專利名稱：：用于測定糖化血紅蛋白百分比的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：發(fā)明提供用于確定血液樣品中糖化血紅蛋白百分比的直接酶促測定。
背景技術(shù)：
：糖化蛋白質(zhì)是由構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸的氨基和還原糖，諸如醛糖的醛基的非-酶促和不可逆結(jié)合產(chǎn)生的物質(zhì)。參見，例如，美國專利號6,127,138。這樣的非-酶促和不可逆結(jié)合反應(yīng)也叫做"阿馬道里重排"，且因此上述糖化蛋白質(zhì)在一些情形中也可以叫做"阿馬道里化合物"。蛋白質(zhì)的非酶促糖化已經(jīng)參與在某些疾病，例如糖尿病并發(fā)癥和衰老過程中(Takahashi等，生物的化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.),272(19):12505-7(1997);和Baynes和Monnier,臨床生物學(xué)研究進(jìn)展(Prog.Clin.Biol.Res.),304:1-410(1989))。該反應(yīng)通過形成糖加合物和交聯(lián)，導(dǎo)致靶分子的功能異常。相當(dāng)多的興趣集中于阿馬道里產(chǎn)物，即在體外和體內(nèi)非酶促糖化過程中最重要的"早期"修飾。己知多種關(guān)于糖化蛋白質(zhì)的測定。例如，美國專利號6,127,138公開了用蛋白酶XIV或來自曲霉屬(A^e一//^的蛋白酶處理包含糖化蛋白質(zhì)的樣品，其后(或在用上述蛋白酶處理樣品的同時)引起FAOD(果糖基(fructosyl)氨基酸氧化酶)與該樣品反應(yīng)，從而測量由FAOD反應(yīng)消耗的氧量或由此生成的反應(yīng)產(chǎn)物量，由此測量糖化蛋白質(zhì)。在另一個實例中，美國專利號6，008，006公開了樣品中糖化蛋白質(zhì)的量能夠通過使該樣品首先與試劑，即蛋白酶和過氧化物酶組合物反應(yīng)，并其次與酮胺氧化酶反應(yīng)而得到量化。美國專利號6,008,006還公開了包含組合的過氧化物酶/蛋白酶酶試劑和還有酮胺氧化酶的試劑盒。美國公開號2005/0014935還公開了利用嵌合阿馬道里酶(amadoriase)測量糖化蛋白質(zhì)的量的方法。美國公開號2003/0162242和EP1304385Al還公開了選擇性確定糖化血紅蛋白的方法。先前描述的用于確定糖化血紅蛋白Alc百分比的方法需要單獨測量樣品中的總血紅蛋白。當(dāng)使用化學(xué)分析器來確定糖化血紅蛋白Alc百分比數(shù)值時，需要雙通道形式。在該形式中，進(jìn)行了兩個分別的測定，從而確定樣品中1)糖化血紅蛋白Alc的濃度，和2)總血紅蛋白濃度；并且隨后計算糖化HbAlc與總血紅蛋白的比，從而獲得HbAlc的百分比。將本文引用的所有專利、專利申請、和出版物作為整體引入本文作為參考。發(fā)明概述本發(fā)明提供在不需要單獨測量血液樣品中總血紅蛋白的條件下，直接確定該樣品中糖化血紅蛋白百分比的方法。由于不需要單獨測量總血紅蛋白且不需要比率計算步驟，所以本方法能夠是全自動化的，并能夠與處于單通道形式的不同化學(xué)分析器一起使用。在一個方面，本發(fā)明提供在不以單獨的過程測量血液樣品中總血紅蛋白的條件下，直接測定該血液樣品中總糖化血紅蛋白百分比或糖化血紅蛋白Alc百分比的方法，所述方法包括a)使包含糖化肽或糖化氨基酸的蛋白質(zhì)片段與果糖基氨基酸氧化酶相接觸，從而產(chǎn)生過氧化氫(H202)，其中所述蛋白質(zhì)片段是通過使所述血液樣品與下列各項相接觸而產(chǎn)生的1)從血液樣品中的紅細(xì)胞中釋放血紅蛋白的溶解緩沖劑；2)選擇性氧化低分子量還原物質(zhì)的第-一氧化劑；3)選擇性氧化高分子量還原物質(zhì)的第二氧化劑，和4)將糖化血紅蛋白消化為糖化肽或糖化氨基酸的蛋白酶；b)在過氧化物酶存在下，使在步驟a)中產(chǎn)生的1€202與顏色形成物質(zhì)相接觸，從而產(chǎn)生可測量的信號；和c)在不單獨測量所述血液樣品中總血紅蛋白的條件下，通過將步驟b)中產(chǎn)生的信號應(yīng)用于校準(zhǔn)曲線來確定所述樣品中總糖化血紅蛋白的百分比或糖化血紅蛋白Alc的百分比。在一些實施方案中，所述第一氧化劑是戴斯-馬丁氧化劑(Dess-Martinperiodinane)或N-乙基馬來酰亞胺，且其中所述第二氧化劑是四唑鎗鹽。在一些實施方案中，所述溶解緩沖劑含有所述第一氧化劑和/或所述第二氧化劑。在一些實施方案中，所述溶解緩沖劑含有所述第一氧化劑、所述第二氧化劑、和所述蛋白酶。在一些實施方案中，所述溶解緩沖劑含有所述蛋白酶。在一些實施方案中，在單一組合物中配制所述第一氧化劑和所述第二氧化劑。在一些實施方案中，在分別的組合物中配制所述第一氧化劑和所述第二氧化劑。在一些實施方案中，在單一組合物中配制所述蛋白酶和所述第一氧化劑或所述第二氧化劑。在一些實施方案中，在單一組合物中配制所述第一氧化劑、所述第二氧化劑、和所述蛋白酶。在一些實施方案中，在單一組合物中配制所述果糖基氨基酸氧化酶、所述過氧化物酶、和所述顏色形成物質(zhì)。在另一方面，本發(fā)明提供在不以單獨的過程測量血液樣品中總血紅蛋白的條件下，直接測定該血液樣品中總糖化血紅蛋白百分比或糖化血紅蛋白Alc百分比的方法，所述方法包括a)使包含糖化肽或糖化氨基酸的蛋白質(zhì)片段與果糖基氨基酸氧化酶相接觸，從而產(chǎn)生過氧化氫(H202)，其中所述蛋白質(zhì)片段是通過使所述血液樣品與下列各項相接觸而產(chǎn)生的1)從血液樣品中的紅細(xì)胞中釋放血紅蛋白的溶解緩沖劑；2)氧化劑，即四哇鐵鹽，和3)將糖化血紅蛋白消化為糖化肽或糖化氨基酸的蛋白酶；b)在過氧化物酶存在下，使在步驟a)中產(chǎn)生的&02與顏色形成物質(zhì)相接觸，從而產(chǎn)生可測量的信號；和c)在不單獨測量所述血液樣品中總血紅蛋白的條件下，通過將步驟b)中產(chǎn)生的信號應(yīng)用于校準(zhǔn)曲線來確定所述樣品中總糖化血紅蛋白的百分比或糖化血紅蛋白Alc的百分比。在--些實施方案中，所述溶解緩沖劑包含所述氧化劑。在一些實施方案中，所述溶解緩沖劑包含所蛋白酶。在一些實施方案中，在單一組合物9中配制所氧化劑和所述蛋白酶。在一些實施方案中，四唑鎗鹽是2-(4-碘苯基)-3-(2,4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑錄單鈉鹽或2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎗單鈉鹽。在一些實施方案中，所述顏色形成物質(zhì)是N-羧甲基氨基羰基-4，4'-雙(二甲氨基)-二苯胺鈉鹽(DA-64)、N,N,N'N',N",N"-六(3-磺基丙基)-4，4'，4V三氨基-三苯甲垸六鈉鹽(TPM-PS)、或10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-雙(二甲氨基)-吩噻嗪鈉鹽(DA-67)。在一些實施方案中，所述血液樣品是全血或收集的血細(xì)胞。在--些實施方案中，所述蛋白酶是內(nèi)-型蛋白酶或外-型蛋白酶。在一些實施方案中，所述蛋白酶是選自由下列各項組成的組蛋白酶K、鏈霉蛋白酶E、ananine、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶和牛胰蛋白酶。