一種食用百合的脫毒及快速繁殖方法
【專利摘要】一種食用百合的脫毒及快速繁殖方法，包括以下步驟：(1)外植體的選擇及處理：(2)外植體的滅菌及生長(zhǎng)點(diǎn)的剝?nèi)。?3)啟動(dòng)培養(yǎng)；(4)RT?PCR病毒檢測(cè)及叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)；(5)鱗莖誘導(dǎo)及生根培養(yǎng)。利用本發(fā)明可以100％脫去百合體內(nèi)主要病毒，特別是對(duì)于已經(jīng)感染病毒的百合外植體經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可以成功脫除，且成活率高達(dá)85％以上，此外，通過(guò)本發(fā)明在獲得較高增殖系數(shù)的同時(shí)縮短百合生長(zhǎng)周期，使百合在短時(shí)間內(nèi)獲得大量脫毒苗，滿足生產(chǎn)的需求。
【專利說(shuō)明】
一種食用百合的脫毒及快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種百合的高效脫毒及快速繁殖新技術(shù)，特別針對(duì)卷丹百合具有極高脫毒快繁效率的組培方法。
【背景技術(shù)】
[0002]卷丹百合在湖南、安徽和江西等省(區(qū))都有分布，僅湖南龍山縣常年種植藥食兩用的卷丹百合3400hm2，是該縣農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)之一。由于百合生產(chǎn)上多采用無(wú)性繁殖造成病毒大量累積使植株發(fā)生病毒病，造成產(chǎn)量品質(zhì)大幅下降，制約了百合的發(fā)展。
[0003]危害百合的主要病毒病有百合無(wú)癥病毒(Lilysymptomless virus，LSV)、百合叢族病毒(Lily rosette virus，LRV)、黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)等。百合一旦傳染病毒，終生帶毒，且難以用化學(xué)藥劑或生物制劑進(jìn)行直接有效防治。因此，當(dāng)務(wù)之急是通過(guò)生物技術(shù)手段剔除百合體內(nèi)病毒，獲得脫毒苗，從源頭上掐斷病毒的侵染。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于，提供一種食用百合的脫毒及快速繁殖方法，尤其針對(duì)已經(jīng)感染多種病毒的百合種球，脫去植株體內(nèi)病毒獲得無(wú)菌苗，同時(shí)在短時(shí)間內(nèi)通過(guò)組織培養(yǎng)獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)種苗，從而滿足生產(chǎn)需求。
[0005]本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是:一種食用百合的脫毒及快速繁殖方法，包括以下步驟:
[0006](I)外植體的選擇及處理:選擇百合珠芽作為外植體，用水沖洗去除泥土后，在35-40 °C (優(yōu)選36-38°C)恒溫箱中熱處理10-20天(優(yōu)選15-18天)，保持相對(duì)濕度在85-100%;
[0007](2)外植體的滅菌及生長(zhǎng)點(diǎn)的剝?nèi)?將經(jīng)過(guò)熱處理后的百合珠芽加洗潔精在水中清洗，洗凈表面粘液后，先用酒精浸泡(優(yōu)選浸泡時(shí)間20-30秒)，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1-0.2%的升汞滅菌(優(yōu)選滅菌時(shí)間10-15分鐘)，然后用無(wú)菌水清洗(優(yōu)選4-5次)，洗凈殘液，備用；
[0008]將滅菌后的百合珠芽置于體視顯微鏡下，先用解剖刀切下四周較大的鱗片，再用解剖針挑取0.4-0.8mm(優(yōu)選0.4-0.6mm)大小的莖尖，接種在啟動(dòng)培養(yǎng)基中；
[0009](3)啟動(dòng)培養(yǎng):啟動(dòng)培養(yǎng)基配方為:MS(Murashige和Skoog于1962年設(shè)計(jì)的配方)+5-15mg/L病毒唑(優(yōu)選6-12mg/L)+0.5-3.0mg/L 6_BA(6_芐氨基腺膘呤，優(yōu)選1.5-2.5mg/L)+0.5-2.0mg/L 2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸，優(yōu)選 1.0-2.0mg/L)+0.1-0.5mg/L NAA(萘乙酸，優(yōu)選0.3-0.4mg/L)+0.1-0.5mg//L活性炭(優(yōu)選0.2-0.4mg/L) +5-7g//L瓊脂+20_40g/L白糖(優(yōu)選30-35mg/L)，先暗培養(yǎng)5-10天，再在光下培養(yǎng)，光強(qiáng)500-1500LX(優(yōu)選1000-1200LX);
[0010](4)RT-PCR病毒檢測(cè)(逆轉(zhuǎn)錄PCR)及叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng):在啟動(dòng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)(先暗培養(yǎng)5-10天，再在光下培養(yǎng))50-60天，待幼芽長(zhǎng)出2-3片葉時(shí)，取葉片進(jìn)行RT-PCR病毒檢測(cè)，確定已脫除病毒則可轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)叢生芽，叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:MS+2.0-
