三葉青側(cè)枝誘導(dǎo)的種苗培育方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種Ξ葉青側(cè)枝誘導(dǎo)的種苗培育方法，屬于組織培養(yǎng)植物再生技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] Ξ葉青是民間常用藥，塊根或全草可W入藥，可用于治療高熱驚厥、肺炎、哮喘、肝 炎、腎炎、風(fēng)濕搏痛、跌打損傷、癡療瘡巧、濕疹、蛇傷等（國家中醫(yī)藥管理局（中華本草)編委 會（1999)中華本草，上海科學(xué)技術(shù)出版社）?！侗静菥V目》記載"Ξ葉崖爬藤，性味苦、辛、涼， 清熱解毒、活血桂風(fēng)"；《植物名實圖考》記載"蛇附子可治小兒高熱、止腹痛、取漿沖服"；《浙 江民間常用草藥》記載"治小兒風(fēng)熱，驚風(fēng)和痛氣痛;治蛇咬"；《江西草藥》記載"治小兒高熱 驚厥，肺炎，肝炎，外傷出血"等等。近年來在現(xiàn)代藥理學(xué)、化學(xué)成分等方面取得了一些進展， 本文對Ξ葉青的化學(xué)成分、藥理作用、臨床應(yīng)用及生物工程等研究現(xiàn)狀進行較為系統(tǒng)的闡 述，為研究者提供借鑒。
[0003] 在S葉青的栽培技術(shù)方面，Dai等化ffects of shade treatments on the photosynthetic c曰p曰city,chlorophyll fluorescence,曰nd chlorophyll content of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg.Environmental and Experimental Botany， 65,177-182)將Ξ葉青在強、中、弱光照條件下培養(yǎng)一個月后，通過觀察葉片形態(tài)、凈光合速 率及葉綠素巧光反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)遮光率低于50%會降低Ξ葉青光合活性而高于75%則限制碳同 化作用，都會抑制植物生長，對于Ξ葉青培養(yǎng)，約67%的遮光率才是最適合的光照條件;牟 豪杰和董愛蘭(CN 101822166A)提供了一套Ξ葉青人工栽培的實施步驟，從選擇種植地、種 植時間、繁殖材料類型，到施肥、追肥、使用遮蔭棚，到最后的采收等都進行了優(yōu)化選擇;吉 慶勇（Ξ葉青桿插繁殖技術(shù)研究，現(xiàn)代中藥研究與實踐，2,12-14)根據(jù)生根劑用量、插穗年 齡和基質(zhì)對插穗生根的影響進行了研究，發(fā)現(xiàn)2~3年生老枝用lOOOmg/L IBA溶液浸潰10s 后桿插于黃±中生根效果最佳;吉慶勇（CN 102919013A)發(fā)明了一種高效仿野生栽培技術(shù) 方法，與人工栽培不同的是，增加了滴灌設(shè)備、微生物菌肥，并引導(dǎo)Ξ葉青上架進行立體種 植。傅婷婷(Ξ葉青總黃酬的提取及純化工藝研究，碩±論文，浙江大學(xué))對Ξ葉青總黃酬提 取及純化工藝進行研究，利用紫外/可見分光光度法建立了總黃酬含量測定方法，利用大孔 吸附樹脂法優(yōu)化了其純化條件。嚴余明（不同工藝Ξ葉青制劑對人肺癌A549裸鼠移植瘤生長 抑制作用比較研究，浙江中醫(yī)雜志，8,604-606)通過Ξ種不同工藝制得的Ξ葉青藥劑(凍干 粉、水煎劑、飲片粉)灌喂人肺癌A549移植瘤裸鼠，測定其腫瘤生長動態(tài)體積和抑瘤率，發(fā)現(xiàn) Ξ葉青凍干粉和飲片粉抗人肺癌A 549裸鼠移植瘤的作用強于水煎劑，而凍干粉發(fā)揮抑瘤 效果的時間要早于飲片粉。顯而易見，Ξ葉青的栽培和加工工藝的研究比較滯后，需要進一 步加大投入研究力度，提高Ξ葉青的種植和加工工藝水平。
