一種巫山淫羊藿組培快繁方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中植物組織培養(yǎng)的方法，具體地說，涉及一種巫山淫羊藿組培快繁方法。
【背景技術(shù)】
[0002]巫山淫羊藿勝為小檗科淫羊藿屬多年生宿根性草本藥用植物，是我國傳統(tǒng)補(bǔ)益類中藥，也是中國應(yīng)用最為廣泛、最為悠久的中藥之一。巫山淫羊藿富含異戊稀基取代的黃酮類化合物，具補(bǔ)腎陽，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕等功效。用于腎陽虛衰，陽痿遺精，筋骨痿軟，風(fēng)濕痹痛，麻木拘攣，絕經(jīng)期弦暈等疾病的治療。近年來研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿還有抗衰老、提高免疫功能、抑制腫瘤等功效，有很大的開發(fā)潛力，受到了國內(nèi)外學(xué)者的高度重視。
[0003]由于野生巫山淫羊藿自然繁殖率低，生長緩慢加之人們掠奪性采挖，致使野生資源日益減少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能適應(yīng)國內(nèi)外市場的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和臨床醫(yī)學(xué)的需要，人工栽培雖已開展并建立了規(guī)范化種植基地，但是生產(chǎn)上栽培種苗主要是通過分株繁殖和根莖繁殖等傳統(tǒng)方式繁育，由于病毒逐代傳統(tǒng)，導(dǎo)致品質(zhì)下降、產(chǎn)量低下。此外，淫羊藿種子發(fā)育差、具有深休眠的特性，繁殖發(fā)芽率低，生長緩慢，嚴(yán)重制約了其有性繁殖的繁殖系數(shù)及繁育周期。因此，本發(fā)明以巫山淫羊藿嫩芽為外植體，通過不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗移栽等過程成功獲得了巫山淫羊藿離體再植株，建立巫山淫羊藿組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)體系，可以在較短的時(shí)間內(nèi)獲得大量的種苗，對于保護(hù)巫山淫羊藿野生資源、保證藥源，實(shí)現(xiàn)其可持續(xù)利用都有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供出一種巫山淫羊藿組培快繁方法，本發(fā)明以巫山淫羊藿嫩芽為外植體，通過不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗移栽等過程成功獲得了巫山淫羊藿離體再植株，建立巫山淫羊藿組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)體系，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
[0005]本發(fā)明的一種巫山淫羊藿組培快繁方法，包括以下的步驟:
(I)外植體消毒:采取生長健康的巫山淫羊藿芽作為外植體，刮去芽痕，加洗潔精漂30min?50min,然后置于自來水下沖洗30?60min后移至超凈工作臺，用75%的酒精浸泡30?60s,再用0.l%HgCl2消毒4?1min,無菌水沖洗后剝除外層鱗片，再用0.l%HgCl 2浸泡2?5min，無菌水沖洗外植體至無泡沫為止，置于無菌的濾紙上吸干表面水分，剝?nèi)⊙考饨M織備用。
[0006](2)不定芽誘導(dǎo):將已經(jīng)滅菌芽剝?nèi)ネ鈱颖Ｗo(hù)層，露出嫩綠的芽尖接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。接種后置于每天光照12?14小時(shí)，光照強(qiáng)度為1000?20001x，置于培養(yǎng)溫度為25?28°C，空氣相對濕度為75%?80%的條件下培養(yǎng)15天后統(tǒng)計(jì)污染率，45天后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。
[0007](3)增殖培養(yǎng):將誘導(dǎo)所得到的長至2cm左右的叢生芽再分割成2?3個(gè)芽的芽叢接種到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)。接種后置于每天光照12?14小時(shí)，光照強(qiáng)度為1000?20001X，置于培養(yǎng)溫度為25?28°C，空氣相對濕度為75%?80%的條件下培養(yǎng)60天后統(tǒng)計(jì)增殖情況。
[0008](4)生根培養(yǎng):將芽增殖培養(yǎng)基中I?4cm長的正常生長的新芽切下并接種至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)生根。接種后置于每天光照12?14小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000?30001x，置于培養(yǎng)溫度為25?28°C，空氣相對濕度為75%?80%的條件下培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)生根情況。
