狐尾蘭組織培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種狐尾蘭組織培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]狐尾蘭(Rhynchos tylis gigantea)又名鉆喙蘭、海南鉆喙蘭為蘭科鉆喙蘭尾多年生附生草本，其在野生環(huán)境下多附生于橡膠樹、楓樹或榕樹上，是我國海南野生名優(yōu)蘭品種之一。狐尾蘭葉片肥厚、翠綠，寬帶狀，外彎，多有數(shù)條淺色的縱條紋，莖直立，具數(shù)節(jié)，不分枝。狐尾蘭花序直立或呈下垂?fàn)睿一ㄐ蚨喽芗?；花瓣比萼片小；其唇瓣呈淺3裂或不裂狀；距兩側(cè)壓扁；蕊柱短，蕊柱足較短；花粉塊2個(gè)，有不同程度的裂隙，呈蠟質(zhì)狀；具有狹長的蕊喙柄以及較小粘盤，花期通常在1-3月。狐尾蘭的花色也較為豐富，有紅、粉紅、白、藍(lán)、橘等顏色。由于其花型獨(dú)特，花色豐富，花期長，且花期為我國傳統(tǒng)春節(jié)前后，是極好的新春賀歲花卉，因此受到人們的極度喜歡[1]。
[0003]然而，由于我國海南地區(qū)熱帶森林過量采伐，致使野生狐尾蘭的自然生境受到嚴(yán)重破壞，加上人為的過度采集出售，致使野生狐尾蘭數(shù)量銳減，嚴(yán)重影響了狐尾蘭生態(tài)群的構(gòu)成。且由于狐尾蘭的種子在自然條件下不易萌發(fā)，采用種子繁殖很難獲得后代，雖然可以采取分株方法，但是這種方法不僅繁殖系數(shù)低，且繁殖速度非常慢，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場的需求[2]。
[0004]目前，通過組織培養(yǎng)的技術(shù)來快速繁殖已在很多蘭科植物普遍應(yīng)用，比較常見的如蝴蝶蘭、大花蕙蘭等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供一種狐尾蘭組織培養(yǎng)方法，為狐尾蘭工廠化育苗提供科學(xué)依據(jù)。
[0006]本發(fā)明是以如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種狐尾蘭組織培養(yǎng)方法，以狐尾蘭未成熟種子作外植體，應(yīng)用組織培養(yǎng)等生物技術(shù)對狐尾蘭類原球莖體誘導(dǎo)、增殖和催根并獲得狐尾蘭組織培養(yǎng)所需培養(yǎng)基的最佳條件；具體步驟如下:
1)無菌材料的獲得
用去離子水沖洗狐尾蘭果實(shí)表面，然后在超凈工作臺(tái)上用80%酒精表面消毒果實(shí)2min,無菌水沖洗3次，再用無菌濾紙吸干水分，然后用解剖刀切開莢果，取出細(xì)小種子，輕輕將種子均勻散落到固體培養(yǎng)基上，每平板接種量為55粒種子；
2)類原球莖體誘導(dǎo)
把狐尾蘭的種子分別接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)原球莖(類原球莖體)的形成。培養(yǎng)基組成成分如下:VW+6_BA1.5mg/L+NAA0.lmg/L ；
3)培養(yǎng)方式的篩選
將誘導(dǎo)出的類原球莖體接種在1/2MS培養(yǎng)基上，分別采用固體培養(yǎng)和液體轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)兩種方式，4次重復(fù)，每個(gè)處理接種20個(gè)三角瓶；四周后統(tǒng)計(jì)類原球莖體的增殖倍數(shù)；其增殖倍數(shù)=新長出的類原球莖體/接種類原球莖體數(shù)； 4)植物生長調(diào)節(jié)劑濃度的篩選
以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的BA，KT, IBA NAA這四種生長調(diào)節(jié)劑，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每處理4次重復(fù)，每個(gè)處理接種20個(gè)三角瓶；四周后統(tǒng)計(jì)類原球莖體的增殖倍數(shù)，計(jì)算方法同步驟3)；
5)不同添加物對類原球莖體的褐化
以1/2MS為基本培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的維生素C、活性炭AC和Na2S203;分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每處理3次重復(fù)，每個(gè)處理接種20個(gè)三角瓶；50天后觀察并記錄類原球莖體褐化和生長狀況。
[0007]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明通過對不同條件下類原球莖體增殖倍數(shù)的研究，來明確培養(yǎng)基中各種成分的作用方式，最終得出如下結(jié)論:1)液體培養(yǎng)基有利于類原球莖體短期的快速增殖，長期繼代培養(yǎng)及保存類原球莖體時(shí)選用固體1/2MS培養(yǎng)基適宜；(2)在培養(yǎng)過程中，施加lmg/L的BA的效果更優(yōu)，可以增加類原球莖體的數(shù)目，又不會(huì)引起玻璃化的產(chǎn)生；(3)在培養(yǎng)基中加入1.0g/L維生素C可以有效抑制外植體的褐化。
