一種捕食線蟲性真菌凍干制劑及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種凍干制劑及其制備方法與應(yīng)用，具體涉及一種捕食線蟲性真菌凍 干制劑及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 胃腸道線蟲病是家畜最常見的寄生蠕蟲病，呈全世界性分布，給畜牧產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán) 重的經(jīng)濟(jì)損失。長(zhǎng)期以來主要依賴化學(xué)驅(qū)蟲藥來控制家畜胃腸道線蟲，隨著驅(qū)蟲藥的不 斷使用，線蟲對(duì)驅(qū)蟲藥的抗藥性不斷地增強(qiáng)，以及造成環(huán)境污染、畜產(chǎn)品中化藥的殘留等問 題。
[0003] 捕食線蟲性真菌是一類由營(yíng)養(yǎng)菌絲特化形成捕食器捕捉線蟲的真菌，它們是線 蟲的自然天敵，對(duì)線蟲具有獨(dú)特的捕獲和致死能力，因此，利用食線蟲真菌對(duì)家畜寄生 線蟲自由生活階段的幼蟲進(jìn)行生物防治來替代化學(xué)驅(qū)蟲劑是非常有潛力的防治手段。 Arthrobotrys(Duddingtonia)flagrans是典型的能夠產(chǎn)生三維粘性網(wǎng)的菌之一，該菌由 于在培養(yǎng)的中后期能夠產(chǎn)生大量的厚垣孢子，其雙層壁的厚垣孢子對(duì)酸堿和消化酶有耐受 性，可在通過動(dòng)物的胃腸道時(shí)存活下來。正是由于這個(gè)特性，厚垣孢子可通過口服給家畜， 然后與產(chǎn)生的蟲卵隨糞便一起排出體外，溫度適宜時(shí)蟲卵發(fā)育孵化出幼蟲，厚垣孢子也隨 之萌發(fā)成菌絲，進(jìn)而由線蟲的刺激產(chǎn)生三維粘性網(wǎng)殺死線蟲。
[0004] 目前，Arthrobotrys(Duddingtonia)flagrans在動(dòng)物線蟲寄生的生物防治上進(jìn) 行了大量的研究，國(guó)內(nèi)外已對(duì)捕食線蟲性真菌Arthrobotrys(Duddingtonia)flagrans的 菌絲團(tuán)塊或菌厚垣孢子制備成凍干制劑，例如現(xiàn)有技術(shù)CN201410227501.3中公開了一 種捕食線蟲性真菌生物凍干制劑的制備方法，將捕食線蟲性真菌(ΠΜ菌株在大麥粒培養(yǎng) 基上進(jìn)行厚壁孢子的批量培養(yǎng)，然后用0.2%吐溫洗脫并保護(hù)厚壁孢子，再分裝滅菌、預(yù) 凍、真空冷凍干燥后獲得。該發(fā)明中吐溫既可作分散劑也可充當(dāng)保護(hù)劑，但吐溫濃度太 低對(duì)厚垣孢子的保護(hù)作用不明顯，若濃度在5%以上雖能起到保護(hù)作用，但因粘度高無 法凍干。至今研究尚未解決生防制劑的批量化生產(chǎn)、規(guī)格化和有效含量的標(biāo)準(zhǔn)化問題。 因此，在動(dòng)物寄生蟲病防治中所面臨的重要問題是，如何制備一種既能讓家畜隨草料口 月艮，不被消化酶破壞；更能夠在保存、運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)保持良好活性，減少對(duì)捕食線蟲性真菌 Arthrobotrys(Duddingtonia)flagrans厚垣孢子損傷的可規(guī)模生產(chǎn)的食線蟲性真菌凍干 制型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，一種捕食線蟲性真菌凍干制劑及其制備方法與應(yīng) 用。
[0006] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是，一種捕食線蟲性真菌凍干制劑，是將 捕食線蟲性真菌Arthrobotrys(Duddingtonia)flagrans分離株進(jìn)行厚垣孢子批量培養(yǎng)， 然后0. 04%~0. 06%的滅菌吐溫-80洗脫、過濾制成0. 3~0. 6X106個(gè)/ml的孢子液，接 著用10%~20%的β-環(huán)狀糊精洗脫保護(hù)，最后經(jīng)預(yù)凍、真空冷凍干燥后制成。
[0007] 進(jìn)一步，所述捕食線蟲性真菌分離株SDH035,屬于鞭式節(jié)叢孢（Arthrobotrys f·lagrans)，其保藏編號(hào)為CGMCCN0.11210，保藏日期為2015年8月31日，保藏單位：中 國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其簡(jiǎn)稱為CGMCC;保藏地址：北京市朝陽區(qū) 北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生 物中心，郵編100101。
[0008] 本發(fā)明進(jìn)一步解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是，一種捕食線蟲性真菌凍干制劑 的制備方法，包括以下步驟：
[0009] (1)孢子液的制備：將捕食線蟲性真菌分離株在培養(yǎng)基（優(yōu)選玉米和小麥聯(lián)合谷 粒培養(yǎng)基）上進(jìn)行厚垣孢子批量培養(yǎng)15~45天，然后用0. 04%~0. 06%的滅菌吐溫-80 洗脫厚垣孢子，過濾（優(yōu)選兩層滅菌紗布過濾），制成含厚垣孢子濃度為〇. 3~0. 6X106個(gè) /ml的孢子液；
