一種達氏鱘精巢細胞冷凍保存液及精巢細胞冷凍保存方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及達氏舞的細胞保存技術領域，具體涉及一種達氏舞精巢細胞冷凍保存 液及精巢細胞冷凍保存方法及應用。
【背景技術】
[0002] 在雄性性腺中，精子起源于精原干細胞（SSCs)，精原干細胞既具有自我復制能力， 又具有分化成為成熟精子的能力。哺乳動物的精子發(fā)生于生精小管內。在鼠科中，人們已經 在功能上證實部分A型精原細胞存在于輸精管基底膜，并通過化療、放療和移植技術完成 了具有干性的評估。在魚的精巢內，精子發(fā)生在精小囊中。生殖細胞存在于支持細胞的胞質 延伸形成精小囊內，并且每個精小囊生殖細胞增殖的同時發(fā)生分化。這種單個生殖細胞，叫 做A型精原細胞，人們推測這些細胞的亞群表現出干細胞效力。2006年，日本學者Okutsu 等建立了虹鱒的精原細胞移植技術。將A型精原細胞的一部分移植到腹膜受體虹鱒胚胎， 向受體胚胎生殖腺移動，并在其內增殖，然后產生了大量功能性的精子。這些結果在功能上 證實魚精巢中存在精原干細胞。此外，Okutsu還發(fā)現精原細胞合并到雌魚卵巢中，分化為 功能齊全的卵，表明整合的精原細胞具有雙性潛能。最后，正常生物個體可以通過來自供體 精原細胞形成的配子受精產生。2007年，代理親魚技術建立，可將精原細胞異種移植入近緣 種。通過這種技術，可將苗種生產昂貴、世代時間長的大型魚類的精原細胞移植到親緣關系 相近但體型較小，世代時間較短的魚種中，縮短世代時間。用于移植的精原細胞需要保證穩(wěn) 定供應，并具有一致品質。通常，從活體上獲取的組織在維持其技能的狀態(tài)下儲藏是有期限 的，為了延長儲藏時間，可利用細胞冷凍保存方法。
[0003] 目前尚未見達氏舞精巢細胞冷凍保存的相關報道。本發(fā)明提供的達氏舞精巢細胞 冷凍保存液及保存方法，在達氏舞精巢細胞超低溫保存過程中，可最大限度降低冰晶對細 胞的損傷。保證復蘇后的高存活率和增殖率，為今后達氏舞精原細胞移植提供基礎。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明目的是在于提供了一種達氏舞精巢細胞冷凍保存液，配方合理，使用方便， 適合對達氏舞精巢細胞的保存，是達氏舞精巢細胞超低溫保存和進行細胞移植所必須的一 種溶液。
[0005] 本發(fā)明另一個目的是提供一種達氏舞精巢細胞冷凍保存方法，利用該方法對達氏 舞精巢細胞進行冷凍保存，能夠提高精巢細胞存活率，為達氏舞精原細胞移植提供長期穩(wěn) 定的細胞供應。
[0006] 本發(fā)明最后一個目的是提供一種達氏舞精巢細胞冷凍保存液在達氏舞精巢細胞 冷凍保存中的應用。
[0007] 為了達到上述目的，本發(fā)明采取以下技術措施：
[0008] -種達氏舞精巢細胞冷凍保存液，包括：
[0009] 牛血清白蛋白(BSA) 37.5-62.5mg/ml 海藻糖 40..ei0inrri〇l/L 乙二醇(EG) 100m!/L. 卵磷脂 OWg/L 胎牛血清 100-400ml/L
[0010] 其余為L-15培養(yǎng)液；
[0011] 所述的冷凍保存液pH為7. 5-8. 5。
[0012] 一種達氏舞精巢細胞冷凍保存液，包括（較好范圍）：
[0013] 牛血清白蛋白(BSA) 42.5-57.5mg/ml 海_糖： 45-55mmoi/l. .乙二醇(EG) 100ml/L 卵磷脂 1-l.lg/L. 眙牛血清 ISO;-3S0m丨八
[0014] 其余為L-15培養(yǎng)液；
[0015] 所述的冷凍保存液pH為7. 7-8. 3。
[0016] -種達氏舞精巢細胞冷凍保存液，包括（優(yōu)選范圍）：
[0017] 牛血清白蛋白(BSA) 45-55mg/ml 海藻糖 47.5-52.5mmol,/L 乙二醇(EG) lODml/L 卵磷脂 5-10g/L 胎牛血清 175-270ml/L
[0018] 其余為L-15培養(yǎng)液；
[0019] 所述的冷凍保存液pH為7. 8-8. 2。
[0020] 一種達氏舞精巢細胞冷凍保存液，包括（最佳范圍）：
[0021] 牛血清白蛋白(BSft): 4B-S2mg/ml 海藻糖 49~5:l.mmol/L 乙二醇(EG) 100ml/L 卵磷脂 ：7.:5-:8.5:g/L 胎牛血清 li30-220ml/L.