在一些實施方案中，所述蛋白酶是曲霉屬或桿菌屬(Bacillus)來源的中性蛋白酶。在一些實施方案中，所述蛋白酶產(chǎn)生約2-約30個氨基酸殘基的糖化肽。在一些實施方案中，所述蛋白酶產(chǎn)生糖化甘氨酸、糖化纈氨酸或糖化賴氨酸殘基、或包括糖化甘氨酸、糖化纈氨酸或糖化賴氨酸殘基的糖化肽。在一些實施方案中，所述過氧化物酶是辣根過氧化物酶。在一些實施方案中，所述包含糖化肽或糖化氨基酸的蛋白質(zhì)片段依次或同時與果糖基氨基酸氧化酶和過氧化物酶接觸。在一些實施方案中，所述在一些實施方案中，所述果糖基氨基酸氧化酶包括SEQIDN0:1中所示的氨基酸序列SAGNDVNKVISSGQYSNNKDEIEVNEILAEEAFNGWKNDPLFKPYYHDTGLLMSACSQEGLDRLCJVRVKPGEDPNLVELTRPEQFRKLAPEGVLQGDFPGWKGYFARSGAGWTFLCAGASAGQFLDFKNQLRPTAWTLVH1ALKPEERALYKNIPVIFNIERGFFFEPDEERGEIKICDEHPGYTNMVQSADGTMMSlPFEKTQIPKEAETRVRAIXKETiyEPQLADRPQKIHEUKWNPDIAANRNWKDTLGRFGGPNRVMDFHDVKEWTNrVQYRDISKLKGELEGLPIPNPLLRTGHHHHHH)。在一些實施方案中，本方法用于疾病或病癥的預(yù)后或治療。在一些實施方案中，所述疾病或病癥是糖尿病。在另一方面，本發(fā)明提供在不需要單獨測量血液樣品中總血紅蛋白含量的條件下，直接測定血液樣品中總糖化血紅蛋白百分比或糖化血紅蛋白Alc百分比的試劑盒，所述試劑盒包括a)溶解血細(xì)胞從而釋放血紅蛋白的溶解緩沖劑；b)選擇性氧化低分子量還原物質(zhì)的第一氧化劑；C)選擇性氧化高分子量還原物質(zhì)的第二氧化劑；d)將血紅蛋白水解為包括糖化肽或糖化氨基酸的蛋白質(zhì)片段的蛋白酶；e)與糖化肽和糖化氨基酸反應(yīng)從而產(chǎn)生過氧化氫(&02)的果糖基氨基酸氧化酶；f)過氧化物酶和顏色形成物質(zhì);和g)具有已知糖化血紅蛋白百分比或已知糖化血紅蛋白Alc百分比、用于構(gòu)建校準(zhǔn)曲線的校準(zhǔn)物。所述試劑盒還可以包括實施本文所述方法的操作指南。在一些實施方案中，所述第一氧化劑和/或所第二氧化劑包含在溶解緩沖劑中。在一些實施方案中，所述第一氧化劑和/或所述第二氧化劑與所述蛋白酶包含在同一緩沖劑中。在另一方面，本發(fā)明提供在不需要單獨測量血液樣品中總血紅蛋白含量的條件下，直接測定血液樣品中總糖化血紅蛋白百分比或糖化血紅蛋白Alc百分比的試劑盒，所述試劑盒包括a)溶解血細(xì)胞從而釋放血紅蛋白的溶解緩沖劑；b)氧化劑，其中所述氧化劑是四唑鎗鹽；c)將血紅蛋白水解為包括糖化肽或糖化氨基酸的蛋白質(zhì)片段的蛋白酶；d)與糖化肽和糖化氨基酸反應(yīng)從而產(chǎn)生過氧化氫(&02)的果糖基氨基酸氧化酶；e)過氧化物酶和顏色形成物質(zhì);和f)具有已知糖化血紅蛋白百分比或已知糖化血紅蛋白Alc百分比、用于構(gòu)建校準(zhǔn)曲線的校準(zhǔn)物。所述試劑盒還可以包括實施本文所述方法的操作指南。在一些實施方案中，所述氧化劑包含在所述溶解緩沖劑中。在一些實施方案中，所述蛋白酶包含在所述溶解緩沖劑中。在一些實施方案中，在單一組合物中配制所述氧化劑和所述蛋白酶。附圖簡述圖1顯示單通道HbAlc酶促測定程序的時間線。圖2顯示酶HbAlc測定的校準(zhǔn)曲線。X-軸顯示對校準(zhǔn)樣品已知的糖化血紅蛋白Alc百分比；和Y-軸顯示加入試劑Rla和Rib后8分鐘和5分鐘之間，在700nm處吸收數(shù)值的相應(yīng)差別。圖3顯示實施例1中所述的單通道酶促血紅蛋白Alc測定和TosohHPLC方法之間的相關(guān)性。Y軸顯示利用實施例1中所述的單通道酶促血紅蛋白Alc測定對樣品測量的HbAlc值；和X-軸顯示利用TosohHPLC方法對相應(yīng)樣品測量的HbAlc值。圖4顯示利用實施例2中所述的一種氧化劑進(jìn)行酶促HbAlc測定的校準(zhǔn)曲線。X-軸顯示對校準(zhǔn)樣品己知的糖化血紅蛋白百分比；和Y-軸顯示加入試劑Rla和Rlb后8分鐘和5分鐘之間，在700nm處吸收數(shù)值的相應(yīng)差別。發(fā)明詳述本發(fā)明提供在不需要單獨測量血液樣品中總血紅蛋白含量的條件下，直接確定血液樣品中糖化血紅蛋白百分比的酶方法。在一個方面中，本方法使用兩種不同類型的氧化劑，所述氧化劑選擇性氧化血液樣品中的低分子量還原物質(zhì)(主要是抗壞血酸和游離的含硫的分子)和高分子量還原物質(zhì)(主要是血紅蛋白)，伴隨由蛋白酶、果糖基氨基酸氧化酶、和過氧化物酶催化的酶反應(yīng)。在另一方面，本方法使用一種類型的氧化劑，所述氧化劑選擇性氧化血液樣品中的高分子量還原物質(zhì)，伴隨由蛋白酶、果糖基氨基酸氧化酶、和過氧化物酶催化的酶反應(yīng)。本發(fā)明還提供用于實施本發(fā)明方法的試劑盒。A.定義除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中普通技術(shù)人員的通常理解相同的含義。將本文提及的所有專利、申請、公布的申請和其他出版物作為整體引入本文作為參考。如果本部分中提出的定義與作為參考引入本文中的專利、申請、公布的申請和其他出版物中提出的定義相反或不一致，則本部分中提出的定義優(yōu)于作為參考引入本文中的定義。12當(dāng)用于本文時，"一個"("a"或"an")意指"至少一個"或"-.個或多個"。當(dāng)用于本文時，"果糖基氨基酸氧化酶"或(FAOD)指催化阿馬道里產(chǎn)物的氧化去糖化以產(chǎn)生相應(yīng)的氨基酸、葡糖醛酮、和&02的酶，如下列反應(yīng)中所示R廣CO-CH2-NH-R2+02+H20—>R廣CO-CHO+R2-NH2+H202其中Rl表示還原糖的醛糖殘基，和R2表示氨基酸、蛋白質(zhì)或肽殘基。阿馬道里酶的其他同義詞包括阿馬道里酶、果糖基胺:氧氧化還原酶(FAOO)、和果糖基纈氨酸氧化酶(FVO)。為了本文的目的，盡管考慮了所有這樣的化學(xué)同義詞，但是在本文中使用了名稱"果糖基氨基酸氧化酶"。"果糖基氨基酸氧化酶"還包括仍基本保持其酶活性的功能性片段或衍生物，所述酶活性催化阿馬道里產(chǎn)物的氧化去糖化產(chǎn)生相應(yīng)的氨基酸、葡糖醛酮、和H202。典型地，功能性片段或衍生物保持至少50%的它的阿馬道里酶活性。優(yōu)選地,功能性片段或衍生物保持至少60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的它的阿馬道里酶活性。還預(yù)期了果糖基氨基酸氧化酶能夠包括基本不改變其活性的保守氨基酸取代。合適的保守氨基酸取代是本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的，并且可以在通常不改變由此生成的分子的生物學(xué)活性的條件下進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員承認(rèn)，通常多肽中非關(guān)鍵區(qū)域中的單氨基酸取代基本不改變生物學(xué)活性(見，例如Watson,等，基因的分子生物學(xué)(MolecularBiologyoftheGene),第4版，1987,TheBenjamin/Cummings出版公司，第224頁)。這樣的示范性取代優(yōu)選地是按照如下表1中所示的那些進(jìn)行的-.