專利名稱：：一種龍葵抗蟲基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物抗蟲基因
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體的說，涉及一種龍葵抗蟲基因及其應(yīng)用。技術(shù)背景蟲害是造成農(nóng)業(yè)減產(chǎn)的重要原因之一。據(jù)統(tǒng)計，各種作物因蟲害而遭受的經(jīng)濟損失平均達20%-30%，每年大約損失數(shù)千億美元。植物抗蟲基因工程的誕生，為防治害蟲提供了一條嶄新的途徑。由于該方法具有安全，有效，可降低投資和減少環(huán)境污染等諸多優(yōu)點，因而自1987年首次報道抗蟲轉(zhuǎn)基因植物以來，植物抗蟲基因工程的研究取得了迅猛發(fā)展。目前廣泛應(yīng)用于植物抗蟲基因工程的抗蟲基因按來源可分為三類一類是來源于微生物蘇云金芽孢桿菌(Bt)的殺蟲晶體蛋白基因；第二類是來自高等植物的蛋白酶抑制劑(PI)基因和凝集素基因；第三類為動物來源的蛋白酶抑制劑基因和動物毒素基因。此外，幾丁質(zhì)酶基因、核糖體失活蛋白基因、淀粉酶抑制劑基因、膽固醇氧化酶基因、豌豆脂肪氧化酶基因、多酚氧化酶基因、系統(tǒng)肽、Bt營養(yǎng)期殺蟲蛋白基因、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因及一些非蛋白類殺蟲劑的合成調(diào)控基因也可用于抗蟲植物基因工程。Bt毒蛋白是最先利用的基因，其發(fā)展己經(jīng)有幾十年的歷史了，應(yīng)用的比較成熟。與其它抗蟲基因相比，在同等表達量下，Bt類基因產(chǎn)物的抗蟲能力最強。人們將克隆出的Bt轉(zhuǎn)入植物后，使植物的抗蟲性得到了提高，已經(jīng)有很多種的植物因為轉(zhuǎn)入了Bt蛋白而提高了抗蟲性，轉(zhuǎn)Bt蛋白的植物也成功進入商品市場。但是由于Bt蛋白的毒性太強，對昆蟲的選擇壓力太大，昆蟲容易產(chǎn)生抗性，從而不被Bt殺死。由此，人們普遍把目光轉(zhuǎn)向了一種新的抗蟲基因一蛋白酶抑制劑。天然的蛋白酶抑制劑(PI)是一類對蛋白水解酶有抑制活性的小分子蛋白質(zhì)，普遍存在于植物，動物和微生物中。它能與蛋白酶的活性部位和變構(gòu)部位結(jié)合，抑制酶的催化活性或阻止酶原轉(zhuǎn)化為有活性的酶，抑制蛋白酶降解蛋白質(zhì)的能力。幾乎所有的蛋白酶抑制劑都會與其目的蛋白酶結(jié)合，形成一個穩(wěn)定的，沒有酶活性的蛋白酶一抑制劑復(fù)合物，從而導(dǎo)致蛋白酶的失活。根據(jù)氨基酸序列的同源性，可以將目前發(fā)現(xiàn)的蛋白酶抑制劑劃分為22個家族，包括馬鈴薯蛋白酶抑制劑I家族(PINI)、馬鈴薯蛋白酶抑制劑n(PINII)家族、Kazal絲氨酸蛋白酶抑制劑家族、Bowman-Birk蛋白酶抑制劑家族、Kunitz大豆胰蛋白酶抑制劑家族、膠原酶抑制劑家族、羧肽酶抑制劑家族等等。而根據(jù)所抑制酶的活性基團，蛋白酶抑制劑則可劃分為四大類絲氨酸蛋白酶抑制劑、巰基蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑和酸性蛋白酶抑制劑。蛋白酶抑制劑在醫(yī)藥領(lǐng)域和植物抗病抗蟲領(lǐng)域都有重要的作用。大多數(shù)昆蟲(如大部分鱗翅目、直翅目、雙翅目、膜翅目以及某些鞘翅目)的消化酶以絲氮酸蛋白酶(如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶)為主，因此絲氨酸蛋白酶抑制劑可以有效抑制這類昆蟲的生長和發(fā)育。PINn屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑，主要對胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶有抑制作用。pini和pinn可以抗鱗翅目昆蟲，其中pinn蛋白酶抑制劑的抗蟲性要優(yōu)于PINI，因而在抗蟲基因工程中有廣泛的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種新的蛋白酶抑制劑龍葵抗蟲基因。