穩(wěn)定的液體harpin蛋白制劑的制備、制劑及用圖
【專利說明】穩(wěn)定的液體HARP IN蛋白制劑的制備、制劑及用途
[00011 本申請(qǐng)是國際申請(qǐng)日為2009年8月6日的國際申請(qǐng)PCT/US2009/052978進(jìn)入中國、 申請(qǐng)?zhí)?00980131314.2的題為"穩(wěn)定的液體harpin蛋白制劑的制備、制劑及用途"的發(fā)明專 利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002]本申請(qǐng)要求提交于2008年8月12日的序列號(hào)為61/088,195的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)的 優(yōu)先權(quán)，據(jù)此將該申請(qǐng)以全文引用的方式并入。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明涉及穩(wěn)定的液體harpin蛋白制劑的制備、制劑及用途。
【背景技術(shù)】
[0004] 植物已經(jīng)進(jìn)化出能辨別和響應(yīng)包括病原體感染在內(nèi)的環(huán)境信號(hào)的一系列復(fù)雜的 生物化學(xué)通路。在病原體和植物之間有兩種主要的相互作用-相容和不相容。當(dāng)病原體和植 物相容時(shí)，通常就發(fā)生疾病。如果病原體和植物不相容，則植物通常對(duì)該特定的病原體有抵 抗力。在不相容的相互作用中，植物通過引起感染部位周圍一小范圍的局部壞死或組織死 亡而限制病原體的繁殖。植物的這一反應(yīng)被定義為過敏反應(yīng)（"HR"）（Kiraly/Defenses Triggered by the Invader:Hypersensitivity/'Plant Disease:An Advanced Treatise 5：201-224J.G.HorsfalI and E.B. Cowling,eds. Academic Press,New York(1980)； Klement/7Hypersensitivity,uPhytopathogenic Prokaryotes 2:149-177，M.S.Mount and G.H.Lacy，eds.Academic Press，New York(1982))。局部細(xì)胞死亡不僅能遏制感染病 原體的進(jìn)一步擴(kuò)散，還會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)抗性，防止其它病原體的后續(xù)感染。因此，HR是植物對(duì)由 細(xì)菌、真菌、線蟲和病毒引起的疾病的抗性的常見形式。
[0005] 一組命名為hrp(Hypersensitive Response and Pathogenicity)的基因是由包 括歐文氏菌屬、假單胞菌屬、黃單胞菌屬和勞爾氏菌屬在內(nèi)的病原菌誘導(dǎo)HR的原因 (Willis 等〃hrp Genes of Phytopathogenic Bacteria，〃Mol·Plant-Microbe Interact.4：132-138(1991)；Bonas /7hrp Genes of Phytopathogenic Bacteria，〃pp·79_98in: Current Topics in Microbiology and Immunology，Vol·192，Bacterial Pathogenesis of Plants and Animals：Molecular and Cellular Mechanisms·J.L.Dangl，ed·Springer-Verlag，Berlin(1994);Alfano等/'Bacterial Pathogens in Plants：Life Up Against the Wall，〃Plant Cell 8:1683-98(1996))。通常，有多個(gè)hrp基因聚集在30-40kb的DNA片 段中。hrp基因中的任何一個(gè)的突變將導(dǎo)致宿主植物中細(xì)菌病原性的喪失和非宿主植物的 HR0
[0006]基于基因和生物化學(xué)表征，hrp基因的作用可以分為三組：（1)編碼位于細(xì)胞外的 如harpin的HR誘導(dǎo)子的結(jié)構(gòu)基因（Wei等"Harpir^Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovora"Science 257:85 (1992);He等〃Pseudomonas syringae pv.Syringae harpinpss：A Protein that is Secreted Via the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants，〃Cell 73:1255(1993);Arlat等〃PopAl，a Protein which Induces a Hypersensitive-Like Response on Specific Petunia Genotypes，Is Secreted via the Hrp Pathway of Pseudomonas solanacearum，〃EMBO J.13:543-53(1994);Kim等〃 Hrpff of Erwinia amylovora?a New Harpin that Contains a Domain Homologous to Pectate Lyases of a Distinct Class，〃J.Bacteriol.l80:5203_10(1998));(2)編碼用 于將HR誘導(dǎo)子和其它蛋白質(zhì)從細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)輸出至細(xì)胞表面或細(xì)胞外空間的淚液分泌部 的分泌基因 （Van Gi jsegem等，〃Evolutionary Conservation of Pathogenicity Determinants Among Plant and Animal Pathogenic BacteriaZ7Trends Microbiol.I： 175-180(1993);He等/Pseudomonas syringae pv.Syringae harpinpss：A Protein that is Secreted Via the Hrp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants /7Cell 73 :1255( 1993);Wei等，〃HrpI of Erwinia amylovora Functions in Secretion of Harpin and is a Member of a