一種毛壩大木漆的組織培養(yǎng)快繁方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中植物組織培養(yǎng)的方法，特別涉及一種毛壩大木漆的組織培養(yǎng)快繁方法。
【背景技術(shù)】
[0002]生漆是從漆樹之韌皮層內(nèi)割流出來的油包水乳白色液體，是漆樹的一種生理分泌物。生漆為我國特產(chǎn)可再生資源，也是歷史悠久的傳統(tǒng)土特產(chǎn)品，產(chǎn)量占世界總量的80%以上。湖北是我國產(chǎn)漆大省，毛壩漆在特定的氣候和海拔條件下形成，上世紀(jì)1954年，周恩來總理授牌“壩漆名冠全球”，毛壩漆為此成為了名揚全國乃至全球的傳統(tǒng)品牌。毛壩生漆以漆質(zhì)濃厚，色澤光亮，氣味芬芳，含水量少，附著力強，燥性好，漆酚率高達(dá)80%以上而蜚聲海內(nèi)外，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷日本、法國、美國、德國、英國、香港等幾十個國家和地區(qū)。而毛壩大木漆為野生漆樹品種在生產(chǎn)中，普遍采用種子育苗和埋根育苗的方式栽培。由于漆樹屬異花授粉的經(jīng)濟樹種，用種子繁殖會產(chǎn)生較大分化，其優(yōu)良品種的遺傳特性難以保持;采用埋根育苗，除極少數(shù)可能產(chǎn)生芽變外，具有穩(wěn)定不易退化的特點，且成苗率低，繁殖速度慢，對漆樹優(yōu)良品種和優(yōu)良單株受到了限制。而組培快繁技術(shù)，能很好保證漆樹優(yōu)良品種和單株遺傳穩(wěn)定性，并能滿足大規(guī)模的繁殖要求，現(xiàn)有技術(shù)中有關(guān)于組培快繁技術(shù)應(yīng)用于漆樹繁殖方面的報道，例如，申請?zhí)枮?01410311305.4的專利公開了一種小木漆高效快速擴繁方法，包括(I)外植體的選擇與消毒(2)啟動培養(yǎng)(3)增殖培養(yǎng)(4)生根培養(yǎng)(5)煉苗與移栽步驟，采用對優(yōu)良小木漆優(yōu)良單株進(jìn)行組織培養(yǎng)的方法，可使其繁殖系數(shù)達(dá)到4?5倍，每10個有效小木漆腋芽，按繁殖系數(shù)為4.5，增殖周期為45天計算，除去污染損耗，其年繁殖量仍將達(dá)到175萬個以上，有效解決了小木漆快速繁殖的問題，使得優(yōu)良無性系材料能夠大面積推廣，但該發(fā)明增殖周期較長，繁殖系數(shù)較低，且培養(yǎng)的小木漆易污染、褐化，損耗率高，不適合毛壩大木漆的組織培養(yǎng)快速繁殖。另外，申請?zhí)枮?01410540495.7的專利申請公開了一種漆樹再生植株的快速繁殖方法，包括漆樹葉片的消毒、愈傷組織的誘導(dǎo)、愈傷組織的分化、生根誘導(dǎo)、煉苗移栽等步驟，但該發(fā)明選用漆樹葉片為外植體來避免褐化現(xiàn)象，會導(dǎo)致誘導(dǎo)分化率不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提供一種毛壩大木漆的組織培養(yǎng)快繁方法，本發(fā)明方法打破了毛壩大木漆樹種野生繁殖的模式，解決了毛壩大木漆存活率、繁殖率低、數(shù)量稀少的技術(shù)問題，實現(xiàn)了毛壩大木漆大面積快速繁殖的需求。
[0004]為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案:
[0005]—種毛壩大木漆的組織培養(yǎng)快繁方法，所述方法包括如下步驟:
[0006](I)外植體的取材:于每年5月上旬采摘5年生優(yōu)良毛壩大木漆的新鮮腋芽和頂芽作為培養(yǎng)材料；
[0007](2)消毒過程:將采摘的枝條去除葉片，用滅菌軟毛刷清刷植株表面，去除污染物，用流水沖洗2h，再用無菌水沖洗3?5遍后，剪切成帶有腋芽或頂芽的小段放置于無菌培養(yǎng)皿中，快速移至超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行消毒，在無菌條件下用75%的乙醇浸泡25s后，放入含有
0.0I?0.0l 5 %的吐溫-80的0.1 %升汞消毒液中，輕輕攪動1min，再用無菌水沖洗5?8次后，將外植體置于消毒濾紙上吸干水分后備用；
[0008](3)誘導(dǎo)培養(yǎng):將腋芽及頂芽接觸消毒液的傷口部分切除3?4_，豎插于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置于溫度為24±2°C條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)I?2天再轉(zhuǎn)入新配制的誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)，反復(fù)3次后放置于光照強度為18001x，光照時間為11?12小時/天的條件下光照培養(yǎng)20?25天，待長出3?4cm新芽即可；