本發(fā)明的另一個目的是提供含有上述基因的重組質(zhì)粒。本發(fā)明的另一個目的是提供上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的重組微生物。本發(fā)明的進一步目的是提供上述龍葵抗蟲基因在增強植物抗蟲能力中的應(yīng)用。本發(fā)明克隆的龍葵抗蟲基因，屬于PINII基因家族，.是一種在龍葵韌皮部特異表達的基因，其mRNA主要在伴胞和未成熟的篩分子中轉(zhuǎn)錄，其蛋白質(zhì)主要定位于篩分子周壁細胞質(zhì)和篩分子腔內(nèi)，以及篩域孔部位。其編碼的蛋白是一種可以抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的絲氨酸型蛋白酶抑制劑。該基因構(gòu)建的植物表達載體，在花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子的驅(qū)動下超量表達，可獲得具有抗蟲能力的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明為了得到理想的外源蛋白表達效果，在龍葵蛋白酶抑制劑IIa基因(SaPIN2a)基礎(chǔ)上克隆了包含其5'端非翻譯區(qū)(5'UTR)的全長龍葵蛋白酶抑制劑A的cDNA序列，得到的基因命名為NPIA，該基因長496bp(見SEQIDNO:l)。其編碼的氨基酸序列見SEQIDNO:2。本發(fā)明中的NPIA基因可與植物表達載體質(zhì)粒pBI121重組，構(gòu)建獲得龍葵蛋白酶抑制劑A基因的植物表達載體pF-121，NPIA基因由CaMV35S啟動子控制表達。本發(fā)明參照分子克隆第三版98-99頁方法，將含有NPIA基因的植物表達載體pF-121轉(zhuǎn)入大腸桿菌或農(nóng)桿菌；參照Horsch等人(1985)發(fā)展的葉盤轉(zhuǎn)化法，利用攜帶該質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草，獲得轉(zhuǎn)NPIA基因的煙草。本發(fā)明通過PCR檢測轉(zhuǎn)基因陽性植株。從轉(zhuǎn)基因子一代(T1代)開始，做卡那霉素抗性篩選。將卡那抗性植株再做PCR檢測，選擇陽性植株。本發(fā)明通過Northernblot檢測轉(zhuǎn)基因陽性植株。當PCR檢測陽性植株長到8—10片葉，約40cm高的時候，取各個植株相同部位比較嫩的葉片提取總RNA，做Northernblot檢測。選取非轉(zhuǎn)基因煙草及轉(zhuǎn)pBI-121空載體煙草的葉片總的RNA做負對照，非轉(zhuǎn)基因龍葵莖的總RNA做正對照。探針選取龍葵蛋白酶抑制劑基因基因AcDNA片段。結(jié)果表明NPIA基因在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中發(fā)生轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明通過Westemblot檢測陽性植株龍葵蛋白酶抑制劑基因蛋白的表達。提取轉(zhuǎn)基因煙草相同位置的葉片總蛋白做^Vestemblot檢測，選取非轉(zhuǎn)基因煙草及轉(zhuǎn)pBI-121空載體煙草葉片總蛋白做負對照，非轉(zhuǎn)基因龍葵純化的龍葵蛋白酶抑制劑蛋白做正對照。用龍葵蛋白酶抑制劑基因A特異性抗體。結(jié)果表明NPIA基因在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中表達。本發(fā)明參照Kollipara&Hymowitz(1992)和Rickauer等(1989)的方法測量轉(zhuǎn)基因煙草和對照煙草總蛋白對胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶以及昆蟲中腸類胰蛋白酶的抑制能力。其結(jié)果表明NPIA基因在轉(zhuǎn)基因煙草中超量表達時，具有較高的絲氨酸蛋白酶抑制劑活性。轉(zhuǎn)基因的煙草蛋白粗提液對胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶以及昆蟲中腸類胰蛋白酶有抑制活性。