New Protein Family/J.Bacteriol · 175: 7985-67(1993);Arlat等〃PopAl，a Protein which Induces a HyPersensitive-Like Response on Specific Petunia Genotypes ?Is Secreted via the Hrp Pathway ofPseudomonas solanacearum〃EMBO J.13:543-53(1994);Galan等，〃Cross-talk Between Bacterial Pathogens and Their Host Cells/7 Ann. Rev. Ce11 Dev.Biol.12:221-55 (1996);Bogdanove等，〃Erwinia amylovora Secretes Harpin via a Type III Pathway and Contains a Homo log of yopN of Yersinia/7J.Bacteriol.178：1720-30(1996)； Bogdanove等/'Homology and Functional Similarity of a hrp-linked Pathogenicity Operon，dspEF，of Erwinia amylovora and the avrE Locus of Pseudomonas syringae Pathovar Tomato，〃Proc.Natl .Acad.Sci .USA 95:1325-30(1998));和（3)控制hrp基因表 達(dá)的調(diào)芐基因（Wei，〃Harpin，Elicitor of the Hypersensitive Response Produced by the Plant Pathogen Erwinia amylovora"Science 257:85(1992);Wei等，〃hrpL Activates Erwinia amylovora hrp Genes in Response to Environmental Stimuli，" J.Bacteriol·174:1875-82(1995);Xiao等，〃A Single Promoter Sequence Recognized by a Newly Identified Alternate Sigma Factor Directs Expression of Pathogenicity and Host Range Determinants in Pseudomonas syringae" J.Bacteriol.176:3089-91(1994);Kim等，〃The hrpA and hrpC Operons of Erwinia amylovora Encode Components of a Type III Pathway that Secretes Harpin/7 J.Bacteriol.179:1690-97(1997);Kim等/HrpW of Erwinia amylovora，a New Harpin that Contains a Domain Homologous to Pectate Lyases of a Distinct Class，" J.Bacteriol.180:5203-10(1998);Wengelnik等，〃HrpG，A Key hrp Regulatory Protein of Xanthomonas campestris pv.Vesicatoria is Homologous to Two Component Response Regulators / MoI .Plant-Microbe Interact · 9:704-12( 1996)) D 由于在植物和 微生物之間相互作用中所起的作用，hrp基因已經(jīng)成為細(xì)菌病原性和植物防御反應(yīng)研究的 焦點(diǎn)。
[0007]除局部防御反應(yīng)外，HR還激活同一植物中未被感染部分的防御系統(tǒng)。這就產(chǎn)生了 對(duì)繼發(fā)性感染的全面的系統(tǒng)抗性，命名為系統(tǒng)獲得抗性（"SAR"）（Ross，〃 Systemic Acquired Resistance Induced by Localized Virus Infections in PlantsZrVirology 14:340-58(1961);Malamy等，〃Salicylic Acid and Plant Disease Resistance，〃Plant J.2:643-654(1990)) AAR賦予對(duì)廣譜病原體長期的系統(tǒng)疾病抗性，并與某一套基因的表達(dá) 相關(guān)聯(lián)(Ward等，"Coordinate Gene Activity in Response to Agents that Induce Systemic Acquired Resistance/'Plant Cell 3:1085-94(1991))。由于誘導(dǎo)植物保護(hù)自 己的潛力能顯著地減少或擺脫對(duì)化學(xué)殺蟲劑的需求，所以SAR是植物抗病性的重要組成部 分，已經(jīng)長期受到關(guān)注。SAR可以用生物試劑(微生物）或非生物(化學(xué)）試劑誘導(dǎo)(Gorlach et al. /7BenzothiadiazolejA Novel Class of Inducers of Systemic Acquired Resistance,Activates Gene Expression and Disease Resistance In Wheat/'Plant Cell 8:629-43(1996))。歷史上，弱毒性的病原體被用作SAR的生物誘導(dǎo)劑。也有報(bào)道指無 毒的植物生長促進(jìn)細(xì)菌能誘導(dǎo)某些植物對(duì)于各種疾病的抗性。
[0008]生物試劑誘導(dǎo)的SAR已成為很多研究的主題。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，第一個(gè)具有 廣宿主譜的蛋白質(zhì)HR誘導(dǎo)子于1992年從引起蘋果樹和梨樹火疫病的梨火疫病歐文氏菌 (Erwinia amylovora)(-種病原菌）中分離出來。該HR誘導(dǎo)子被命名為"harpin〃，現(xiàn)被稱為 harpinEa或HrpNsac3HarpinEa,由403個(gè)氨基酸組成，分子量約為40kDa。編碼這一蛋白質(zhì)的 基因，hrpN，包含在位于hrp基因簇中間的1.3kb DNA片段中。HarpinEa被分泌入細(xì)胞外的空 間，對(duì)蛋白酶消化很敏感。
[0009]自從梨火疫病歐文氏菌中分理出harpinEa以來，其它一些harpin或類harpin的蛋 白質(zhì)也已經(jīng)從其它主要的植物