表l原始?xì)埢Ｊ厝〈鶤la(A)Gly;SerArg(R)LysAsn(N)Gin;HisCys(C)SerGin(Q)Asn13Glu(E)AspGly(G)Ala;ProHis問Asn;GinHe(I)Leu;ValLeu(L)lie;ValLys(K)Arg;Gin;GluMet(M)Leu;Tyr;liePhe(F)Met;Leu;TyrSer(S)ThrThr(T)SerTrp(W)TyrTyr(Y)Trp;PheVal(V)lie;Leu其他取代也是允許的，并且可以以經(jīng)驗或按照已知保守取代來確定其他取代。當(dāng)用于本文時，"過氧化物酶"指催化許多這樣的反應(yīng)的酶，在所述反應(yīng)中，過氧化氫是特異性氧化劑，且廣泛范圍的物質(zhì)起電子供體的作用。其意欲包括具有基本不改變其活性的保守氨基酸取代的過氧化物酶。主要的可商購過氧化物酶是辣根過氧化物酶。當(dāng)用于本文時，"組合物"指兩種或多種產(chǎn)物或化合物的任意混合。它可以是溶液、混懸液、液體、粉末、糊劑、水性、非水性、或它們的任意組合。B.直接測定糖化血紅蛋白百分比的方法在一個方面中，本發(fā)明提供在不以單獨的過程測量血液樣品中總血紅蛋白的條件下，直接測定血液樣品中總糖化血紅蛋白百分比或糖化血紅蛋白Ale百分比的方法，所述方法包括a)使包含糖化肽或糖化氨基酸的蛋白質(zhì)片段與果糖基氨基酸氧化酶相接觸，從而產(chǎn)生過氧化氫(H202)，其中所述蛋白質(zhì)片段是通過使所述血液樣品與下列各項相接觸而產(chǎn)生的1)從血液樣品中的紅細(xì)胞中釋放血紅蛋白的溶解緩沖劑；2)選擇性氧化低分子量還原物質(zhì)的第一氧化劑；3)選擇性氧化高分子量還原物質(zhì)的第二氧化劑，和4)將糖化血紅蛋白消化為糖化肽或糖化氨基酸的蛋白酶；b)在過氧化物酶存在下，使在步驟a)中產(chǎn)生的^02與顏色形成物質(zhì)相接觸，從而產(chǎn)生可測量的信號；和c)在不單獨測量所述血液樣品中總血紅蛋白的條件下，通過將步驟b)中產(chǎn)生的信號應(yīng)用于校準(zhǔn)曲線來確定所述樣品中總糖化血紅蛋白的百分比或糠化血紅蛋白Alc的百分比。在另--方面，本發(fā)明涉及用于直接測定總糖化血紅蛋白百分比或糖化血紅蛋白Alc百分比的方法，所述方法包括a)用溶解緩沖劑溶解血液樣品中的紅細(xì)胞，從而釋放血紅蛋白；b)用第一氧化劑氧化溶解產(chǎn)物，所述第一氧化劑選擇性氧化低分子量還原物質(zhì)；c)用第二氧化劑氧化溶解產(chǎn)物，所述第二氧化劑選擇性氧化高分子量還原物質(zhì)；d)使所述溶解產(chǎn)物與蛋白酶相接觸，從而形成包含糖化肽和/或糖化氨基酸的蛋白質(zhì)片段；e)使所述蛋白質(zhì)片段與果糖基氨基酸氧化酶相接觸，從而產(chǎn)生過氧化氫(H202);f)容許通過在Trinder反應(yīng)下，在過氧化物酶存在下，步驟e)中生成的H202，和通過未反應(yīng)的第二氧化劑氧化顏色形成物質(zhì)，從而產(chǎn)生可測量的信號;和g)評估步驟f)中生成的信號；和h)在不單獨測量所述血液樣品中總血紅蛋白的條件下，通過將所述信號與校準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，確定該樣品中的總糖化血紅蛋白的百分比或糖化血紅蛋白Alc的百分比。在另一方面，本發(fā)明提供在不單獨測定血液樣品中總血紅蛋白的條件下，直接測定總糖化血紅蛋白百分比或糖化血紅蛋白Alc百分比的方法,所述方法包括a)用溶解緩沖劑溶解血液培養(yǎng)中的紅細(xì)胞，從而釋放血紅蛋白；b)用第一氧化劑氧化溶解產(chǎn)物，其中所述第一氧化劑是戴斯-馬丁氧化劑和/或N-乙基馬來酰亞胺；c)用第二氧化劑氧化溶解產(chǎn)物，其中所述第二氧化劑是四唑鎗鹽；d)使溶解產(chǎn)物與蛋白酶相接觸，從而形成包含糖化肽和/或糖化氨基酸的蛋白質(zhì)片段；e)使所述蛋白質(zhì)片段與果糖基氨基酸氧化酶相接觸，從而產(chǎn)生過氧化氫(H202);f)容許通過在Trinder反應(yīng)下，在過氧化物酶存在下，步驟e)中生成的&02氧化顏色形成物質(zhì)，從而產(chǎn)生可測量的信號;和g)評估步驟f)中生成的信號；和h)在不單獨測量所述血液樣品中總血紅蛋白的條件下，通過將所述信號與校準(zhǔn)曲線進(jìn)行15比較，確定在該樣品中總糖化血紅蛋白的百分比或糖化血紅蛋白Alc的百分比。所述血液樣品可以被所述第一氧化劑溶解、氧化，被所述第二氧化劑氧化，且所述溶解產(chǎn)物被所述蛋白酶同時或通過單獨的步驟裂解?？梢酝瑫r進(jìn)行兩個或更多步驟的任意組合。在一些實施方案中,包括下列各項的歩驟同時進(jìn)行溶解樣品中紅細(xì)胞和通過第一氧化劑氧化，溶解紅細(xì)胞和由第二氧化劑氧化，用第-一氧化劑和第二氧化劑氧化，或溶解紅細(xì)胞和用第一氧化劑和第二氧化劑氧化。在一些實施方案中，同時進(jìn)行包括下列各項的步驟溶解紅細(xì)胞和由蛋白酶裂解溶解產(chǎn)物，用第一氧化劑氧化和由蛋白酶裂解溶解產(chǎn)物，用第二氧化劑氧化和由蛋白酶裂解溶解產(chǎn)物，或用第一氧化劑和第二氧化劑氧化和由蛋白酶裂解溶解產(chǎn)物。在一些實施方案中，同時進(jìn)行包括溶解紅細(xì)胞，用第一氧化劑和第二氧化劑氧化，和裂解溶解產(chǎn)物的步驟。在一些實施方案中，所述第一氧化劑和/或所述第二氧化劑包含在溶解緩沖劑中，或與加入所述溶解緩沖劑同時被加入到血液樣品中。在一些實施方案中，所述蛋白酶也包含在具有第一和第二氧化劑的溶解緩沖劑中，或與加入溶解緩沖劑和第一和第二氧化劑的同時被加入到血液樣品中。在一些實施方案中，所述第一和/或所述第二氧化劑在被加入到紅細(xì)胞溶解產(chǎn)物中之前，與蛋白酶溶液處于同一溶液中。在一些實施方案中，在單一組合物中配制所述第一氧化劑和溶解緩沖劑。在一些實施方案中，在單一組合物中配制所述蛋白酶和所述第一氧化劑或所述第二氧化劑。在一些實施方案中,在單--組合物中配制所述第一和所述第二氧化劑。在一些實施方案中，在分別的組合物中配制所述第一和所述第二氧化劑。在一些實施方案中，所述溶解緩沖劑含有蛋白酶,或所述蛋白酶在加入溶解緩沖劑的同時被加入到血液樣品中。所述第一氧化劑這樣的氧化劑類型，其選擇性氧化低分子量(M.W.<3000)還原物質(zhì)。所述第一氧化劑針對低分子量還原物質(zhì)具有比針對高分子量(M.W.>3000)還原物質(zhì)更高的氧化能力。血液樣品中低分子量物質(zhì)的實例是抗壞血酸和游離的含硫的分子。第一氧化劑的實例是戴斯-馬丁氧化劑和N-乙基馬來酰亞胺。第一氧化劑的其他實例是碘乙酸鈉、高碘酸鈉、和氯胺-T。在一些實施方案中，使用多于一種的第一氧化劑(例如，戴斯-馬丁氧化劑和N-乙基馬來酰亞胺二者)。所述第二氧化劑這樣的氧化劑類型，其選擇性氧化高分子量(M.W.>3000)還原物質(zhì)。所述第二氧化劑針對高分子量還原物質(zhì)具有比針對低分子量還原物質(zhì)更高的氧化能力。血液樣品中高分子量物質(zhì)的實例是血紅蛋白。第二氧化劑的實例是四唑錄鹽(例如，2-(4-碘苯基)-3-(2,4-二硝基苯基>5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鑰單鈉鹽、或2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑錄單鈉鹽)。第二氧化劑的其他實例是十二垸基硫酸鈉、鐵氰化鉀(m)、和碘酸鉀。在一些實施方案中，使用多于一種的第二氧化劑。