其與對照組存在極顯著差異。本發(fā)明通過向轉(zhuǎn)基因煙草人工接種棉鈴蟲和斜紋夜蛾幼蟲試驗，用向非轉(zhuǎn)基因煙草接種幼蟲作對照，研究轉(zhuǎn)基因煙草抗蟲效果。觀察植株受損情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的受損程度明顯低于對照。本發(fā)明通過轉(zhuǎn)基因煙草葉片人工喂養(yǎng)棉鈴蟲和斜紋夜蛾幼蟲試驗，用非轉(zhuǎn)基因煙草葉片詞喂幼蟲作對照，研究轉(zhuǎn)基因的煙草對上述兩種害蟲幼蟲的毒害效果。結(jié)果表明進食轉(zhuǎn)基因煙草的幼蟲的體重與對照存在極顯著差異。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:本發(fā)明提供的NPIA基因是在茄科植物龍葵中分離的基因，其功能是生產(chǎn)蛋白酶抑制劑，提高植物抗蟲性。利用本發(fā)明NPIA基因作為目的基因構(gòu)建植物表達載體，在花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子的驅(qū)動下超量表達，提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲能力，該基因可以用亍抗蟲植物基因工程的研究以及棉鈴蟲，斜紋夜蛾等磷翅目昆蟲的生物防治。圖1為植物表達載體pBI121和pF-121的示意圖2:轉(zhuǎn)基因煙草PCR檢測3:轉(zhuǎn)基因煙草Northernblot檢測圖圖4:轉(zhuǎn)基因煙草Westernblot檢測5:轉(zhuǎn)基因煙草總蛋白抑制活性柱形6:轉(zhuǎn)基因煙草喂食棉鈴蟲和斜紋夜蛾，植株受損情況對比圖。圖7:喂食棉鈴蟲和斜紋夜蛾后，幼蟲體重分析柱形圖。其中，圖1中，A:pBI-121，包括35S啟動子，GUS基因和Nos終止子；B:pF-121，包括35S啟動子，NPIA基因和Nos終止子。圖2中，1:Marker,2:非轉(zhuǎn)基因煙草，3:轉(zhuǎn)空載體煙草，4-8:轉(zhuǎn)NPIA基因煙草。圖3中，1:用非轉(zhuǎn)基因龍葵作正對照，出現(xiàn)一條雜交條帶；2，3:用非轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)空載體煙草作負對照，無雜交條帶；4，5:轉(zhuǎn)NPIA基因煙草，出現(xiàn)一條雜交條帶。圖4中，1:用純化的龍葵蛋白酶抑制劑蛋白作正對照，出現(xiàn)一條雜交條帶；2，3:用非轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)空載體煙草作負對照，無雜交條帶；4，5:轉(zhuǎn)NPIA基因煙草，出現(xiàn)一條雜交條帶。圖5中，A圖轉(zhuǎn)基因煙草總蛋白對胰蛋白酶抑制活性；B圖轉(zhuǎn)基因煙草總蛋白對胰凝乳蛋白酶抑制活性；C圖轉(zhuǎn)基因煙草總蛋白對棉鈴蟲中腸類胰蛋白酶抑制活性；D圖轉(zhuǎn)基因煙草總蛋白對斜紋夜蛾胰蛋白酶抑制活性；1:未加煙草總蛋白，蛋白酶的活性；2:加非轉(zhuǎn)基因煙草總蛋白后，蛋白酶的剩余活性；3:加轉(zhuǎn)空載體煙草總蛋白后，蛋白酶的剩余活性；4:加轉(zhuǎn)NPIA基因煙草轉(zhuǎn)總蛋白后，蛋白酶的剩余活性。具體實施方式實施例1:龍葵蛋白酶抑制劑基因A的獲得及植物表達載體的構(gòu)建根據(jù)龍葵蛋白酶抑制劑基因na(SaPIN2a)序列，設(shè)計基因特異引物，用cDNA末端快速擴增方法獲得5'非翻譯區(qū)(UTR)。利用GeneRacer5，primer禾口GeneRacer5，nestedprimer禾口反向基因特異弓l物2A-KDELSAC1以cDNA為模板進行擴增，將RT-PCR產(chǎn)物克隆到pMD-18T載體得到含5'UTR的載體p5'RACE-TV。合成2a-full-l和2a-full-2—對引物，從p5'RACE-TV-l擴增從轉(zhuǎn)錄起點到UAA終止密碼子的龍葵蛋白酶抑制劑na基因cDNA。產(chǎn)物也克隆到pMD-18T得到pF-TV。