[0022] 其余為L-15培養(yǎng)液；
[0023] 所述的冷凍保存液pH為7· 8-8. 1。
[0024] -種達氏舞精巢細胞冷凍保存液，包括（最佳值）：
[0025] 牛血清白蛋白(BSA) S0mg/ml 海藻糖 50mmol/L 乙 IhEG) IQOml/L 卵磷脂 8g/L 胎牛血清 200m丨八.
[0026] 其余為L-15培養(yǎng)液；
[0027] 所述的冷凍保存液pH為8. 0。
[0028] 以上保存液的pH通過1M NaHC03或25mM HEPES調節(jié)。
[0029] -種達氏舞精巢細胞凍存稀釋液的制備方法，其步驟是：
[0030] (1)用移液槍精確量取配置稀釋液所需各液體組分的體積：
[0031] 根據公式：量取體積=配方濃度X稀釋液總體積
[0032] 1)量取L-15培養(yǎng)液加入到離心管中，體積約為需要配制稀釋液體積的三分之二；
[0033] 2)根據需要配制稀釋液體積，量取乙二醇、胎牛血清所需體積加入到L-15培養(yǎng)液 中。
[0034] (2)精確稱取稀釋液所需固體組分的重量，精確度為0.0 Olg :
[0035] 根據公式：量取重量=配方濃度X稀釋液總體積
[0036] 根據需要配制稀釋液體積，稱取牛血清白蛋白、海藻糖、卵磷脂，溶于稀釋液中。
[0037] (3)加 L-15培養(yǎng)液定容至所需溶液體積。0. 2 μ m濾膜過濾除菌?，F用現配。
[0038] 達氏舞精巢細胞冷凍保存方法，包括以下步驟：
[0039] 1)清洗干凈的精巢組織移到另一培養(yǎng)皿中，將精巢組織剪碎至小塊。稱量組織塊， 以消化液：組織塊=4:l(v/w)的比例添加0. 25%胰蛋白酶消化液，20°C培養(yǎng)箱中消化，每 30min吹打一次。
[0040] 2)將步驟1)中的精巢組織消化3h后，加 L-15培養(yǎng)基+20%胎牛血清終止消化， 4〇4111濾網過濾。4°(：，20(^離心51^11。冷凍保存液重懸。
[0041] 3)用冷凍保存液以1 X 105個/ml稀釋細胞。
[0042] 4)取稀釋到標準濃度的細胞懸液5ml放置于冰上平衡20min，分裝至凍存管中；
[0043] 5)程序降溫：降溫程序從0°C開始，以_1°C /min速率降至-80°C，-80°C平衡30min 后放入液氮中，在-196 °C中保存。
[0044] -種達氏舞冷凍保存液在冷凍保存達氏舞精巢細胞中的應用，包括利用本發(fā)明的 提供的冷凍保存液配方進行達氏舞的精巢細胞的冷凍保存。
[00