【具體實(shí)施方式】
[0008]實(shí)施例1
1)無菌材料的獲得
用去離子水沖洗狐尾蘭果實(shí)表面，然后在超凈工作臺(tái)上用80%酒精表面消毒果實(shí)2min,無菌水沖洗3次，再用無菌濾紙吸干水分，然后用解剖刀切開莢果，取出細(xì)小種子，輕輕將種子均勻散落到固體培養(yǎng)基上，每平板接種量為55粒種子；
2)類原球莖體誘導(dǎo)
把狐尾蘭的種子分別接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)原球莖(類原球莖體)的形成。培養(yǎng)基組成成分如下:VW+6_BA1.5mg/L+NAA0.lmg/L ；
3)培養(yǎng)方式的篩選
將誘導(dǎo)出的類原球莖體接種在1/2MS培養(yǎng)基上，分別采用固體培養(yǎng)和液體轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)兩種方式，4次重復(fù)，每個(gè)處理接種20個(gè)三角瓶；四周后統(tǒng)計(jì)類原球莖體的增殖倍數(shù)；其增殖倍數(shù)=新長出的類原球莖體/接種類原球莖體數(shù)；
4)植物生長調(diào)節(jié)劑濃度的篩選
以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的BA，KT, IBA NAA這四種生長調(diào)節(jié)劑，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每處理4次重復(fù)，每個(gè)處理接種20個(gè)三角瓶；四周后統(tǒng)計(jì)類原球莖體的增殖倍數(shù)，計(jì)算方法同步驟3)；
5)不同添加物對類原球莖體的褐化
以1/2MS為基本培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的維生素C、活性炭AC和Na2S203;分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每處理3次重復(fù)，每個(gè)處理接種20個(gè)三角瓶；50天后觀察并記錄類原球莖體褐化和生長狀況。
[0009]實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析
結(jié)果顯示:液體1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)的類原球莖體的增殖倍數(shù)極顯著的高于固體1/2MS培養(yǎng)基條件下的增殖速度。但同時(shí)也表現(xiàn)出固體1/2MS培養(yǎng)基上的類原球莖體的外觀表現(xiàn)較好，呈現(xiàn)出嫩綠色的外觀，質(zhì)地緊致。而在液體培養(yǎng)基中類原球莖體粒數(shù)多，顆粒大但組織結(jié)構(gòu)較疏松，且嚴(yán)重玻璃化，喪失了分化能力，這與陳春滿(2002)在象牙白花蘭種子的組織培養(yǎng)研究結(jié)果類似M。因此，液體培養(yǎng)基有利于類原球莖體短期的快速增殖，一旦時(shí)間過長，將喪失分化能力。如果要長期繼代培養(yǎng)及保存類原球莖體時(shí)選用固體1/2MS培養(yǎng)基適宜。
[0010]3.2植物生長調(diào)節(jié)濃度對類對圓球莖體增值的影響
結(jié)果顯示:可以看出細(xì)胞分裂素KT、BA都對類圓球莖體的增值明顯的促進(jìn)作用。表上看，0.45mg/L的KT相對于BA的增值效果更好一些，這樣說明了狐尾蘭類圓球莖體對KT反應(yīng)較為敏感，超過一定濃度，如濃度達(dá)到lmg/L或高于這個(gè)濃度，則會(huì)增加類圓球莖體玻璃化的幾率。因此，筆者認(rèn)為1.0mg/L濃度的KT相對于BA效果更好，說明此狐尾蘭的根狀莖對KT更敏感。
[0011]3.3不同添加物對類圓球莖體褐化的影響
前人的研究認(rèn)為活性炭、維生素C和他23203可以減緩或抑制培養(yǎng)物褐化。在1/2MS培養(yǎng)基中添加不同附加物，并觀察比較其對類圓球莖體生長狀況的影響。施結(jié)果顯示:Na2S203沒有有效抑制狐尾蘭褐化，為了確認(rèn)這一結(jié)果，筆者又對外植體進(jìn)行了暗培養(yǎng)、接種前用Na2S203浸泡外植體等處理，均沒有抑制狐尾蘭褐化。這可能是由于醌類化合物被外植體排到培養(yǎng)基中，從而抑制了植物體內(nèi)的酶活性。不同濃度維生素C也有在一定程度上也能抑制褐化，不同濃度活性炭一定程度上也能抑制褐化，其原因可能是活性炭吸附了培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)時(shí)，也常常會(huì)吸附營養(yǎng)物質(zhì)，因此，筆者推薦0.8mg/L維生素C作為外植體褐化的抑制劑。除此之外，長時(shí)間繼代培養(yǎng)可使培養(yǎng)物逐漸脫除酚類物質(zhì)。