用SflmHI+^icI雙酶切pF-TV就得到NPIA基因，該基因長496bp(見SEQIDNO:l)。將得到的NPIA基因代替pBI121上的GUS基因，質(zhì)粒命名為pF-121，用pF-121質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(Amwe/flc/^w)LBA4404。本發(fā)明中的NPIA基因與植物表達載體質(zhì)粒pBI121重組，見圖1A;構(gòu)建獲得龍葵蛋白酶抑制劑A基因的植物表達載體pF-121，見圖1B，NPIA基因由CaMV35S啟動子控制表達。引物序列GsneRac6r5"primer:5，-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3，GeneRacer5'nestedprimer:5，-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3，2A-KDELSAC1:5，-CTGAGCTCTTATAGCTCATCTTTGAAATAAGCAGTGGTCTTGG-3，2a-full-l:5，-GTGGATCCACCCAGAAAAAACAACAACAAAGAAGGCAA-3，2a-full-2:5'-ATGAGCTCTTAGAAATAAGCAGTGGTCTTGGGTTCA-3，實施例2:農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草轉(zhuǎn)化和卡那霉素抗性篩選從平板接種對應(yīng)的農(nóng)桿菌菌株于5mlYEB液體培養(yǎng)基(卡那霉素50mg/ml，利福平50mg/L)，28°C180rpm培養(yǎng)兩天；然后用液體TRM培養(yǎng)基稀釋農(nóng)桿菌液至OD6oo約為0.2-0.3。將無菌的葉片切成小葉盤，放入稀釋的農(nóng)桿菌液中5分鐘。取少量切好的葉片放入無農(nóng)桿菌的液體TRM培養(yǎng)基中，分別移到不含或含有Kan(50mg/L)的平板上做為轉(zhuǎn)化的正負對照。2纊C暗培養(yǎng)兩天；用液體TRM培養(yǎng)基漂洗外植體至少5次。在無菌濾紙上吸干液體。將外植體移至TRM固體平板(含有100昭/ml的卡那霉素，250昭/ml的羧芐青霉素)上，28。C培養(yǎng)。每兩周換一次培養(yǎng)基；4至6周后，切下l2cm的小芽移到組織培養(yǎng)瓶中生根壯苗。培養(yǎng)基為含有100嗎/ml卡那霉素及100嗎/ml羧芐青霉素的MS培養(yǎng)基；待長根后，移入土中。結(jié)果見表l。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例3:將卡那霉素抗性轉(zhuǎn)基因植株作PCR檢測鑒定pF-121(F系列)所用引物5'端引物序列ZF565'-TCCCACTATCCTTCGCAAGACCC-3，3'端引物序列ZF1035，GCGGATCCTTAGAAATAAGCAGTGGTCT-3，鑒定pBI-121(B系歹ij)所用引物5'端引物序列ZF565'-TCCCACTATCCTTCGCAAGACCC-3，3'端引物序列ZF475'-TCACCGAAGTTCATGCCAGT-3，PCR反應(yīng)條件為95°C，5分鐘l個循環(huán)，后經(jīng)95。C50秒，58。C40秒，72。C40秒，35個循環(huán)，然后72。C延伸10分鐘。選擇PCR鑒定為陽性的材料。結(jié)果見表2和圖2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實施例4:轉(zhuǎn)基因植株Northernblot檢測用處理液(l%SDS，0.1MNaOH)處理電泳槽、膠板、梳子、量筒等所有的需用的器皿，DEPC水沖洗干凈。每個樣品取20pgRNA，加入Eppendorf管，用SpeedVacEquipment真空離心機抽干15min。用6filDEPC水溶解。每個樣加入10(ilDMSO，1pl0.2MNa3P04(pH6.5)，3lal乙二醛，混勻。5(TC溫育30min。用lOmM磷酸緩沖液(pH6.5)配制1.5%的瓊脂糖凝膠，倒好膠板。每個樣品加3(il的RNA上樣緩沖液，100V于10mM磷酸緩沖液(pH6.5)電泳。