在另一方面，本發(fā)明提供在不以單獨的過程測量血液樣品中總血紅蛋白的條件下，直接測定血液樣品中總糖化血紅蛋白百分比或糖化血紅蛋白Alc百分比的方法，所述方法包括a)使包含糖化肽或糖化氨基酸的蛋白質(zhì)片段與果糖基氨基酸氧化酶相接觸，從而產(chǎn)生過氧化氫(H202)，其中所述蛋白質(zhì)片段是通過使所述血液樣品與下列各項相接觸而產(chǎn)生的1)從血液樣品中的紅細(xì)胞中釋放血紅蛋白的溶解緩沖劑；2)氧化劑，即四唑鑰鹽，和3)將糖化血紅蛋白消化為糖化肽或糖化氨基酸的蛋白酶；b)在過氧化物酶存在下，使在步驟a)中產(chǎn)生的&02與顏色形成物質(zhì)相接觸，從而產(chǎn)生可測量的信號；和c)在不單獨測量所述血液樣品中總血紅蛋白的條件下，通過將步驟b)中產(chǎn)生的信號應(yīng)用于校準(zhǔn)曲線來確定所述樣品中總糖化血紅蛋白的百分比或糖化血紅蛋白Alc的百分比?？梢允褂帽疚闹兴龅娜我馑倪蜾淃}?？梢砸来位蛲瑫r進(jìn)行步驟a)和b)。在一些實施方案中，所述溶解緩沖劑含有所述氧化劑。在一些實施方案中，所述溶解緩沖劑含有所述蛋白酶。在一些實施方案中，所述溶解緩沖劑含有所述氧化劑和所述蛋白酶。在一些實施方案中，在單一組合物中配制所述氧化劑和所述蛋白酶。能夠利用本方法測定的血液樣品包括全血或收集的血細(xì)胞。在溶解緩沖劑中溶解血液樣品中的紅細(xì)胞從而釋放血紅蛋白。能夠使用能夠溶解紅細(xì)胞并釋放血紅蛋白的任何溶解緩沖劑(例如，在酸性或堿性pH范圍內(nèi))。溶解緩沖劑通常含有去污劑，諸如Triton(例如，TritonX-100)、吐溫(例如，吐溫20)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、17十四烷基三甲基溴化銨(TTAB)、聚氧乙烯十二烷基醚(POEs)5和乙基苯基聚乙二醇(NP-40)。在本方法中能夠使用任何合適的蛋白酶。能夠使用內(nèi)-型蛋白酶或外-型蛋白酶。示范性內(nèi)-型蛋白酶包括胰蛋白酶、ot-胰凝乳蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、組織蛋白酶B、胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、蛋白酶XVII、蛋白酶XXI、賴氨酰-內(nèi)肽酶、prolether和菠蘿蛋白酶F。示范性外-型蛋白酶包括氨肽酶或羧肽酶。在一個實例中，所述蛋白酶是蛋白酶K、鏈霉蛋白酶E、ananine、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶或牛胰蛋白酶。還可以使用來自曲霉菌物種、脂環(huán)酸桿菌(Alicyclobacillus)物種、和桿菌物種的金屬蛋白酶和中性蛋白酶。使用所述蛋白酶能夠產(chǎn)生任何適宜尺寸的糖化肽。例如，使用所述蛋白酶能夠產(chǎn)生約2-約30個氨基酸殘基的糖化肽。在另一個實例中，使用所述蛋白酶產(chǎn)生糖化甘氨酸、糖化纈氨酸或糖化賴氨酸殘基，或包括糖化甘氨酸、糖化纈氨酸或糖化賴氨酸殘基的糖化肽。糖化肽和/或糖化氨基酸與果糖基氨基酸氧化酶相接觸。能夠使用任意果糖基氨基酸氧化酶(FAOD)。果糖基氨基酸氧化酶可以是純化的或重組產(chǎn)生的?？梢允褂萌魏翁烊淮嬖诘姆N類。在一個實例中，所有的FAOD是曲霉菌物種來源的(見，例如，Takahashi等.，生物的化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)272(6):3437-43,1997)。還能夠使用其他果糖基氨基酸氧化酶，例如，GenBank登記號U82830中公開的(Takahashi等，生物的化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.),272(19):12505-12507(1997)和美國專利號6,127,138公開的。還能夠使用阿馬道里酶的功能性片段或衍生物，所述功能性片段或衍生物仍基本保持其催化阿馬道里產(chǎn)物的氧化去糖化產(chǎn)生相應(yīng)的氨基酸、葡糖醛酮、和^02的酶活性。通常，阿馬道里酶的功能性片段或衍生物保持至少50%的它的酶活性。優(yōu)選地，阿馬道里酶功能性片段或衍生物保持至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的它的酶活性。能夠使用具有美國公開號2005/0014935中所述的FAOD酶活性的任何嵌合蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，所述果糖基氨基酸氧化酶從N-末端到C-末端包括a)第一肽基片段，其包含約5-約30個氨基酸殘基的細(xì)菌前導(dǎo)序列;和b)第二肽基片段，其包含F(xiàn)AOD。在一些實施方案中，所述FAOD包括下列氨基酸序列GQFLDFKNQLRPfAWTLVfflALKPEERALYKNIPVIFNIERGFFFEPDEERGEIKICDEHPGREFLIDRHPQYHSLVLGCGASGRGFKYLPSIGNUVDAMEGKVPQKIHELIKWNPDIAANH(SEQIDNO:l)。嵌合蛋白質(zhì)可以在細(xì)菌細(xì)胞，諸如大腸桿菌(E.coli)中產(chǎn)生。可以對生成的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，并測定其酶活性。對FAOD酶活性的測定是本領(lǐng)域中己知的(見，例如，Takahashi等，生物的化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.),272(6):3437-43(1997)和美國專利號6,127,138)。在Takahashi等，生物的化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.),272(6):3437-43(1997)中公開了四種示范性阿馬道里酶酶活性的測定。通過Trinder反應(yīng)評估在由果糖基氨基酸氧化酶催化的反應(yīng)中產(chǎn)生的過氧化氫。將顏色形成物質(zhì)和過氧化物酶加入到該反應(yīng)中，所述顏色形成物質(zhì)受到過氧化氫的氧化，形成顏色物質(zhì)諸如醌亞胺或Bindschedler綠衍生物和H20。生成的醌亞胺或Bindschedler綠產(chǎn)物的量能夠通過測量約500nm-約800nm之間(諸如約700nm)的吸收得到確定。在不希望受到理論限制的條件下，未與血液溶解產(chǎn)物中高分子量物質(zhì)反應(yīng)的第二氧化劑還可以與顏色形成物質(zhì)反應(yīng)，從而形成有色產(chǎn)物，并且由此，測量的吸收反映出血液樣品中總糖化血紅蛋白的百分比和糖化血紅蛋白Alc的百分比。顏色形成物質(zhì)的實例是N-(羧甲基氨基羰基)-4,4'-雙(二甲氨基)-二苯胺鈉鹽(DA-64)、N，N,N'N',N",N"-六(3-磺基丙基)-4,4',4",-三氨基-三苯甲垸六鈉鹽(TPM-PS)、禾Q10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-雙(二甲氨基)-吩噻嗪鈉鹽(DA-67)。過氧化物酶的實例是辣根過氧化物酶。在--些實施方案中,所述糖化肽和/或糖化氨基酸依次或同時與果糖基氨基酸氧化酶和所述過氧化物酶相接觸。在一些實施方案中，在單一組合物中配制所述FAOD、所述過氧化物酶、和所述顏色形成物質(zhì)。