ATX和HBOL期間，受試者能夠達(dá)到相同的運(yùn)動(dòng)能力。最大運(yùn)動(dòng)(厭氧閾)期間，兩個(gè)時(shí)期的動(dòng)脈血液氣體測(cè)量相同，但是HBOL期的動(dòng)脈pO2趨于較高。HBOL期血漿乳酸含量低于ATX期。靜止代謝人工測(cè)量表明，HBOL期耗氧量、二氧化碳生成和代謝能量支出大于ATX期。如上述的對(duì)照，約略是一克HBOL對(duì)3克ATX。與關(guān)于VO2和VCO2的觀測(cè)結(jié)合的擴(kuò)散容量表明，每克HBOL比ATXE有更多的氧運(yùn)輸?shù)浇M織水平。通常認(rèn)為擴(kuò)散容量的變動(dòng)直接與血紅蛋白含量相關(guān)，然而，這里顯示，1克的血漿血紅蛋白可提高擴(kuò)散容量，與3克的紅細(xì)胞血紅蛋白差不多。
對(duì)于HBOL期ALT、AST、5′-核苷酸酶、脂酶和肌酸激酶小的、但是瞬間升高的實(shí)驗(yàn)室研究值得注意。尿中無(wú)異常的發(fā)現(xiàn)。
血液學(xué)研究與實(shí)施例5的一致。
觀測(cè)到的醫(yī)療事件與預(yù)料的發(fā)現(xiàn)一致，這些發(fā)現(xiàn)與放血(例如，血管迷走神經(jīng)發(fā)作)、多個(gè)肺功能試驗(yàn)(噯氣或腹部“氣體”)、動(dòng)脈管道植入(例如，植入部分疼痛和麻刺感)，或者一個(gè)月期間內(nèi)在普通受度者上可能觀察到的眾多日常疾病(例如，頭痛、上呼吸道感染或感冒)相關(guān)。具有腹部“氣體”和中-上腹部壓力，但沒(méi)有咽下困難的受試者(受試者#105)，是暗示有其它的在先前的HBOL研究中觀察到的胃腸疾病?；谘t蛋白可干擾內(nèi)源性的一氧化氮功能(一氧化氮是松弛胃腸平滑肌固有的，特別是在食管和腸)，L-精氨酸用作治療措施。L-精氨酸是一氧化氮合酶制備一氧化氮的反應(yīng)物。理論上，如果人來(lái)自血紅蛋白(血紅素大概與一氧化氮結(jié)合)的一氧化氮減少，L-精氨酸的給藥會(huì)是有效的。顯然，通過(guò)以L-精氨酸暫時(shí)減輕其癥狀大約兩小時(shí)，標(biāo)記該受試者。這是未預(yù)料的發(fā)現(xiàn)，因?yàn)檠獫{L-精氨酸的半衰期是大約1小時(shí)。不幸地，一些副作用(惡心和嘔吐)發(fā)生，停止輸液。我們選擇給予他兩倍劑量的抗膽堿能的、鎮(zhèn)痙藥，莨菪堿。給藥顯然持續(xù)至消除腹部“氣體”和壓力癥狀。該受試者沒(méi)有進(jìn)一步的疾病或后遺癥。
總之，HBOL有助于運(yùn)動(dòng)和休息期間氧運(yùn)輸和利用的提高。HBOL產(chǎn)生相同的血液動(dòng)力學(xué)光譜、安全的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果、藥動(dòng)學(xué)和預(yù)先觀察到的醫(yī)療事件。L-精氨酸的參予可產(chǎn)生反轉(zhuǎn)的胃腸癥狀，但是它的使用限于反胃和嘔吐。然而，遇到胃腸道癥狀時(shí)，抗膽堿能的治療是有價(jià)值的。等同的方案僅僅采用常規(guī)試驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到或者能確定這里描述的本發(fā)明的特定實(shí)施方案的許多的等同方案。這些和所有其它的等同方案都被包括在下列的權(quán)利要求范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種制備純化血紅蛋白的方法，包括以下步驟a)血紅蛋白溶液裝入一種陰離子交換色譜柱；和b)向該柱中注入至少一種三(羥基甲基)氨基甲烷醋酸鹽緩沖溶液，所述的緩沖溶液的pH低于色譜柱的pH，由此，純化的血紅蛋白產(chǎn)品從該柱洗脫。