待樣品進膠后，打開磁力攪拌器，令電泳槽兩極的攪拌子轉(zhuǎn)動，使電泳緩沖液循環(huán)流動，待藍色染料到達膠底時電泳結(jié)束。用濾紙制作轉(zhuǎn)移的鹽橋，紙橋兩端搭于轉(zhuǎn)移緩沖液(20XSSC)中，轉(zhuǎn)移過夜。將膜在2XSSC中漂洗一下，然后在空氣中千燥10min。于80。C抽真空烘烤2h。紫外交聯(lián)3min。然后將雜交膜置于預(yù)雜交液中42。C溫育4h。預(yù)雜交液中加入新鮮制備的探針(NPIA基因片段)，混勻，42°C雜交過夜。用2xSSC，0.1%SDS室溫洗膜15min。再用O.lxSSC，0.1免SDS室溫洗30min。然后用保鮮膜將雜交膜包好，放在磷屏中，用透明膠在4個角固定，室溫下放置4h以上或過夜。使用Typhoon8600VariableModeImager掃描信號。結(jié)果見表3和圖3。表3實施例5:轉(zhuǎn)基因植株Westernblot檢測提取植物總蛋白，制備15%的分離膠，5%的濃縮膠。待膠凝固后，組裝垂直電泳槽，灌進SDS-PAGE蛋白電泳緩沖液。將蛋白樣品與等體積的上樣緩沖液混合，95'C變性5分鐘，冷卻后點樣。200V，電泳40~45分鐘，至溴酚藍即將跑出膠。轉(zhuǎn)膜按照Amersham公司的TmnsphorTE62型推薦的程序進行裁剪與凝膠一樣大小的硝酸纖維素膜一張和濾紙數(shù)張，分別用雙蒸水和轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡充分。按3層濾紙、膜、膠、3層濾紙的順序疊好，排除氣泡。用提供的轉(zhuǎn)移夾子固定轉(zhuǎn)移裝置。往轉(zhuǎn)移容器中加入1L預(yù)冷到4'C的轉(zhuǎn)移緩沖液；將整個轉(zhuǎn)移裝置插到轉(zhuǎn)移容器中，盡量驅(qū)除留在海綿上的氣泡。恒電流350mA轉(zhuǎn)移1小時。Western雜交采用NBT/BCIP蛋白顯色檢測系統(tǒng)，其二抗為連有堿性磷酸酶的羊抗兔抗體。操作按照建議進行將電轉(zhuǎn)移之后的硝酸纖維素膜浸泡在TBS中，溫和搖動5-10分鐘。再重復(fù)洗一次。將膜45度浸入到封閉液中，溫和搖動30分鐘到1小時。將膜轉(zhuǎn)到TTBS中，溫和搖動5分鐘。再重復(fù)洗一次。傾去TTBS，加入一抗溶液(NPIA基因特異性抗體，濃度1:20000溶于抗體緩沖液)，溫和搖動過夜。將膜轉(zhuǎn)到TTBS中，溫和搖動5-10分鐘。再重復(fù)洗一次。傾去TTBS，加入二抗溶液(濃度l:3000溶于抗體緩沖液)，溫和搖動l-2小時。用TTBS重復(fù)洗兩次。加入顯色液，待膜上出現(xiàn)明顯雜交帶，終止反應(yīng)。結(jié)果見表4和圖4。表4陽性陰性陽性率轉(zhuǎn)NPIA基因煙草12763.2%轉(zhuǎn)空載體煙草000非轉(zhuǎn)基因煙草000實施例6:轉(zhuǎn)基因煙草總蛋白抑制活性檢測方法胰蛋白酶(TAME法)參考Kollipara&Hymowitz(1992)和Rickauer等(1989)的方法，將樣品與胰蛋白酶混勻，于室溫下放置3分鐘，再加入底物溶液(l.lmmol/LTAME)至總體積為3mL。迅速混勻后，將反應(yīng)液放入分光光度計中，37°C，于247nm處掃描3分鐘，每30秒計數(shù)一次。找出反應(yīng)過程中的線性變化部分的AA，即可計算出活性值。胰凝乳蛋白酶(BTEE法)參考10)1^&1^&Hymowitz(1992)和Rickauer等(1989)，將樣品與胰凝乳蛋白酶混勻，于室溫下放置3分鐘，再加入底物溶液(lmmol/LBTEE)至總體積為3mL。迅速混勻后，將反應(yīng)液放入分光光度計中，37°C，于256nm處掃描3分鐘每30秒計數(shù)一次。找出反應(yīng)過程中的線性變化部分的AA，即可計算出活性值。昆蟲中腸提取物的類胰蛋白酶測定方法參考胰蛋白酶活性測定方法，由適量昆蟲中腸提取物代替商用蛋白酶，不足部分用相應(yīng)分析緩沖液補足。室溫下放置3分鐘，再加入相應(yīng)底物溶液至總體積為3mL。迅速混勻后，將反應(yīng)液放入分光光度計中，37°C，相應(yīng)波長下掃描3分鐘，每30秒計數(shù)一次。