[0010] (2)凍干保護(hù)劑的洗脫保護(hù)：將孢子液與等量10%~20%的β-環(huán)狀糊精混合均 勻；
[0011] (3)預(yù)凍、真空冷凍干燥：置于-20°C預(yù)凍過夜后，在冷阱溫度-45~-50°C、真空 度8~10Pa的條件下進(jìn)行真空冷凍干燥14~18小時(shí)，即得捕食線蟲性真菌口服生物制劑。
[0012] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是，一種捕食線蟲性真菌凍干制劑在動(dòng)物 寄生線蟲生物防治中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明之捕食線蟲性真菌凍干制劑不僅可口服，節(jié)約成本，方便實(shí)施，而且更能夠 在保存、運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)保持良好活性，對(duì)厚垣孢子起到很好的保護(hù)作用。本發(fā)明制備方法不僅 適合于保存菌種，更適合于規(guī)?；a(chǎn)凍干制劑。
[0014] 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明之捕食線蟲性真菌凍干制劑在體外對(duì)三期幼蟲的殺蟲率可達(dá) 97%以上。
【附圖說明】
[0015] 圖1為凍干后的樣品。1、不加保護(hù)劑的對(duì)照組；2.、加入5%β-環(huán)狀糊精保護(hù)劑； 3、加入10%β-環(huán)狀糊精保護(hù)劑；4、加入15%β-環(huán)狀糊精保護(hù)劑；5、加入20%β-環(huán)狀 糊精保護(hù)劑。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步加以說明。
[0017] 實(shí)施例1:捕食線蟲性真菌凍干制劑的制備
[0018] (1)捕食線蟲性真菌Arthrobotrys(Duddingtonia)flagrans分離株SDH035 的分 離、純化、分離鑒定
[0019]SDH035于2014年8月，從來源于寧夏吳忠地區(qū)羊糞堆所采的5份樣品中采用改 良的平板撒布法分離，分離時(shí)在平皿中加入綿羊線蟲第三期幼蟲作誘餌25°C孵化，每天 或隔天在倒置顯微鏡下檢查一次，持續(xù)3周，挑出單個(gè)的捕食結(jié)構(gòu)或被捕食的線蟲，轉(zhuǎn)接 入0. 2 %麩皮瓊脂25°C培養(yǎng)3-14天，待有分生孢子長(zhǎng)出后，挑取單個(gè)的分生孢子于另一個(gè) 〇. 2%麩皮瓊脂平皿中直至獲得純培養(yǎng)物。通過玻片插入法獲得該菌株分生孢子的形態(tài)和 數(shù)據(jù)測(cè)量，并提取該菌種的DNA，用引物ITS1和ITS4 (white等1990和campos等2010)進(jìn) 行擴(kuò)增rDNA中5. 8S、ITS-1和ITS-2序列。其結(jié)果從5份樣品15份平皿中分離純化獲得 SDH035菌種一株，形態(tài)學(xué)和分子學(xué)鑒定該菌與A.flagrans相一致。SDH035的形態(tài)特征為： 在2%玉米粉瓊脂中菌落為白色，菌絲較為稀疏，菌絲透明、分隔、分枝，當(dāng)培養(yǎng)至7天時(shí)就 可產(chǎn)生大量的厚垣孢子，而分生孢子相對(duì)很少；分生孢子梗透明、直立、分隔，長(zhǎng)117. 5~ 387. 5(平均為241. 59)μπι，基部寬5~7· 5μπι，端部寬2. 5~5μπι;分生孢子呈卵圓形、 長(zhǎng)卵圓形和橢圓形，以1個(gè)分隔為主，偶有2個(gè)分隔或3-4個(gè)分隔，0個(gè)分隔的也時(shí)常可見； 分生孢子長(zhǎng)20~57. 5 (平均為38. 89)μm、寬10~17 (平均為12. 87)μm。此外，當(dāng)28°C 培養(yǎng)在玉米與小麥粒聯(lián)合培養(yǎng)基，3天即可產(chǎn)生大量的圓形性、橢圓形的厚垣孢子（可達(dá)到 6X104個(gè)/克），直徑15~30 (平均25. 8)μm。
[0020] SDH035的主要生理、生物學(xué)特征為：該菌在12°C-35°C范圍內(nèi)能生長(zhǎng)，最佳生長(zhǎng)溫 度為28°C;在pH為2~13范圍內(nèi)能夠生長(zhǎng)，最佳生長(zhǎng)pH值為9~10 ;生長(zhǎng)的相對(duì)濕度在 90%~100%為最佳；該菌在水瓊脂上產(chǎn)生厚垣孢子而不產(chǎn)生分生孢子；厚垣孢子能夠耐 受紫外線照射12小時(shí)；干燥能引起厚垣孢子的萌發(fā)率快速下降；厚垣孢子能夠耐受40~ 50°C水浴處理1小時(shí)，但60°C水浴作用30分鐘后僅個(gè)別萌發(fā)，60°C以上作用30分鐘后不能 萌發(fā)。該菌與綿羊三期幼蟲和秀麗新桿線蟲互作后，產(chǎn)生三維粘性網(wǎng)并捕捉線蟲。
[0021] (2)將捕食線蟲性真菌分離株SDH035在玉米和小麥聯(lián)合谷粒培養(yǎng)基上進(jìn)行批量 培養(yǎng)15~45d，然后用0