[0012]根據(jù)本發(fā)明并結(jié)合前人的研究結(jié)果，對狐尾蘭組織培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化研究最終得出如下結(jié)論:(1)液體培養(yǎng)基有利于類原球莖體短期的快速增殖，一但時(shí)間過長，將喪失分化能力，如果要長期繼代培養(yǎng)及保存類原球莖體時(shí)選用固體1/2MS培養(yǎng)基適宜；(2)在培養(yǎng)過程中，施加1.0mg/L的BA的效果會(huì)更優(yōu)一些，及可以增加類原球莖體的數(shù)目，又不會(huì)引起玻璃化的產(chǎn)生；(3)在培養(yǎng)基中加入1.0g/L維生素C可以有效抑制外植體的褐化。
[0013]對這些實(shí)施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實(shí)施例中實(shí)現(xiàn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種狐尾蘭組織培養(yǎng)方法，其特征在于:以狐尾蘭未成熟種子作外植體，應(yīng)用組織培養(yǎng)等生物技術(shù)對狐尾蘭類原球莖體誘導(dǎo)、增殖和催根并獲得狐尾蘭組織培養(yǎng)所需培養(yǎng)基的最佳條件；具體步驟如下: 1)無菌材料的獲得 用去離子水沖洗狐尾蘭果實(shí)表面，然后在超凈工作臺(tái)上用80%酒精表面消毒果實(shí)2min,無菌水沖洗3次，再用無菌濾紙吸干水分，然后用解剖刀切開莢果，取出細(xì)小種子，輕輕將種子均勻散落到固體培養(yǎng)基上，每平板接種量為55粒種子； 2)類原球莖體誘導(dǎo) 把狐尾蘭的種子分別接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)原球莖(類原球莖體)的形成；培養(yǎng)基組成成分如下:VW+6_BA1.5mg/L+NAA0.lmg/L ； 3)培養(yǎng)方式的篩選 將誘導(dǎo)出的類原球莖體接種在1/2MS培養(yǎng)基上，分別采用固體培養(yǎng)和液體轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)兩種方式，4次重復(fù)，每個(gè)處理接種20個(gè)三角瓶；四周后統(tǒng)計(jì)類原球莖體的增殖倍數(shù)；其增殖倍數(shù)=新長出的類原球莖體/接種類原球莖體數(shù)； 4)植物生長調(diào)節(jié)劑濃度的篩選 以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的BA，KT, IBA NAA這四種生長調(diào)節(jié)劑，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每處理4次重復(fù)，每個(gè)處理接種20個(gè)三角瓶；四周后統(tǒng)計(jì)類原球莖體的增殖倍數(shù)，計(jì)算方法同步驟3)； 5)不同添加物對類原球莖體的褐化 以1/2MS為基本培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的維生素C、活性炭AC和Na2S203;分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每處理3次重復(fù)，每個(gè)處理接種20個(gè)三角瓶；50天后觀察并記錄類原球莖體褐化和生長狀況。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種狐尾蘭組織培養(yǎng)方法。本發(fā)明以狐尾蘭未成熟種子作外植體，應(yīng)用組織培養(yǎng)等生物技術(shù)對狐尾蘭類原球莖體誘導(dǎo)、增殖和催根并獲得狐尾蘭組織培養(yǎng)所需培養(yǎng)基的最佳條件；(1)液體培養(yǎng)基有利于類原球莖體短期的快速增殖，長期繼代培養(yǎng)及保存類原球莖體時(shí)選用固體1/2MS培養(yǎng)基適宜；(2)在培養(yǎng)過程中，施加1mg/L的BA的效果更優(yōu)一些，及可以增加類原球莖體的數(shù)目，又不會(huì)引起玻璃化的產(chǎn)生；(3)在培養(yǎng)基中加入1.0g/L維生素C可以有效抑制外植體的褐化。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105409781
【申請?zhí)枴緾N201511012875
【發(fā)明人】潘紅娟, 張坤, 吳言紅
【申請人】鎮(zhèn)江常青園林工程有限公司
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年12月31日