一種高蟲草素含量的北蟲草菌株選育方法及生產(chǎn)工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及北蟲草菌株選育方法領(lǐng)域，尤其涉及一種高蟲草素含量的北蟲草菌株 選育方法及生產(chǎn)工藝。
【背景技術(shù)】
[0002] 北蟲草又稱為蛹蟲草、北冬蟲夏草，隸屬于真菌界的子囊菌門、肉座菌目、麥角菌 科，是蟲草屬的模式種，與冬蟲夏草屬同種，全球廣泛分布。北蟲草在鱗翅目昆蟲上的子囊 座與蟲體的藥用價值與冬蟲夏草相似，是我國極具開發(fā)價值的藥用滋補真菌，可以作為冬 蟲夏草的代用品。近年來隨著研宄人員對北蟲草滋補保健功效和多種藥用價值的認識，其 開發(fā)利用研宄倍受關(guān)注，并在藥理有效成分及人工栽培等各方面取得了很大的進展?，F(xiàn)在 主栽食用菌品種育種工作開展的很多，但是北蟲草新菌株的選育工作報道較少。現(xiàn)在市場 上北蟲草商品多為尖頭和棒狀品種，而市場對子囊座膨大狀同時蟲草素高的商品草有需 求。
[0003] 真菌的交配型是控制其交配親和性和有性生殖的遺傳基礎(chǔ)。已知真菌的交配型 系統(tǒng)分為同宗配合和異宗配合2大類。同宗配合是一種自體可孕的有性生殖方式，即該 真菌不需要兩個不同來源的菌絲交配，只由同一有性孢子萌發(fā)生成的初級菌絲就可獨立 完成有性生活史。同宗配合分成初級同宗配合（primaryhomothallism)和次級同宗配 合（secondaryhomothallism)。異宗配合是一種自體不孕的有性生殖方式，S卩由同一有 性孢子萌發(fā)形成的初級菌絲不能獨立完成有性生活史，只有通過兩個不同交配型的有性 孢子萌發(fā)生成的初生菌絲之間的交配，才能完成有性生活史。異宗配合根據(jù)控制交配型 的不親和性因子是一對還是兩對，也可分為兩類：具有一對不親和性因子的二極性異宗配 合（bipolarheterothallism)和具有兩對不親和性因子的四極性異宗配合（tetrapolar heterothallism)。就同一菌株所產(chǎn)生的有性孢子間的交配而言，二極性異宗配合菌的可親 和率為50%，而四極性異宗配合菌的可親和率為25%，北蟲草屬于二極性異宗配合真菌， 在有性生殖過程會帶來遺傳重組缺失突變等，使有性后代發(fā)生各種變異，通過子囊孢子的 分離和配對雜交，使我們有可能從中篩選到子囊座膨大蟲草素高的北蟲草。
[0004] 北蟲草在有性生殖過程中往往會發(fā)生染色體水平和基因水平上遺傳變異染色體 水平上的變異，主要是因為蟲草在有性生殖過程中發(fā)生質(zhì)配核配和減數(shù)分裂所致；而基因 水平上的變異主要是由于蛹蟲草在生長過程中受到營養(yǎng)條件和環(huán)境條件的誘變所致，所以 即使是來自同一子實體的不同子囊孢子菌株間在菌落顏色形態(tài)生長速率等性狀上也存在 一定差異，各自產(chǎn)生子實體的能力也不盡相同。試驗表明菌落顏色為杏橙色的單孢子一般 是可孕的而且產(chǎn)子實體的能力較強，配對后比單獨培養(yǎng)時產(chǎn)子實體的能力更強，菌落顏色 為淡檸檬黃色的單孢子一般是不可孕的，配對后一部分是可孕的有些產(chǎn)子實體的能力也很 強，將單孢子對峙培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)在單孢子間有扇形雜交區(qū)的配對培養(yǎng)產(chǎn)生子實體的能力強， 沒有扇形雜交區(qū)的單孢子配對培養(yǎng)產(chǎn)生子實體的能力弱。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)通過組織分離（北蟲草菌種的培育方法，CN102550290A;北蟲草 最佳組織分離期篩選方法，CN103250566A;蛹蟲草優(yōu)良菌種的篩選和穩(wěn)定繁殖方法，CN1710063)、分生孢子雜交（利用交配型對蛹蟲草菌株復壯和提高子實體產(chǎn)量的方法， CN103609331A;)、多孢雜交（一種蛹蟲草菌種的培養(yǎng)方法，CN102017866A)可以基本實現(xiàn)普 通北蟲草和孢子粉的生產(chǎn)。但組織分離由于多次的無性繁殖，菌株中含有大量的衰退變異 菌，使菌種活力明顯降低，表現(xiàn)為生長變慢、轉(zhuǎn)色變慢、產(chǎn)量下降等；利用分生孢子和多孢雜 交存在菌株純度不足，出草良品率低等問題。
[0006] 鑒于上述缺陷，本發(fā)明創(chuàng)作者經(jīng)過長時間的研宄和實踐終于獲得了本創(chuàng)作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種高蟲草素含量的北蟲草菌株選育方法及生產(chǎn)工藝，用 以克服上述技術(shù)缺陷。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種高蟲草素含量的北蟲草菌株選育方法，該具體 過程為：
[0009] 步驟a，優(yōu)良單孢子菌株選育；