[0009](4)增殖培養(yǎng):將新芽從外植體上切下，其保留高度為2?3cm、2?3個葉片，將其豎插于增殖培養(yǎng)基上，置于溫度為24±2°C，光照強度為18001x，光照時間為10小時/天的條件下培養(yǎng)25?30天，待腋芽基部出現(xiàn)直徑I?2cm愈傷組織且生出5?8個3?4cm的不定芽時，再將不定芽切下，在相同條件下放置到相同配方的增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)接，即可使毛壩大木漆進(jìn)行快速擴繁，其增殖倍數(shù)為6?8倍；
[0010](5)生根培養(yǎng):將2?3cm高的增殖苗豎插于生根培養(yǎng)基上，置于溫度為24±2°C，光照強度為18001x，光照時間為11?12小時/天的條件下培養(yǎng)25?30天，待株高達(dá)到3?4cm，根長I?2cm、大于4條生根數(shù)/株，即得到毛壩大木漆的生根苗，以待移栽；
[0011](6)煉苗與移栽:將生根瓶苗放置于自然光照條件下，室溫24±2°C的溫棚中進(jìn)行閉蓋煉苗，7天后取出生根苗，將根部的培養(yǎng)基清洗干凈，用80%百菌清浸根5min后，移栽至基質(zhì)配比為泥炭土:珍珠巖= 3:2的塑料籃中，淋足定根水，保持小環(huán)境相對濕度80%以上，7天后可逐步降低相對濕度，保持基質(zhì)濕潤，控制遮光率在60 %?70%，溫度26 ± 2°C，15?20天后將成活的小苗移栽到基質(zhì)相同、杯口直徑為1cm的可降解無紡紙育苗袋中，養(yǎng)護(hù)2?3個月，苗高達(dá)30cm左右移至苗圃地培育成苗。
[0012]上述步驟(3)所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為:B5 + 1.0mg/L 6-BA+0.lmg/L NAA+30.0g/L蔗糖+5.0g/L活性炭+7.0g/L瓊脂+0.5g/L青霉素，PH值為5.8?6.0。
[0013]上述步驟(4)所述增殖培養(yǎng)基配方為:MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30.0g/L蔗糖+5.0g/L活性炭+7.0g/L瓊脂，pH為5.8?6.0，其中，所述增殖培養(yǎng)基配方MS中NH4NO3濃度為標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的1/2。
[0014]上述步驟(5)所述生根培養(yǎng)基配方為:l/2MS+0.5mg/L IBA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+5.0g/L活性炭+7.0g/L瓊脂，pH為5.8?6.0。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果:
[0016](I)本發(fā)明通過組培快繁技術(shù)對毛壩大木漆進(jìn)行快速繁殖，能很好地保證漆樹優(yōu)良品種和單株遺傳穩(wěn)定性，并能在短時間內(nèi)滿足大規(guī)模的繁殖需求，打破該樹種野生繁殖的模式達(dá)到人工馴化的目的，實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，滿足市場的需求；
[0017](2)本發(fā)明通過準(zhǔn)確選擇采摘外植體的時間及樹齡，提高了不定芽的誘導(dǎo)分化率，使其分化率達(dá)到85%以上；
[0018](3)本發(fā)明在誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，選擇低順4+、高N03—濃度的B5培養(yǎng)基，并通過培養(yǎng)初期反復(fù)接種，添加適量的活性炭及青霉素并結(jié)合暗培養(yǎng)的方式來大大降低植株的褐化率及污染率，最終使外植體的褐化率低于8%，污染率低于2%，誘導(dǎo)率達(dá)到85%以上，成效顯著；
[0019](4)本發(fā)明在增殖過程中采用養(yǎng)分較高的MS培養(yǎng)基并降低配方中NH4+的含量，即保證增殖培養(yǎng)的養(yǎng)分要求同時也降低了褐化率，選擇細(xì)胞分裂素6-BA與生長素NAA相結(jié)合的配方，使愈傷組織發(fā)育良好，叢生芽的增殖系數(shù)達(dá)到6?8倍；
[0020](5)本發(fā)明在生根培養(yǎng)中，選擇兩種生長素(IBA、NAA)相結(jié)合的方式培養(yǎng)，即促使不定根的誘導(dǎo)分化又加快根的生長，使其生根率達(dá)到99%以上，平均每株帶4?5個根；
[0021](6)本發(fā)明在煉苗與移栽過程中，采用閉蓋煉苗的方式及合理的基質(zhì)配比大大提高了幼苗的成活率，使成活率保持在90 %以上；
[0022](7)本發(fā)明能有效的解決木本植物在組培過程中褐化、污染等問題，具有保證植株的優(yōu)良遺傳性狀，培養(yǎng)過程安全簡單，繁殖系數(shù)極高，且經(jīng)濟實惠易養(yǎng)護(hù)等優(yōu)點。以每10個毛壩大木漆外植體計算，繁殖系數(shù)為6.5，增殖周期為30天計算，除去污染耗損，其年繁殖量達(dá)到275萬個以上，有效解決了毛壩大木漆數(shù)量稀少的問題，實現(xiàn)大面積快速繁殖的需求。
【具體實施方式】
[0023]以下通過實施例形式對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0024]實施例1
[0025]本實施