在一些實施方案中，在不同的組合物中配制所述FAOD、所述過氧化物酶、和所述顏色形成物質(zhì)，并同時或不同時地將它們加入到所述反應(yīng)中。通過將所述吸收(例如在約700nm處的吸收)與校準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，確定血液樣品中總糖化血紅蛋白的百分比或糖化血紅蛋白Alc的百分比。利用本方法，在不單獨測量血液樣品中總血紅蛋白的條件下，確定該血液樣品中總糖化血紅蛋白的百分比或糖化血紅蛋白Alc的百分比。校準(zhǔn)曲線是利用校準(zhǔn)物，即，具有己知的糖化血紅蛋白百分比或己知的糖化血紅蛋白Alc百分比的樣品(包括，血液樣品和人造校準(zhǔn)物)建立的。參見，例如,實施例1。在-些實施方案中,校準(zhǔn)曲線是通過下列步驟制成的通過在不單獨測量總血紅蛋白的條件下，執(zhí)行與未知樣品相同的步驟，確定校準(zhǔn)樣品的信號水平(例如，在約700nm處的吸收);和對校準(zhǔn)樣品的信號水平和校準(zhǔn)樣品中己知的糖化血紅蛋白百分比或已知的糖化血紅蛋白Alc百分比之間的相關(guān)性繪圖。例如，能夠使用這樣的全血樣品作為校準(zhǔn)物，所述全血樣品具有通過與合適的較高水平參考材料比較而分配的糖化血紅蛋白Alc百分比數(shù)值。備選地，糖化血紅蛋白Alc百分比可以通過另--種公認(rèn)的方法，諸如HPLC得到確定。利用本文中所述的方法，以與未知樣品相同的方式檢驗校準(zhǔn)物。對針對校準(zhǔn)物測量的吸收值對比預(yù)期的HbAlc繪圖，從而建立校準(zhǔn)曲線。還可以使用除全血樣品外的校準(zhǔn)物建立校準(zhǔn)曲線。能夠使用處于適當(dāng)緩沖的蛋白質(zhì)基質(zhì)溶液中的血液溶解產(chǎn)物(Hemolysate)樣品(溶解的血液樣品)、糖化肽、糖化氨基酸、和糖化氨基酸衍生物作為人造校準(zhǔn)物，其具有通過與合適的較高水平參考材料比較而分配的糖化血紅蛋白Alc百分比數(shù)值。例如，可以在磷酸鹽緩沖液中配制校準(zhǔn)樣品，所述磷酸鹽緩沖液具有10%BSA和對應(yīng)于不同HbAlc百分比(例如，5%-12%)的合適量的合成果糖基丙胺(糖化氨基酸)。除了可以不使用細(xì)胞溶解步驟外，用與未知樣品相同的方式檢驗人造校準(zhǔn)物。對針對這些校準(zhǔn)物測量的吸收值對比預(yù)期的HbAlc繪圖，從而建立校準(zhǔn)曲線。為了延長的保存期，可以對人造校準(zhǔn)物進(jìn)行凍干或穩(wěn)定化。20本方法能夠用于任何合適的目的。優(yōu)選地，本方法用在疾病或病癥，例如糖尿病的預(yù)后或診斷中。C.測定糖化血紅蛋白百分比的試劑盒本發(fā)明還提供在不單獨測量血液樣品中總血紅蛋白的條件下，測定總糖化血紅蛋白百分比或糖化血紅蛋白Alc百分比的試劑盒，所述試劑盒包括a)溶解血細(xì)胞從而釋放血紅蛋白的溶解緩沖劑；b)選擇性氧化低分子量還原物質(zhì)的第一氧化劑；c)選擇性氧化高分子量還原物質(zhì)的第二氧化劑；d)將血紅蛋白水解為包括糖化肽或糖化氨基酸的蛋白質(zhì)片段的蛋白酶；e)與糖化肽和糖化氨基酸反應(yīng)從而產(chǎn)生過氧化氫(11202)的果糖基氨基酸氧化酶；f)過氧化物酶和顏色形成物質(zhì);和g)用于構(gòu)建校準(zhǔn)曲線的糖化血紅蛋白或糖化血紅蛋白Alc校準(zhǔn)物(即，具有已知糖化血紅蛋白百分比或已知糖化血紅蛋白Alc百分比的校準(zhǔn)物)。在一些實施方案中，所述第一氧化劑是戴斯-馬丁氧化劑和/或N-乙基馬來酰亞胺。在一些實施方案中，所述第二氧化劑是四唑鑰鹽。在一些實施方案中，所述溶解緩沖劑含有所述第一氧化劑和/或所述第二氧化劑。在一些實施方案中，所述溶解緩沖劑含有所述蛋白酶。在一些實施方案中，所述溶解緩沖劑含有所述第一氧化劑、所述第二氧化劑、和所述蛋白酶。在一些實施方案中，在單一組合物中配制所述第一氧化劑和所述第二氧化劑。在一些實施方案中，在分別的組合物中配制所述第一氧化劑和所述第二氧化劑。在一些實施方案中，在單一組合物中配制所述蛋白酶與所述第一氧化劑和/或所述第二氧化劑。本發(fā)明還提供在不需要單獨測量血液樣品中總血紅蛋白含量的條件下，直接測定血液樣品中總糖化血紅蛋白百分比或糖化血紅蛋白Alc百分比的試劑盒，所述試劑盒包括a)溶解血細(xì)胞從而釋放血紅蛋白的溶解緩沖劑；b)氧化劑，其中所述氧化劑是四唑鐺鹽；c)將血紅蛋白水解為包括糖化肽或糖化氨基酸的蛋白質(zhì)片段的蛋白酶；d)與糖化肽和糖化氨基酸反應(yīng)從而產(chǎn)生過氧化氫(H202)的果糖基氨基酸氧化酶；e)過氧化物酶和顏色形成物質(zhì);和f)具有已知糖化血紅蛋白百分比或己知糖化血紅蛋白Alc百分比、用于構(gòu)建校準(zhǔn)曲線的校準(zhǔn)物。在一些實施方案中，所述氧化劑包含在所述溶解緩沖劑中。在一些實施方案中，所述蛋白酶包含在所述溶解緩沖劑中。在一些實施方案中，所述氧化劑和所述蛋白酶包含在所述溶解緩沖劑中。在一些實施方案中，在單一組合物中配制所述蛋白酶和氧化劑。在一些實施方案中，在單一組合物中配制所述果糖基氨基酸氧化酶和所述過氧化物酶。在一些實施方案中，所述校準(zhǔn)物是具有已知糖化血紅蛋白Alc百分比的血液樣品，其可以處于凍干形式或溶液中。在一些實施方案中，所述試劑盒包括溶解緩沖劑、Rla試劑、Rlb試劑、和R2試劑。在一些實施方案中，所述溶解緩沖劑包括第一氧化劑(例如，N-乙基馬來酰亞胺和/或戴斯-馬丁氧化劑)。在一些實施方案中，所述Rla試劑包括蛋白酶和第一氧化劑(例如，N-乙基馬來酰亞胺和/或戴斯-馬丁氧化劑)。在一些實施方案中，所述Rlb試劑包括第一氧化劑(例如，N-乙基馬來酰亞胺和/或戴斯-馬丁氧化劑)和第二氧化劑(例如，四唑錄鹽)。在一些實施方案中，所述R2試劑包括果糖基氨基酸氧化酶、過氧化物酶(例如，辣根過氧化物酶)、和顏色形成物質(zhì)(例如，DA-64)。例如，所述溶解緩沖劑可以含有0.1-10%TritonX-100(例如，約0.1%,約0.2%,約0.5%,約1%，約2.5%,約5%，約7.5%，約10%);5-100mMCHES(例如，約5mM,約10mM，約25mM，約50mM,約75mM，約100mM)，pH約8.7;0.1-50mMN-乙基馬來酰亞胺(例如，約0.1mM,約0.5mM,約1mM,約5mM,約10mM,約20mM,約30mM，約40mM,約50mM);0.1-5%SDS(例如，約0.15%,約0.25%,約0.35%，約0.45%，約0.55%,約0.75%,約1%，約2.5%,約5%);0.001-1KU/ml過氧化氫酶(例如，約1U/ml，約2U/ml，約3U/ml，約4U/ml，約5U/ml，約10U/ml，約50U/ml，約100U/ml，約500U/ml，約lKU/ml);0.001-1KU/ml抗壞血酸氧化酶(例如，約1U/ml，約2U/ml，約4U/ml，約5U/ml，約10U/ml，約50U/ml，約100U/ml，約1KU/ml)。所述Rla試劑可以含有0.1-10KU/ml桿菌物種蛋白酶(例如，約0.1KU/ml,約2KU/ml,約3.0KU/ml,約3.5KU/ml，約4.0KU/ml,約4.5KU/ml，約5KU/ml，約10KU/ml);1-100mMMES(例如，約1mM,約5mM,約10mM,約25mM，約50mM，約100mM),pH約7.0;1-10mMCaCl2(例如，約1mM,約2.5mM，約5mM,約7.5mM,約10mM);0.01-10mM戴斯馬丁氧化劑(例如，約0.01mM，約0,015mM,約0.02rnM，約0.05mM,約0.1mM,約5mM,約10mM);0.01-5mg/ml甲基4-羥基苯甲酸鈉鹽(例如，約0.01mg/ml,約0.05mg/ml,約0.1mg/ml,約1mg/ml,約5mg/ml);和0.001-1mg/ml遺傳霉素(G418)(例如，約0.001mg/ml，約0.01mg/ml，約0.1mg/ml,約1mg/ml)。