[0004] 目前，Ξ葉青生物工程主要設(shè)及組織培養(yǎng)。錢麗華(藥用植物"Ξ葉青"的組培快繁 技術(shù)研究，杭州農(nóng)業(yè)科技，6,22-23) 葉青蔽芽為材料，進行了蔽芽外植體誘導(dǎo)技術(shù)、不 定芽繼代增殖技術(shù)及試管苗生根技術(shù)研究，實現(xiàn)了其離體快速繁殖，并發(fā)現(xiàn)23μπιο1 . πΓ2 · s^i的光照強度有利于蔽芽的萌發(fā);鐘銃倩(Ξ葉青的組織培養(yǎng)與快速繁殖研究，浙江中醫(yī)雜 志，6,363)用Ξ葉青的莖尖、帶蔽芽的莖段和葉片為外植體，研究發(fā)現(xiàn)最佳誘導(dǎo)外植體為莖 尖；Jiang W.Μ.等（High-frequency shoot regeneration of nodal explants from Tetrastigma hemsleyanum Diels et GiIg：Avaluable medicinal plant.African Journal of Biotechnology, 10,12177-12181)用Ξ葉青的帶蔽芽的莖段為外植體，通過對 外植體的選取與處理、誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、移栽等步驟建立了一套組培快繁體 系；盧愛芳等ΓΞ葉青愈傷組織培養(yǎng)及其總黃酬含量的研究"，中藥材，7，1042-1045)ΚΞ 葉青葉片、莖段和無菌苗葉片為外植體，誘導(dǎo)形成愈傷組織，并對其中兩種愈傷組織、葉片、 塊根中的總黃酬含量進行測定，發(fā)現(xiàn)總黃酬在愈傷組織中含量較高;彭昕Γ正交法優(yōu)化Ξ 葉青繼代增殖與生根培養(yǎng)的條件"，現(xiàn)代中藥研究與實踐，2,10-12)等用Ξ葉青的幼嫩帶芽 莖段為外植體，通過正交試驗對其蔽芽增殖、生根培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，得出最適培養(yǎng)基。
[0005] 上述培育方法通常是ΚΞ葉青的芽、葉片、根莖等作為培養(yǎng)對象，其優(yōu)勢在于生長 快，但所培養(yǎng)的植物苗弱，環(huán)境適應(yīng)性差，尤其是在轉(zhuǎn)移栽培過程中，成活率較低，并不利于 Ξ葉青的培養(yǎng)。
[0006] 基于此，做出本申請。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了克服現(xiàn)有Ξ葉青培養(yǎng)所存在的上述缺陷，本發(fā)明提供一種培養(yǎng)快捷、成活率 高、苗壯、環(huán)境適應(yīng)性強的Ξ葉青側(cè)枝誘導(dǎo)的種苗培養(yǎng)方法。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：
[0009] Ξ葉青側(cè)枝誘導(dǎo)的種苗培養(yǎng)方法，ΚΞ葉青帶蔽芽的莖段作為處理對象，進行如 下操作：（1)無菌材料:剪取Ξ葉青帶蔽芽的莖段，清洗得到無菌材料；（2)培養(yǎng)基：WMS或1/ 2MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加生長素或/和細胞分裂素，分別得到初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基和生 根培養(yǎng)基，初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基與生根培養(yǎng)基中薦糖含量不同；（3)初代培養(yǎng):將步驟 (1)中的無菌材料接種到初代培養(yǎng)基上，并露出蔽芽，培養(yǎng)30-45天，得到初代無菌苗，側(cè)枝 