[0010] 將成熟子實體倒懸于PDA培養(yǎng)基上方，自然彈射，18-22°c避光培養(yǎng)2-3天，可見星 芒狀萌發(fā)點，選取單個萌發(fā)點，挑取多于100株于PDA斜面培養(yǎng)基上；20-23°C避光培養(yǎng)15 天后，光照3天，選擇30株在PDA斜面培養(yǎng)基上萌發(fā)快、長勢旺，菌絲粗壯，見光轉(zhuǎn)色快，色 濃的菌株，轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)皿，20-23°C避光培養(yǎng)，挑選20株準備子實體培養(yǎng)；
[0011] 步驟b，制備液體菌種；
[0012] 取500ml三角瓶，每瓶加200ml液體培養(yǎng)基，接種約0. 5cm2斜面菌種，置搖床 16-23°C避光培養(yǎng)，100r?mirT1震蕩培養(yǎng)4天；觀察液體是否渾濁，若渾濁則剔除；
[0013] 步驟c，出草實驗；
[0014] 將所得的液體菌種通過一定比例配對轉(zhuǎn)接于瓶裝小麥培養(yǎng)基上，于18-20°C避光培養(yǎng)7-15天，菌絲長滿培養(yǎng)基后，培養(yǎng)溫度調(diào)制20-23 °C，見光培養(yǎng)，光照強度 5001X-20001x，持續(xù)光照1-3天，轉(zhuǎn)色后在膜上打孔通風，光照改為每天12小時，濕度控制 在65-85 %，培養(yǎng)40天后，選擇子囊座膨大顯著采收并測定蟲草素含量；
[0015] 步驟d，選擇子囊膨大狀菌株；
[0016] 觀察成熟子實體子囊座膨大程度，選取子囊座膨大顯著且蟲草素含量高的菌株， 從子囊座組織分離得到純化菌株，轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基，采用小麥培養(yǎng)基再次進行出草 試驗；若上述20株菌株未出現(xiàn)子囊座膨大的菌株，則繼續(xù)將剩余的菌，繼續(xù)進行出草試驗， 篩選子囊座膨大蟲草素含量高菌株；
[0017] 觀察成熟子實體子囊座膨大程度，選取子囊座膨大顯著的菌株，從子囊座組織分 離得到純化菌株，轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基，采用小麥培養(yǎng)基再次進行出草試驗；若上述20株 菌株未出現(xiàn)子囊座膨大的菌株，則繼續(xù)將剩余的菌，繼續(xù)進行出草試驗，篩選子囊座膨大蟲 草素含量高菌株。
[0018] 進一步地，上述步驟b中的液體培養(yǎng)基為：玉米粉1-3%、土豆1-3%、葡萄糖 1-3%、蛋白胨 0? 1-3%、磷酸二氫鉀 0? 05-0. 5%、硫酸鎂 0? 01-0. 05%、水 89-96. 9%，121°C 滅菌30min。
[0019] 進一步地，上述步驟c中的小麥的固體培養(yǎng)基：小麥1000g、豆柏10-100g、葡萄 糖10-50g、蛋白胨10-50g、磷酸二氫鉀l-5g、硫酸鎂0. 1-0. 5g、磷酸二氫鉀l-5g、硫酸鎂 0? 1-0. 5g、VB2-片、VB6-片、含水量 55-65%，121°C滅菌 30min。
[0020] 本發(fā)明還提供一種高蟲草素含量的北蟲草菌株的生產(chǎn)工藝，該具體過程為：
[0021] 步驟al，制作培養(yǎng)基，其配方為：小麥1千克，豆柏0. 05千克，蟲草專用促生劑35 克，水1. 5千克；
[0022] 步驟a2,配制方法：將蟲草專用促生劑放入水中，攪至完全溶解即成營養(yǎng)液；每盒 小麥按450克、水0. 7升分裝入塑料盒；分裝完后用耐高溫塑料膜將每個塑料盒蓋嚴并用耐 高溫松緊繩扎一道；
[0023] 步驟a3,滅菌：滅菌鍋內(nèi)加適量水，把培養(yǎng)料盒放入滅菌鍋，升溫至100°C-121 °C， 保持1-8小時；取出，冷卻后移入接種室；用優(yōu)質(zhì)氣霧消毒劑或常規(guī)方法密閉消毒30分鐘， 即可穿戴消毒衣服進入接種室接種；
[0024] 步驟a4,接種：進入接種室應(yīng)迅速關(guān)好門；接種工具、菌種外壁、操作人員雙手，用 75%酒精擦拭或浸沾消毒；采用液體菌種；在無菌條件下，打開封口材料，用接種槍將液體 種噴勾即可；接種量視容器大小而定，或在液體菌種中加入一定比例的無菌水或無菌營養(yǎng) 液再接種的；
[0025] 步驟a5,管理：萌發(fā)室內(nèi)最初將溫度保持16_20°C遮光萌發(fā)8-15天；當菌絲生長 至培養(yǎng)基1/2-2/3時，將溫度升至20°C并進行劃菌；將盒從萌發(fā)室轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室，每天24小 時光照轉(zhuǎn)色1-3天，當培養(yǎng)基轉(zhuǎn)為橘紅和出現(xiàn)菌絲突起時，給予10_15°C的溫差刺激，溫度 提高到20-23°C;對培養(yǎng)室消毒30分鐘，然后在塑料膜上用工具點6-18個孔，濕度保持 65-85%，室內(nèi)適量通氣為子座生長提供足夠氧氣；
[0026] 步驟a6,采收：子座呈橘紅色或橘黃色球狀不再生長時，總培養(yǎng)時間控制在50-70 天；打開盆口用小刀或剪刀將其從基部采下，放入潔凈器具內(nèi)及時烘干或晾干，勿暴曬以免 褪色，干燥后存放。
[0027] 與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)北蟲草品種的多樣 化，優(yōu)選出子囊座膨大且蟲草素含量高的北蟲草菌；外形似蝌蚪，具有很好的市場前景。由 于菌種的特殊性，工業(yè)化生產(chǎn)要求