所述Ribi式劑可以含有0.1-50mMMES水合物(例如，約0.1mM,約0.5mM,約1.0mM,約10mM,約25mM，約50mM);0.1-50mMWST-3(2-(4-碘苯基)-3-(2,4-二硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑錄，單鈉鹽)(例如，約0.1mM，約0.5mM,纟勺1mM,纟勺2.5mM,纟勺2.6mM,纟勺2.7mM,纟勺2.8mM,纟勺2.9mM,約3.0mM,約5mM,約10mM,約25mM,約50mM);和0.01-10mM戴斯馬丁氧化劑(例如，約0.01mM,約0.04mM,約0.05mM,約0.06mM,纟勺0.07mM,纟勺0.08mM,纟勺0.09mM,纟勺0.1mM,纟勺1mM,纟勺5mM,纟勺10mM)。所述R2試劑可以含有0.01-10KU/ml果糖基纈氨酸氧化酶(例如，約0.01KU/ml,約0.012KU/ml,約0.013KU/ml,約0.0135KU/ml,約0.014KU/ml,約0.0145KU/ml,約0.015KU/ml,約0.0155KU/ml,約0.016KU/ml,約0.05KU/m，約0.1KU/ml，約1KU/ml，約5KU/ml,約10KU/ml);1-50mMTris-HCl(例如，約1mM,約5mM,約10mM，約15mM,約20mM,約50mM),pH約8.0;0.1-10%TritonX-100(例如，約0.1%,約0.2%,約0.5%,約1%,約2,5%，約5%,約7.5%,約10%);0.01-10KU/ml辣根過氧化物酶(證)(例如，約0.01KU/ml，約0.05KU/ml,約0.08KU/ml,約0.09KU/ml,約0.1KU/ml,約1.0KU/ml,約5KU/ml，約10KU/ml);0.01-10mMDA-64(例如，約0.01mM,約0.05mM,約0.075mM,約0.08mM,約0.085mM,約0.09mM,約0.1mM,約1mM:約5mM,約10mM);和0.01-10mg/ml遺傳霉素(G418)(例如，約0.01mg/ml,0.05mg/ml,約0.1mg/ml,約5mg/ml,約10mg/ml)。所述試劑盒還可以包括用于實施本文中所述方法的操作指南。所述試劑盒可以以實施例1中的詳細(xì)描述使用本發(fā)明的試劑盒可以處于任何合適的包裝中。合適的包裝包括，但不僅限于，小瓶、瓶、罐、柔軟包裝、等。試劑盒還可以包括用于實施本文中所述的任何方法的操作指南。23實施例實施例1:單通道HbAlc酶促測定單通道HbAlc檢測是這樣的酶促測定，在其中溶解樣品，并使其與試劑反應(yīng)，從而消除低分子量或高分子量信號干擾物質(zhì)。利用桿菌物種蛋白酶對溶解的全血樣品進(jìn)行廣泛的蛋白酶消化作用。該過程從血紅蛋白(3鏈釋放包含糖化纈氨酸的氨基酸。然后，將糖化纈氨酸用作在大腸桿菌中產(chǎn)生的特異性重組果糖基纈氨酸氧化酶(FVO)酶的底物。所述重組的FVO能夠在選擇性試劑的存在下，特異性裂解N-末端纈氨酸并產(chǎn)生過氧化氫。利用辣根過氧化物酶(POD)催化的反應(yīng)和合適的產(chǎn)色團(tuán)(chromagen)，依次對其進(jìn)行測量。通過使用合適的校準(zhǔn)曲線，將HbAlc濃度直接表示為%HbAlc。I.試劑組成.溶解緩沖劑50mMCHESpH9.4，2%TritonX-100,3mM戴斯-馬丁氧化劑，和2.5mMN-乙基馬來酰亞胺。試劑Rla:25mMMES緩沖劑pH6,5,5mMCaCl2,1000U/ml中性蛋白酶(Toyobo有限公司),2mMN-乙基馬來酰亞胺。試劑Rib:25mMMESpH6.5，150mM氯化鈉，5mM戴斯-馬丁氧化齊U，2mMWST3(2-(4-碘苯基)-3-(2,4-二硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-21^-四唑錄，單鈉鹽(由Dojindo實驗室制造))。試劑R2:25mMTris，pH8.2，5U/ml具有SEQIDNO:l中所示氨基酸序列的果糖基氨基酸氧化酶，50U/ml辣根過氧化物酶，和0.5mM產(chǎn)色團(tuán)(N-(羧甲基氨基羰基)-4，4'-雙(二甲氨基)二苯胺鈉鹽(產(chǎn)品名稱DA-64，由Wako制造)。II.測定程序?qū)⑷芙饩彌_劑(500pL)分配在合適的容器，諸如樣品杯或微量離心管中。檢驗前，通過溫和的反轉(zhuǎn)混合全血樣品，從而混懸沉淀的紅細(xì)胞。利用合適的吸移管，在不形成泡沫的條件下，使完全混懸的全血樣品(4(VL)24與溶解緩沖劑溫和地混合。然后，將混合物在室溫下溫育5-10分鐘。當(dāng)該混合物變?yōu)闆]有任何顆粒物質(zhì)的澄清紅色溶液時，觀察到完全的細(xì)胞溶解。使用前，以70:30的體積比混合試劑Rla和Rlb。將試劑Rlb倒入Rla中，并通過反轉(zhuǎn)溫和地混合所述試劑，從而形成試劑Rlab。將試劑Rlab(170pL)和溶解產(chǎn)物(20(iL)加入到杯中，并混合。將該杯在37"C溫育5分鐘。該反應(yīng)也可以在室溫下進(jìn)行。溫育后，將50pL試劑R2加入到該杯中。監(jiān)測700nm處的吸收3分鐘。通過從Al處的O.D.數(shù)值(加入R2后即刻的吸收)減去A2處的O.D.數(shù)值(加入R2后3分鐘時的吸收)，即AA700二(A2-Al),計算校準(zhǔn)物、對照和樣品的吸收數(shù)值。該反應(yīng)的時間線顯示在圖1中。通過利用例如，在圖2中所示的校準(zhǔn)曲線，確定未知樣品的數(shù)值，所述圖2直接以HbAlcV。單位表示。利用這樣的數(shù)據(jù)制成校準(zhǔn)曲線(圖2)，所述數(shù)據(jù)由在上述程序后測量三份具有已知糖化血紅蛋白Alc百分比(6.25。/。、10.00%、和15.00%)的標(biāo)準(zhǔn)樣品的AA700獲得。通過利用HPLC方法對合適的全血材料的HbAlc數(shù)值進(jìn)行檢驗，而制備校準(zhǔn)物。為了延長保存期，能夠凍干或穩(wěn)定化用于校準(zhǔn)的全血材料。如表2中所示，利用上述方法獲得的糖化血紅蛋白Alc的百分比數(shù)值(在"獲得的數(shù)值"下的欄)與樣品中預(yù)期的數(shù)值相關(guān)。對樣品預(yù)期的數(shù)值獲自HPLC。預(yù)期數(shù)值的范圍表示可接受的數(shù)值范圍。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>m.單通道酶促血紅蛋白Aic測定的精確性用重復(fù)16次的兩種不同。/。HbAlc水平的新鮮全血樣品(樣品ID10810285低HbAlc和樣品ID10810244高HbAlc)評估組內(nèi)(within-run)的精確性。該評估是利用日立(Hitachi)917自動-分析器設(shè)備和本實施例中所述的單通道酶促血紅蛋白Ale測定進(jìn)行的。該研究中包括正常對照和病理正常對照。用于本研究的、具有確定。/。