找出反應(yīng)過程中的線性變化部分的AA，即可計算出活性值。由圖5可以看出，轉(zhuǎn)基因的煙草蛋白粗提液對胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶以及昆蟲中腸類胰蛋白酶有抑制活性。其與對照組存在極顯著差異(尸O.Ol)。實施例7:人工接種棉鈴蟲、斜紋夜蛾幼蟲試驗當移栽到溫室的轉(zhuǎn)基因植株長至約50cm高，10—12片葉齡時，25"條件下，將植株分為兩組。一組植株接種二齡棉鈴蟲幼蟲10頭，另一組接種二齡夜蛾幼蟲10頭，重復(fù)三次，十四天后分析結(jié)果。如圖6所示，A圖是喂食棉鈴蟲，l為非轉(zhuǎn)基因煙草；2為轉(zhuǎn)空載體煙草；3為轉(zhuǎn)NPIA基因煙草。B圖是喂食斜紋夜蛾；1為非轉(zhuǎn)基因煙草；2為轉(zhuǎn)空載體煙草；3為轉(zhuǎn)NPIA基因煙草。這說明轉(zhuǎn)基因植株的受損程度明顯低于對照組。取下植株上的棉鈴蟲和二齡夜蛾幼蟲，稱重并將數(shù)據(jù)進行方差分析。如圖7所示，A圖是接種棉鈴蟲，l為非轉(zhuǎn)基因煙草；2為轉(zhuǎn)空載體煙草；3為轉(zhuǎn)NPIA基因煙草。B圖是接種斜紋夜蛾，1為非轉(zhuǎn)基因煙草；2為轉(zhuǎn)空載體煙草；3為轉(zhuǎn)NPIA基因煙草。這說明食轉(zhuǎn)基因煙草的幼蟲的體重明顯小于對照組，尸<0.01。綜上所述，本發(fā)明提供的NPIA基因是在茄科植物龍葵中分離的基因，其功能是生產(chǎn)蛋白酶抑制劑，提高植物抗蟲性。利用本發(fā)明NPIA基因作為目的基因構(gòu)建植物表達載體，在花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子的驅(qū)動下超量表達，提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲能力，該基因可以用于抗蟲植物基因工程的研究以及棉鈴蟲，斜紋夜蛾等磷翅目昆蟲的生物防治。一種龍葵抗蟲基因及其應(yīng)用.txtSEQUENCELISTING<110〉<120〉a30〉<160〉<170><210><211〉<212〉〈213〉中山大學(xué)一種龍葵抗蟲基因及其應(yīng)用Patentlnversion3.2496DNA龍葵(Solarmmamericanum)<220>—<221>CDS<222〉(50)..(493)<400〉1acccagaaaaaacaacaacaaagsiaaacaaggtggagaaagcattcataatggetgtt58MetAlaVal1cacaaagttagettccttgettgcctacttgttcttggatggatgttt106HisLysValSerPheUuAlaCysLeuUuValUuGlyTrpMetPhe51015ctacttgcgaaacatgttgatgccaaggettgtactagagaatgtggt154LeuLeuAlaLysHisValAsp人laLysAlaCysThrArgGluCysGiy20253035cattttagetatggcatatgccca.cgtteagaaggaagtccccaaaaa202HisPheSerTyrGlylieCysProArgSerGluGlySerProGinLys404550cctatatgcaccaattgttgcteaggctataagggttgcaactattac250ProlieCysThrAsnCysCysSerGiyTyrLys6iyCysAsnTyrTyr556065agtgetaaaggagatttgatttgtgaaggagaatctgaccctagaaac298SerAlaLysGlyAspLeulieCysGluGlyGluSerAspProArgAsn707580ccaaaagattgtaccttcgaatgtgatacacagattgettatteaaaa346ProLysAspCysThrPheGluCysAspThrGinlieAlaTyrSerLys859095tgtcctcgtteagaaggaaagatgataattaaacccactggatgcacc394CysProArgSerGluGlyLysMetlielieLysProThrGlyCysThr100105110115acttgttgcacgggctatcagggttgctactatttcgatcaagatggt442ThrCysCysThrGlyTyrGinGlyCysTyrTyrPheAspGinAspGly120125130gattttgtctgtgaaggagagagtcctgaacccaagaccactgettat490AspPheValCysGluG丄yGluSerProGluProLysThrThrAlaTyr135140145ttctaa496Phe<210〉2<211>148<212>PT<213>龍葵(Solanumamericanum)<400>2一種龍葵抗蟲基因及其應(yīng)用."tMetAlaValHisLysValSerPheLeuAlaCysLeuLeuValLeuGly1510L5TrpMetPheLeuLeuA丄aLysHisVa丄AspAlaLysAlaCysThrArg202536GluCysGlvHisPheSerTyrGlyHeCysProArgSerGluGlySer354045ProGin匕ysProlieCysThrAsnCysCysSerGlyTyrLysGlyCys505560AsnTvrTyrSerAlaLysGlyAspUulieCysGluGlyGluSerAsp65707580ProArgAsnProLysAspCysThrPheGluCysAspThrGinlieAla859095TyrSerLysCysProArgSerGluGlyLysMetlielieLysProThr100105l丄OGlyCysThrThrCysCysThrGlyTyrGinGlyCysTyrTyrPheAsp115120125GinAspGlyAspPheValCysGluGlyGluSerProGluProLysThr。0135140ThrAlaTyrPhe145<210〉<211〉<212><213>DNA引物<400>3，GeneRacer5'primers'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3'GeneRacer5'nestedprimer:5，-GG/VCACTGACATGGACTGMGGAGTA-3'2A-匿LSACl:5'-CTGAGCTCTTATAGCTCATCTTTGAAATAAGCAGTGGTCTTGG-3，2a-full-1:5，-GTGGATCCACCCAGAAAAAACAACMCAAAGAAGGCAA-3'2a-full-2:5，—ATGAGCTCTTAGAAATAAGCAGTGGTCTTGGGTTCA—3，權(quán)利要求1.一種龍葵抗蟲基因，其DNA序列如SEQIDNO1所示。2.權(quán)利要求1所述龍葵抗蟲基因編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。3.含有權(quán)利要求1所述龍葵抗蟲基因的重組質(zhì)粒。4.含有權(quán)利要求1所述龍葵抗蟲基因的植物表達載體。5.含有權(quán)利要求1所述龍葵抗蟲基因的轉(zhuǎn)基因植物細胞及其再生植株。6.含有權(quán)利要求1所述龍葵抗蟲基因的宿主菌。7.權(quán)利要求1所述龍葵抗蟲基因在增強植物抗蟲能力中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種龍葵抗蟲基因及其應(yīng)用，該基因序列如SEQIDNO1所示。本發(fā)明的龍葵抗蟲基因所編碼的蛋白酶抑制劑對胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性有顯著的抑制作用。該基因的超量表達能夠使轉(zhuǎn)基因植株獲得明顯的對棉鈴蟲和斜紋夜蛾的抗性。該基因在植物抗蟲基因工程領(lǐng)域、醫(yī)藥和分子生物學(xué)領(lǐng)域有重要應(yīng)用價值。文檔編號C07K14/415GK101113451SQ200710028819公開日2008年1月30日申請日期2007年6月26日優(yōu)先權(quán)日2007年6月26日發(fā)明者徐增富,李華鵬,王兆玉,鳴羅,蔡穎鵬申請人:中山大學(xué)