發(fā)達；（4)繼代增殖培養(yǎng):將初代無菌苗側(cè)枝分離，剪取帶蔽芽和3-6片葉片的側(cè)枝，轉(zhuǎn)接于 繼代培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)，誘導(dǎo)側(cè)枝生長，得繼代苗：（5)壯苗生根培育:繼代苗分離并轉(zhuǎn)入MS 培養(yǎng)基中，進行壯苗培養(yǎng)30天后，進入生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)10-20天，得生根無菌苗；（6)馴化： 將生根無菌苗移至人工氣候室，加水至高于培養(yǎng)基表面，光照馴化培養(yǎng)3-5天；（7)移栽:將 賠石:草炭±安裝2:1的質(zhì)量比混合，高壓滅菌后作為基質(zhì)，將馴化后的苗洗去培養(yǎng)基，在僅 保留頂端葉片的情況下移在基質(zhì)中，即完成Ξ葉青的培養(yǎng)。
[0010] 進一步的，作為優(yōu)選：
[0011] 步驟(1)中，所選取的Ξ葉青莖段是現(xiàn)在人工氣候室中培養(yǎng)15-30天后所剪取的新 抽出枝條上半木質(zhì)化的帶蔽芽莖段，與常規(guī)直接剪取野外Ξ葉青枝條相比，預(yù)先培養(yǎng)，有利 于Ξ葉青的緩沖培養(yǎng)，大大減少污染率;所述的清洗是指:將剪取的Ξ葉青帶蔽芽的莖段流 水沖洗1-2小時，洗潔精清洗3-5分鐘（添加一滴洗潔精，去除外植體表面張力，有利于除 菌），再依次采用無菌水一道清洗、70%乙醇清洗20-30秒，無菌水二道清洗、升隸滅菌8-10 分鐘，無菌水Ξ道清洗4-5次。
[0012] 步驟(2)中，所述的初代培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基中，薦糖質(zhì)量百分比為2.5-3%;生根 培養(yǎng)基中，薦糖質(zhì)量百分數(shù)為1.5-2% ;環(huán)境條件:光照時間16小時，光照強度2000LUX，溫度 26±2°C。
[001 引步驟(3)中，初代培養(yǎng)基組成為：（1/2-1 )MS+( 1-1.5mg/L)她A+(0-0.5mg/L)NAA。
[0014] 步驟（4)中，所述的繼代培養(yǎng)基的組成為：（1/2-1)15+(1-1.5111旨幾）684+(0- 0.025mg/L)GA+0.025mg/L NAA。
[0015] 步驟(5)中，壯苗培養(yǎng)采用純MS培養(yǎng)基;生根培養(yǎng)基的組成為l/2MS+(0.5-1.5mg/ L)IBA或l/2MS+(0.5-1.5mg/L)NAA。
[0016] 本申請中，草炭±是指炭±有機質(zhì)含量在30% W上，比重0.7-1.05，呈棟色或黑 色，pH值一般為5.5~6.5，呈微酸性反應(yīng)，呈層狀分布。
【附圖說明】
[0017] 圖1-1為第一種配方條件下莖尖較嫩蔽芽誘導(dǎo)長大的無菌苗；
[0018] 圖1-2為第一種配方條件下半木質(zhì)化莖段的蔽芽誘導(dǎo)長大的無菌苗；
[0019] 圖1-3為第二種配方條件下莖尖較嫩蔽芽誘導(dǎo)長大的無菌苗；
[0020] 圖1-4為第二種配方條件下半木質(zhì)化莖段的蔽芽誘導(dǎo)長大的無菌苗；
[0021 ]圖1-5為第Ξ種配方條件下莖尖較嫩蔽芽誘導(dǎo)長大的無菌苗；
[0022] 圖1-6為第Ξ種配方條件下半木質(zhì)化莖段的蔽芽誘導(dǎo)長大的無菌苗；
[0023] 圖2-1為繼代母株；
[0024] 圖2-2為分離得到的繼代子株；
[00巧]圖2-3為繼代增殖苗；
[00%] 圖3-1為生根苗；
[0027]圖3-2為生根培養(yǎng)15天時的生根狀態(tài)；
[00%]圖3-3為生根培養(yǎng)30天時的生根狀態(tài)。