2.權(quán)利要求1的方法，其中向該柱中循序的注入至少二種三(羥基甲基)氨基甲烷醋酸鹽緩沖溶液，每種所述的緩沖溶液pH不同，由此該柱接受梯級(jí)pH梯度洗脫。
3.權(quán)利要求2的方法，其中在血紅蛋白產(chǎn)品洗脫之前，該柱以至少一種所述的三(羥基甲基)氨基甲烷醋酸鹽緩沖溶液飽和。
4.權(quán)利要求3的方法，其中在大約8.2至大約8.6的之間pH范圍飽和該柱。
5.權(quán)利要求4的方法，其中在所述的緩沖溶液注入之前，該柱被以大于大約8.7的pH給予初始飽和。
6.權(quán)利要求5的方法，其中的所述色譜柱的初始飽和采用三(羥基甲基)氨基甲烷醋酸鹽緩沖液。
7.權(quán)利要求6的方法，其中初始飽和的pH范圍為大約8.7和大約10.0之間。
8.權(quán)利要求7的方法，其中初始飽和的pH范圍為大約8.7和大約9.3之間。
9.權(quán)利要求8的方法，其中初始飽和的pH范圍為大約8.9和大約9.1之間。
10.權(quán)利要求4的方法，其中在所述的柱飽和期間，至少十一柱空隙體積的緩沖溶液注入該色譜柱。
11.權(quán)利要求10的方法，其中在大約8.2和大約8.4之間的pH范圍飽和。
12.權(quán)利要求11的方法，其中的血紅蛋白產(chǎn)品以pH范圍為大約6.5和大約7.5之間的緩沖液洗脫。
13.一種制備純化血紅蛋白產(chǎn)品的方法，包括下列步驟a)血紅蛋白溶液裝入一種陰離子交換色譜柱，所述的負(fù)荷柱被初始飽和至大于大約8.7的pH；和b)向該柱中注入至少一種緩沖溶液，所述的緩沖溶液的pH低于大約8.6，由此，純化的血紅蛋白產(chǎn)品從該柱洗脫。
14.權(quán)利要求13的方法，其中初始飽和的pH范圍為大約8.7和大約10.0之間。
15.權(quán)利要求14的方法，其中初始飽和的pH范圍為大約8.7和大約9.3之間。
16.權(quán)利要求15的方法，其中初始飽和的pH范圍為大約8.9和大約9.1之間。
17.權(quán)利要求16的方法，其中色譜柱以三(羥基甲基)氨基甲烷醋酸鹽初始飽和。
18.權(quán)利要求17的方法，其中向該柱中循序的注入至少二種pH低于大約8.6的三(羥基甲基)氨基甲烷醋酸鹽緩沖溶液，每種所述的緩沖溶液pH不同，由此該柱接受梯級(jí)pH梯度洗脫。
19.權(quán)利要求18的方法，其中在血紅蛋白產(chǎn)品洗脫之前，該柱以至少一種所述的三(羥基甲基)氨基甲烷醋酸鹽緩沖溶液飽和。
20.權(quán)利要求19的方法，其中在大約8.2和大約8.6之間的pH范圍飽和色譜柱。
21.權(quán)利要求20的方法，其中在所述的柱飽和期間，至少十一柱空隙體積的緩沖溶液注入該色譜柱。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述的飽和pH范圍在大約8.2和大約8.4之間。
23.權(quán)利要求22的方法，其中的血紅蛋白產(chǎn)品以pH范圍為大約6.5和大約7.5之間的緩沖液洗脫。
24.一種制備純化血紅蛋白產(chǎn)品的方法，包括下列步驟a)血紅蛋白溶液裝入一種陰離子交換色譜柱；b)向該柱注入至少十一柱空隙體積的飽和用的緩沖溶液，該溶液pH范圍在大約8.2和8.6之間；和c)向該柱注入pH低于飽和用緩沖溶液的pH的緩沖溶液，由此，純化的血紅蛋白產(chǎn)品從該柱洗脫。
25.權(quán)利要求24的方法，其中飽和用緩沖溶液的pH大約為8.3。
26.權(quán)利要求24的方法，其中的緩沖溶液是三(羥基甲基)氨基甲烷醋酸鹽。
27.權(quán)利要求26的方法，其中向該柱中循序的注入至少二種三(羥基甲基)氨基甲烷醋酸鹽緩沖溶液，每種所述的緩沖溶液pH不同，由此該柱接受梯級(jí)pH梯度洗脫。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述的緩沖溶液注入之前，在pH大于大約8.7時(shí)開(kāi)始飽和該柱。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述色譜柱的初始飽和采用三(羥基甲基)氨基甲烷醋酸鹽緩沖液。