HbAlc值的全血樣品獲自合格的商業(yè)來源ProMedDx,LLC(10CommerceWay,Norton,MA02766),并且與之一起獲得了IRB證明，即用于收集樣品的方案、已告知的同意是IRB認(rèn)證的。下表3顯示單通道酶促血紅蛋白Alc測定的精確性。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>IV.單通道酶促血紅蛋白Alc測定的準(zhǔn)確性為了說明準(zhǔn)確性，將單通道酶促血紅蛋白Alc測定用于個體的全血樣品(如下所述的ID系列)，并將其與目前市場上的HbAlc裝置，即Tosoh，sHbAlcHPLC測定(TosohG7:HbAlc變量分析模式)進(jìn)行比較。該準(zhǔn)確性研究檢驗是在日立(Hitachi)917自動-分析器設(shè)備上進(jìn)行的。用于本研究的、具有確定HbAlc值的全血樣品獲自合格的商業(yè)來源ProMedDx,LLC,并且與之一起獲得了IRB證明，即用于收集樣品的方案、已告知的同意是IRB認(rèn)證的。該比較研究包括30份檢驗樣品，并且將獲得的結(jié)果顯示在下表4中。'Tosoh%HbAlc"表示利用Tosoh，sHbAlcHPLC方法對樣品獲得的數(shù)值。"DZ%HbAlc"表示利用本實施例中所述的單通道酶促血紅蛋白Alc測定獲得的相應(yīng)數(shù)值。表4新鮮的全血樣品IDTosoh%HbAlcDZ%HbA)c1108102574.95.1210B972265.15.43108972275,15.1410897^295.25.451089723D5.35.2610845039B.78.4710845043.8.58.7810845D447.16.89108450457.87.510108450596.96.81110.9".71210&972619.610.0131D89727210.110.9141089727814.415108972315.65.616108972345.75.81710897238.5.45.4181D8972395.75.919108972415.45.320108450507.67.421108450S3B.17.322108450556,46.423108450666.56.624108450686.76.3251089728510.89.726108972869.910.427108972909.78.7281D8972959.69.829DZCtlL1LotCOM100405B-15.35.430DZCtlL2LotCON2。?！?B-110.91D.9圖3顯示利用本實施例中所述的單通道酶促血紅蛋白Alc測定獲得的HbAlc數(shù)值(％)對比用TosohHPLC方法獲得的結(jié)果繪圖。如圖3中所示，斜率是1.05;兩種方法間的相關(guān)系數(shù)是0.96;且y截距是-0.367。實施例2:利用一種氧化劑進(jìn)行單通道HbAlc酶促測定本實施例中的單通道HbAlc檢驗的程序與實施例1中所述的程序類似，其區(qū)別在于僅使用一種氧化劑來氧化血液樣品中的還原物質(zhì)。I.試劑組成溶解緩沖劑50mMCHESpH9.4,和2%TritonX-100。試劑Rla:25mMMES緩沖劑pH6.5，5mMCaCl2,1000U/ml中性蛋白酶(Toyobo有限公司)。試劑Rib:25mMMESpH6.5,150mM氯化鈉,和2mMWST3(2-(4-碘苯基)-3-(2,4-二硝基苯基)-5-(254-二磺基苯基)-2H-四唑錄，單鈉鹽(由Dojindo實驗室制造))。試劑R2:25mMTris，pH8.2,5U/ml具有SEQIDNO:l中所示氨基酸序列的果糖基氨基酸氧化酶，50U/ml辣根過氧化物酶,和0.5mM產(chǎn)色團(tuán)(N-(羧甲基氨羰基)-4，4'-雙(二甲氨基)二苯胺鈉鹽(產(chǎn)品名稱DA-64,由Wako制造)。II.測定程序?qū)⑷芙饩彌_劑(500|iL)分配在合適的容器，諸如樣品杯或微量離心管中。檢驗前，通過溫和的反轉(zhuǎn)混合全血樣品，從而混懸沉淀的紅細(xì)胞。利用合適的吸移管，在不形成泡沫的條件下，使完全混懸的全血樣品(40pL)與溶解緩沖劑溫和地混合。然后，將混合物在室溫下溫育5-10分鐘。當(dāng)該混合物變?yōu)闆]有任何顆粒物質(zhì)的澄清紅色溶液時，觀察到完全的細(xì)胞溶解。使用前，以70:30的體積比混合試劑Rla和Rlb。將試劑Rib倒入Rla中，并通過反轉(zhuǎn)溫和地混合所述試劑，從而形成試劑Rlab。將試劑Rlab(170):iL)和溶解產(chǎn)物(20)uL)加入到杯中，并混合。將該杯在37。C溫育5分鐘。溫育后，將50pL試劑R2加入到該杯中。監(jiān)測700nm處的吸收3分鐘。通過從Al處的O.D.數(shù)值(加入R2后即刻的吸收)減去A2處的O.D.數(shù)值(加入R2后3分鐘時的吸收)，即AA700二(A2-Al)，計算校準(zhǔn)物、對照和樣品的吸收數(shù)值。該反應(yīng)的時間線顯示在圖1中。圖4顯示由按照上述程序測量樣品的AA700(Y-軸)獲得的數(shù)據(jù)對比28己知的糖化血紅蛋白A1C百分比繪圖。圖4顯示利用具有單氧化劑四唑鐵的試劑系統(tǒng)，在不單獨測量總血紅蛋白的條件下，也能夠直接確定糖化血紅蛋白Alc的百分比，盡管該結(jié)果(準(zhǔn)確性和相關(guān)性)不如實施例1中所述的利用具有雙氧化劑的試劑系統(tǒng)獲得的那些好。盡管為了清楚和理解的目的，通過舉例說明和實施例的方式詳細(xì)描述了前述發(fā)明，但是可以進(jìn)行某些改變和改進(jìn)，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言應(yīng)該是明顯的。因此，不應(yīng)該將描述和實施例解釋為限制由所附權(quán)利要求所敘述的本發(fā)明的范圍。權(quán)利要求1.在不以單獨的過程測量血液樣品中總血紅蛋白的條件下，直接測定該血液樣品中總糖化血紅蛋白百分比或糖化血紅蛋白A1c百分比的方法，所述方法包括a)使包含糖化肽或糖化氨基酸的蛋白質(zhì)片段與果糖基氨基酸氧化酶相接觸，從而產(chǎn)生過氧化氫(H2O2)，其中所述蛋白質(zhì)片段是通過使所述血液樣品與下列各項相接觸而產(chǎn)生的1)溶解緩沖劑，其從血液樣品中的紅細(xì)胞中釋放血紅蛋白；2)第一氧化劑，其選擇性氧化低分子量還原物質(zhì)；3)第二氧化劑，其選擇性氧化高分子量還原物質(zhì)，和4)蛋白酶，其將糖化血紅蛋白消化為糖化肽或糖化氨基酸；b)在過氧化物酶存在下，使在步驟a)中產(chǎn)生的H2O2與顏色形成物質(zhì)相接觸，從而產(chǎn)生可測量的信號；和c)在不單獨測量所述血液樣品中的總血紅蛋白的條件下，通過將步驟b)中產(chǎn)生的信號應(yīng)用于校準(zhǔn)曲線來確定所述樣品中總糖化血紅蛋白的百分比或糖化血紅蛋白A1c的百分比。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一氧化劑是戴斯-馬丁氧化劑(Dess-Martinperiodinane)或N-乙基馬來酰亞胺，和其中所述第二氧化劑是四唑錄鹽。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述溶解緩沖劑含有所述第一氧化劑或所述第二氧化劑。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述溶解緩沖劑含有所述第一氧化劑和所述第二氧化劑。5.