[0009](5)煉苗移栽:挑選生長良好且根系較為發(fā)達(dá)的組培苗，進(jìn)行煉苗。首先，將所選組培苗的瓶蓋揭開，在組培室里煉苗I?3天，煉苗過程中，注意噴水保持濕度。然后將這些組培苗搬至煉苗室，煉苗2?5天。之后將小苗取出，洗凈培養(yǎng)基，注意防止根系損傷，栽植到由園土:泥炭土:腐殖質(zhì)=2:1:1混合成的基質(zhì)中，移栽30天后統(tǒng)計(jì)成活率。
[0010]上述步驟(2 )所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:WPM+0.1?L Omg/LNAA+1.0?4.0mg/L6-BA+0.5 ?1.5mg/L GA3+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0011]上述步驟(3)所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+1.0?2.0mg/L 6-BA+0.5?1.5mg/LNAA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0012]上述步驟(4)所述的生根培養(yǎng)基為:l/2MS+0.1?1.0mg/LIBA+0.05?0.1%活性炭 +15 ?30g/L 鹿糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0013]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果是:野生巫山淫羊藿自然繁殖率低，生長緩慢加之人們掠奪性采挖，致使野生資源日益減少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能適應(yīng)國內(nèi)外市場的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和臨床醫(yī)學(xué)的需要，人工栽培雖已開展并建立了規(guī)范化種植基地，但是生產(chǎn)上栽培種苗主要是通過分株繁殖和根莖繁殖等傳統(tǒng)方式繁育，由于病毒逐代傳統(tǒng)，導(dǎo)致品質(zhì)下降、產(chǎn)量低下。此外，淫羊藿種子發(fā)育差、具有深休眠的特性，繁殖發(fā)芽率低，生長緩慢，嚴(yán)重制約了其有性繁殖的繁殖系數(shù)及繁育周期。因此，本發(fā)明以巫山淫羊藿嫩芽為外植體，通過不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗移栽等過程成功獲得了巫山淫羊藿離體再植株，建立巫山淫羊藿組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)體系，可以在較短的時(shí)間內(nèi)獲得大量的種苗，對于保護(hù)巫山淫羊藿野生資源、保證藥源，實(shí)現(xiàn)其可持續(xù)利用都有十分重要的意義。
【具體實(shí)施方式】
[0014]以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，不是對本發(fā)明的限制。
[0015]實(shí)施例1
(I)外植體消毒:采取生長健康的巫山淫羊藿芽作為外植體，刮去芽痕，加洗潔精漂30min，然后置于自來水下沖洗30min后移至超凈工作臺，用75%的酒精浸泡30s，再用0.l%HgCl2消毒4min，無菌水沖洗后剝除外層鱗片，再用0.l%HgCl 2浸泡2min，無菌水沖洗外植體至無泡沫為止，置于無菌的濾紙上吸干表面水分，剝?nèi)⊙考饨M織備用。
[0016](2)不定芽誘導(dǎo):將已經(jīng)滅菌芽剝?nèi)ネ鈱颖Ｗo(hù)層，露出嫩綠的芽尖接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。接種后置于每天光照13小時(shí)，光照強(qiáng)度為ΙΟΟΟΙχ，置于培養(yǎng)溫度為25°C，空氣相對濕度為75%的條件下培養(yǎng)15天后污染率低于5%，培養(yǎng)45天后誘導(dǎo)率為 85.5%。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:WPM+0.6mg/LNAA+2.5mg/L 6-BA+l.0mg/L GA3+25g/L 蔗糖+4.7g/L 瓊脂，pH 為 5.6。
[0017](4)增殖培養(yǎng):將誘導(dǎo)所得到的長至2cm左右的叢生芽再分割成2?3個(gè)芽的芽叢接種到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)。接種后置于每天光照13小時(shí)，光照強(qiáng)度為ΙΟΟΟΙχ，置于培養(yǎng)溫度為25°C，空氣相對濕度為75%的條件下培養(yǎng)60天后增殖系數(shù)為3.17。所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+1.5mg/L 6-BA+0.8mg/LNAA+23g/L 蔗糖 +4.5g/L 瓊脂，pH 為 5.5。