30.權(quán)利要求29的方法，其中初始飽和的pH范圍為大約8.7和大約10.0之間。
31.權(quán)利要求30的方法，其中初始飽和的pH范圍為大約8.7和大約9.3之間。
32.權(quán)利要求31的方法，其中初始飽和的pH范圍為大約8.9和大約9.1之間。
33.權(quán)利要求32的方法，其中的血紅蛋白產(chǎn)品在大約6.5和大約7.5之間的pH范圍洗脫。
34.一種制備純化血紅蛋白產(chǎn)品的方法，包括下列步驟a)血紅蛋白溶液裝入一種陰離子交換色譜柱，所述的負(fù)荷柱被初始飽和至大于大約8.7的pH；和b)向該柱注入至少十一柱空隙體積的飽和用的緩沖溶液，該溶液pH范圍在大約8.2和8.6之間；和c)向該柱中注入至少一種三(羥基甲基)氨基甲烷醋酸鹽緩沖溶液，所述的緩沖溶液的pH低于大約8.2，由此，純化的血紅蛋白產(chǎn)品從該柱洗脫。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述色譜柱的初始飽和采用三(羥基甲基)氨基甲烷醋酸鹽緩沖液。
36.權(quán)利要求35的方法，其中初始飽和的pH范圍為大約8.7和大約10.0之間。
37.權(quán)利要求36的方法，其中初始飽和的pH范圍為大約8.7和大約9.3之間。
38.權(quán)利要求37的方法，其中初始飽和的pH范圍為大約8.9和大約9.1之間。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述的飽和用緩沖溶液pH范圍在大約8.2至大約8.4之間。
40.權(quán)利要求39的方法，其中的血紅蛋白產(chǎn)品以pH范圍為大約6.5和大約7.5之間的緩沖液洗脫。
41.權(quán)利要求34的方法，其中的色譜柱填充一種離子交換介質(zhì)。
42.權(quán)利要求41的方法，其中的離子交換介質(zhì)選自由含有胺—或銨—的硅膠、鋁氧化鋁凝膠、二氧化鈦凝膠、交聯(lián)的葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、聚羥基乙基—甲基丙烯酸或苯乙烯二乙烯基苯組成的基團(tuán)。
43.權(quán)利要求42的方法，其中的陰離子交換介質(zhì)是含有氨或銨的硅膠。
44.權(quán)利要求34的方法，其中的純化的血紅蛋白產(chǎn)品包括小于每毫升0.5單位的內(nèi)毒素、小于3.3nmoles/ml的磷脂和基本上不含有非血紅蛋白的蛋白質(zhì)。
全文摘要
一種制備純化血紅蛋白產(chǎn)品的方法,包括將血紅蛋白溶液裝入一種陰離子交換色譜柱。至少一種三(羥基甲基)氨基甲烷醋酸鹽緩沖溶液注入該柱。該緩沖溶液的pH低于色譜柱的pH,由此純化的血紅蛋白產(chǎn)品從該柱洗脫。在一項(xiàng)實(shí)施方案中,血紅蛋白溶液在pH大于大約8.7時(shí)開(kāi)始飽和。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中,通過(guò)以至少大約十一柱空隙體積的緩沖溶液,在大約8.2和大約8.6之間的中間pH,因此形成梯級(jí)pH梯度,清除雜質(zhì)。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中,采用的所有緩沖液是三(羥基甲基)氨基甲烷醋酸鹽。
文檔編號(hào)A01N1/02GK1308636SQ99808286
公開(kāi)日2001年8月15日 申請(qǐng)日期1999年6月21日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月10日
發(fā)明者羅伯特·A·克特陳斯, 卡爾·W·羅斯切 申請(qǐng)人:柏爾純公司