一種甘草的組織培養(yǎng)快繁方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中植物組織培養(yǎng)的方法，具體地說，涉及一種甘草的組織培養(yǎng)快繁方法。
【背景技術(shù)】
[0002]甘草(為我國傳統(tǒng)中藥材,也是我國西部荒漠、半荒漠地區(qū)重要的固少植物，含有多種生物化學(xué)成分，目前已從甘草中分離得到300多種黃酮類化合物，60多種三枯類化合物以及香豆素類、多種生物堿等，具有抗炎、抑菌、抗腫瘤、抗病毒等作用。傳統(tǒng)的甘草獲取方法是采挖野生植物資源，造成水土流失和嚴(yán)重土壤沙漠化。此夕卜，甘草種子主要來自野生甘草，其品種混雜，種子稀缺，發(fā)芽極低，野生甘草資源已不能適應(yīng)規(guī)?；蜆?biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的需要，成為妨礙甘草產(chǎn)業(yè)發(fā)展的最大瓶頸。
[0003]國內(nèi)外在植物資源、化學(xué)成分分析、生藥鑒定、藥理作用和臨床應(yīng)用、愈傷組織培養(yǎng)及再分化等方面做了大量的工作，這些研究為以甘草為基源制劑的臨床應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)。但是，甘草生產(chǎn)中仍然存在許多理論和實踐急需解決的問題。為了謀求甘草產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，引領(lǐng)甘草產(chǎn)業(yè)走向高技術(shù)、高規(guī)格、高水準(zhǔn)的科技之路，甘草組織培養(yǎng)已經(jīng)成為目前研究和開發(fā)的熱點。至今為止，尚未見有關(guān)甘草離體快繁的所道，這嚴(yán)重甘草產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。因此，非常有必要建立甘草離體再生體系，以期為甘草的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供技術(shù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種甘草的組織培養(yǎng)快繁方法，本發(fā)明以甘草帶腋芽莖段為外植體，通過叢生芽誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)、根苗誘導(dǎo)以及試管苗馴化移栽等過程實現(xiàn)了甘草的組織培養(yǎng)快速繁殖，從而實現(xiàn)本發(fā)明的目的。
[0005]本發(fā)明的一種甘草的組織培養(yǎng)快繁方法，包括以下的工藝步驟:
(I)外植體的處理:選取健壯甘草植株上切取帶腋芽的莖段作為外植體，剪去葉片，切成3.0?5.0長的帶有I?2個腋芽的節(jié)段先用洗衣粉水沖洗I?3h，再用軟毛刷輕輕刷洗外植體表面將其表面的塵土和部分菌體去除，然后用自來水沖洗I?3h后置于超凈工作臺中，先用75%乙醇消毒5?30s后用無菌水洗3?5次，再用0.1%升汞溶液消毒5?1min,用無菌水沖洗4?6次再用無菌濾紙擦干表面的水珠后備用。
[0006](2)叢生芽導(dǎo):將步驟(I)處理后的帶腋芽莖段切成1.5?2.5cm小段并接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)I?5天，然后置于每天光照10?12小時，光照強(qiáng)度為1500?30001x，直至誘導(dǎo)形成叢生芽。
[0007](3)增殖培養(yǎng):將步驟(2)培養(yǎng)獲得的嫩芽長至約2cm時切離并轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)I?4天，然后置于每天光照12?16小時，光照強(qiáng)度為3000?50001x，置于培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)，多次反復(fù)切割進(jìn)行繼代培養(yǎng)，以得到更多的叢生芽。
[0008](4)生根培養(yǎng):當(dāng)步驟(2)或(3)的叢生芽長至2.5?3.5cm高時，將叢生芽切割成單苗接種至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)I?4天，然后置于每天光照12?16小時，光照強(qiáng)度為2000?30001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至長出根。
[0009](5)試管苗移栽:當(dāng)小苗長出的新根系長達(dá)3cm左右時，并且長出側(cè)根，苗高5cm以上時，將培養(yǎng)瓶瓶蓋打開并置于自然光照下煉苗5?7天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，盡量不傷害根部，栽入經(jīng)滅菌過的蛭石中。
[0010]上述步驟(2)所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+ I?3mg/L NAA+ 0.5?2mg/L 6-BA+0.1 ?lmg/L KT+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值為5.4 ?5.8。
[0011]上述步驟(3)所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+1.0?3.0mg/L 6-BA+0.1?1.0mg/LNAA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值為 5.4 ?5.8。
[0012]上述步驟(5 )所述的生根培養(yǎng)基為:MS+13.5mg/L KH2P04+2.0%?2.5%蔗糖+0.4%?0.6%瓊脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值為5.4?5.8。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點是:以甘草帶腋芽莖段為外植體建立了甘草離體快繁體系，為解決甘草規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明以帶腋芽莖段為外植體，通過叢生芽誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)、根苗誘導(dǎo)以及試管苗馴化移栽等過程實現(xiàn)了甘草的組織培養(yǎng)快速繁殖，以期為甘草的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供技術(shù)支持。
【具體實施方式】
[0014]以下實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，不是對本發(fā)明的限制。
[0015]實施例1:
(I)外植體的處理:選取健壯甘草植株上切取帶腋芽的莖段作為外植體，剪去葉片，切成3.0?5.0長的帶有I?2個腋芽的節(jié)段先用洗衣粉水沖洗2h，再用軟毛刷輕輕刷洗外植體表面將其表面的塵土和部分菌體去除，然后用自來水沖洗Ih后置于超凈工作臺中，先用75%乙醇消毒5s后用無菌水洗3次，再用0.1%升汞溶液消毒5min，用無菌水沖洗4次再用無菌濾紙擦干表面的水珠后備用。
[0016](2)叢生芽導(dǎo):將步驟(I)處理后的帶腋芽莖段切成1.5?2.5cm小段并接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，先在28°C條件下全暗培養(yǎng)3天，然后置于每天光照11小時，光照強(qiáng)度為25001x條件下培養(yǎng)20天每個腋芽莖段有3?5個叢生芽。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+ 2mg/L NAA+lmg/L 6-BA+ 0.5mg/L KT+3.5% 蔗糖 +0.5% 瓊脂 +0.1% 活性炭，pH 值為 5.8。
[0017](3)增殖培養(yǎng):將步驟(2)培養(yǎng)獲得的嫩芽長至約2cm時切離并轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)3天，然后置于每天光照14小時，光照強(qiáng)度為30001x，置于培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)20天增殖倍數(shù)達(dá)到7倍。多次反復(fù)切割進(jìn)行繼代培養(yǎng)，以得到更多的叢生芽。所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/LNAA+3.5%蔗糖+0.5%瓊脂+0.1%活性炭，pH值為5.8。
[0018](4)生根培養(yǎng):當(dāng)步驟(2)或(3)的叢生芽長至2.5?3.5cm高時，將叢生芽切割成單苗接種至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)3天，然后置于每天光照13小時，