權(quán)利要求1的方法，其中所述溶解緩沖劑含有所述第一氧化劑、所述第二氧化劑、和所述蛋白酶。6.權(quán)利要求l的方法，其中所述溶解緩沖劑含有所述蛋白酶。7.權(quán)利要求1的方法，其中在單一組合物中配制所述第一氧化劑和所述第二氧化劑。8.權(quán)利要求1的方法，其中在分別的組合物中配制所述第一氧化劑和所述第二氧化劑。9.權(quán)利要求1的方法，其中在單一組合物中配制所述蛋白酶與所述第一氧化劑或所述第二氧化劑。10.權(quán)利要求1的方法，其中在單一組合物中配制所述第一氧化劑、所述第二氧化劑、和所述蛋白酶。11.權(quán)利要求1的方法，其中在單一組合物中配制所述果糖基氨基酸氧化酶、所述過氧化物酶、和所述顏色形成物質(zhì)。12.權(quán)利要求2的方法，其中四唑鎗鹽是2-(4-碘苯基)-3-(2,4-二硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑錄單鈉鹽或2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎗單鈉鹽。13.權(quán)利要求1的方法，其中所述顏色形成物質(zhì)是N-羧甲基氨基羰基)_4,4'-雙(二甲氨基)-二苯胺鈉鹽(DA-64)、N,N,N'N'，N",N"-六(3-磺基丙基)-4,4'，4",-三氨基-三苯甲烷六鈉鹽(TPM-PS)、或10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-雙(二甲氨基)-吩噻嗪鈉鹽(DA-67)。14.權(quán)利要求1的方法，其中所述血液樣品是全血或收集的血細(xì)胞。15.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白酶是內(nèi)-型蛋白酶或外-型蛋白16.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白酶是選自由下列各項組成的組蛋白酶K、鏈霉蛋白酶E、ananine、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶和牛胰蛋白酶。17.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白酶是曲霉屬(Aspergillus)或桿菌屬(Bacillus)來源的中性蛋白酶。18.權(quán)利要求2方法，其中所述蛋白酶產(chǎn)生約2-約30個氨基酸殘基的糖化肽。19.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白酶產(chǎn)生糖化甘氨酸、糖化纈氨酸或糖化賴氨酸殘基或者包含糖化甘氨酸、糖化纈氨酸或糖化賴氨酸殘基的糖化肽。20.權(quán)利要求1的方法，其中所述過氧化物酶是辣根過氧化物酶。21.權(quán)利要求1的方法，其中所述含有糖化肽或糖化氨基酸的蛋白質(zhì)片段依次或同時與所述果糖基氨基酸氧化酶和所述過氧化物酶相接觸。22.權(quán)利要求1的方法，其中所述果糖基氨基酸氧化酶包括SEQIDNO:l中所示的氨基酸序列H)。23.權(quán)利要求l的方法，所述方法用于疾病或病癥的預(yù)后或診斷。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述疾病或病癥是糖尿病。.25.在不需要單獨測量血液樣品中總血紅蛋白含量的條件下，直接測定血液樣品中總糖化血紅蛋白百分比或糖化血紅蛋白Alc百分比的試劑盒，所述試劑盒包括a)溶解血細(xì)胞從而釋放血紅蛋白的溶解緩沖劑；b)選擇性氧化低分子量還原物質(zhì)的第一氧化劑；c)選擇性氧化高分子量還原物質(zhì)的第二氧化劑；d)將血紅蛋白水解為包括糖化肽或糖化氨基酸的蛋白質(zhì)片段的蛋白酶；e)與糖化肽和糖化氨基酸反應(yīng)從而產(chǎn)生過氧化氫(^02)的果糖基氨基酸氧化酶；f)過氧化物酶和顏色形成物質(zhì)；g)具有己知糖化血紅蛋白百分比或己知糖化血紅蛋白Alc百分比、用于構(gòu)建校準(zhǔn)曲線的校準(zhǔn)物；和h)實施權(quán)利要求1的方法的操作指南。26.權(quán)利要求25的試劑盒，其中所述第一氧化劑和所述第二氧化劑包含在所述溶解緩沖劑中。27.權(quán)利要求25的試劑盒，其中所述第一氧化劑和所述第二氧化劑與蛋白酶包含在同一緩沖劑中。28.權(quán)利要求25的試劑盒，其中在單一組合物中配制所述果糖基氨基酸氧化酶、所述過氧化物酶、和所述顏色形成物質(zhì)。29.在不以單獨的過程測量血液樣品中總血紅蛋白的條件下，直接測定該血液樣品中總糖化血紅蛋白百分比或糖化血紅蛋白Alc百分比的方法，所述方法包括a)使包含糖化肽或糖化氨基酸的蛋白質(zhì)片段與果糖基氨基酸氧化酶相接觸，從而產(chǎn)生過氧化氫(H202)，其中所述蛋白質(zhì)片段是通過使所述血液樣品與下列各項相接觸而產(chǎn)生的1)從血液樣品中的紅細(xì)胞中釋放血紅蛋白的溶解緩沖劑；2)氧化劑，即四唑鎿鹽，和3)將糖化血紅蛋白消化為糖化肽或糖化氨基酸的蛋白酶；b)在過氧化物酶存在下，使在步驟a)中產(chǎn)生的11202與顏色形成物質(zhì)相接觸，從而產(chǎn)生可測量的信號；和c)在不單獨測量所述血液樣品中總血紅蛋白的條件下，通過將步驟b)中產(chǎn)生的信號應(yīng)用于校準(zhǔn)曲線來確定所述樣品中總糖化血紅蛋白的百分比或糖化血紅蛋白Alc的百分比。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述溶解緩沖劑含有所述氧化劑。31.權(quán)利要求29或30的方法，其中所述溶解緩沖劑含有所述蛋白酶。32.權(quán)利要求29的方法，其中在單一組合物中配制所述氧化劑和所述蛋白酶。33.在不需要單獨測量血液樣品中總血紅蛋白含量的條件下，直接測定血液樣品中總糖化血紅蛋白百分比或糖化血紅蛋白Alc百分比的試劑盒，所述試劑盒包括a)溶解血細(xì)胞從而釋放血紅蛋白的溶解緩沖劑；b)氧化劑，其中所述氧化劑是四唑鎿鹽；c)將血紅蛋白水解為含有糖化肽或糖化氨基酸的蛋白質(zhì)片段的蛋白酶；d)與糖化肽和糖化氨基酸反應(yīng)從而產(chǎn)生過氧化氫(H202)的果糖基氨基酸氧化酶；e)過氧化物酶和顏色形成物質(zhì)；f)具有已知糖化血紅蛋白百分比或已知糖化血紅蛋白Alc百分比、用于構(gòu)建校準(zhǔn)曲線的校準(zhǔn)物；和g)實施權(quán)利要求28的方法的操作指南。34.權(quán)利要求33的試劑盒，其中所述氧化劑包含在所述溶解緩沖劑中。35.權(quán)利要求33或34的試劑盒，其中所述蛋白酶包含在所述溶解緩沖劑中。36.權(quán)利要求33的試劑盒，其中在單一組合物中所述配制氧化劑和所述蛋白酶。全文摘要本發(fā)明提供在不需要單獨測量血液樣品中總血紅蛋白含量的條件下，直接確定血液樣品中總糖化血紅蛋白百分比的方法。所述方法使用一種或兩種不同類型的氧化劑，所述氧化劑選擇性氧化血液樣品中的低分子量還原物質(zhì)和高分子量(主要是血紅蛋白)還原物質(zhì)，伴隨由蛋白酶、果糖基氨基酸氧化酶、和過氧化物酶催化的酶促反應(yīng)。本發(fā)明提供用于實施本發(fā)明方法的試劑盒。文檔編號G01N33/72GK101484809SQ200780023123公開日2009年7月15日申請日期2007年7月25日優(yōu)先權(quán)日2006年7月25日發(fā)明者劉利民,袁崇生,阿比吉特·達(dá)塔申請人:通用原子公司