4.0mg/L 6-BA(優(yōu)選2.5-3.5mg/L)+0.1-0.5mg/L NAA(優(yōu)選0.2-0.3mg/L)+5_7g/L瓊脂+20-40g/L 白糖，光強(qiáng) 500-3000Lx ；
[0011](5)鱗莖誘導(dǎo)及生根培養(yǎng):在叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)40-60天后，轉(zhuǎn)至鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:MS+1.0-3.0mg/L 6-BA(優(yōu)選2.0-3.0mg/L)+0.Ι-Ο.5mg/L NAA(優(yōu)選0.2-0.4mg/L)+0.2-0.6mg/L活性炭(優(yōu)選0.4-0.5π^/1)+5-78/1瓊脂+20-40g/L白糖(優(yōu)選35-40g/L)，在此培養(yǎng)基中培養(yǎng)50-60天后，鱗莖發(fā)育較多且根系生長(zhǎng)良好，可直接成苗移栽。
[0012]本發(fā)明的優(yōu)異之處在于:利用本發(fā)明可以100%脫去百合體內(nèi)主要病毒，特別是對(duì)于已經(jīng)感染病毒的百合外植體經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可以成功脫除。同時(shí)，比報(bào)導(dǎo)的成活率低于50%的問(wèn)題，本發(fā)明成活率高達(dá)85%以上。此外，通過(guò)本發(fā)明在獲得較高增殖系數(shù)的同時(shí)縮短百合生長(zhǎng)周期，使百合在短時(shí)間內(nèi)獲得大量脫毒苗，滿足生產(chǎn)的需求。
【具體實(shí)施方式】
[0013]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0014]以下各實(shí)施例是以已感染多種病毒的龍山百合上的珠芽為試材。
[0015]實(shí)施例1
[0016]本實(shí)施例包括以下步驟:
[0017](I)外植體的選擇及處理:選擇百合珠芽作為外植體，先用水沖洗去除泥土，再放入廣口容器中，其上蓋上打濕的毛巾，然后在38土 TC恒溫箱中熱處理15天，保持相對(duì)濕度在 100% ；
[0018](2)外植體的滅菌及生長(zhǎng)點(diǎn)的剝?nèi)?將經(jīng)過(guò)熱處理后的百合珠芽加洗潔精在水中清洗，洗凈表面粘液后，先用體積分?jǐn)?shù)為75%酒精浸泡25秒，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%升汞滅菌15分鐘后，用無(wú)菌水清洗4次，洗凈殘液，備用；
[0019]將滅菌后的百合珠芽置于體視顯微鏡下，先用解剖刀切下四周較大的鱗片，再用解剖針挑取0.4-0.6mm大小的莖尖，接種在啟動(dòng)培養(yǎng)基中；
[0020](3)啟動(dòng)培養(yǎng):啟動(dòng)培養(yǎng)基配方為:MS(Murashige和Skoog于1962年設(shè)計(jì)的配方)+10mg/L病毒卩坐+2mg/L 6_BA(6_節(jié)氨基腺膘呤)+lmg/L 2，4_D(2，4-二氯苯氧乙酸)+0.3mg/LNAA(萘乙酸)+0.3mg/L活性炭+6g/L瓊脂+30g/L白糖，先暗培養(yǎng)8天，再在光下培養(yǎng)，光強(qiáng)1200Lx；
[0021](4)RT_PCR病毒檢測(cè)(逆轉(zhuǎn)錄PCR)及叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng):在啟動(dòng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)(先暗培養(yǎng)8天，再在光下培養(yǎng))55天，待幼芽長(zhǎng)出2-3片葉時(shí)，取葉片進(jìn)行RT-PCR病毒檢測(cè)，確定已脫除病毒則可轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)叢生芽，叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:MS+3mg/L 6-BA+
0.2mg/L NAA+6g/L瓊脂+30g/L白糖，光強(qiáng) 1500Lx ；
[0022](5)鱗莖誘導(dǎo)及生根培養(yǎng):在叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)50天后，轉(zhuǎn)至鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:MS+2mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA+0.3mg//L活性炭+6g//L瓊脂+30g/L白糖，在此培養(yǎng)基中培養(yǎng)55天后，鱗莖發(fā)育較多且根系生長(zhǎng)良好，可直接成苗移Mo
[0023]試驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)施例能成功脫除植株體內(nèi)病毒，脫毒率達(dá)100%，成活率在85%以上。
[0024]實(shí)施例2
[0025]本實(shí)施例包括以下步驟:
[0026](I)外植體的選擇及處理:選擇百合珠芽作為外植體，先用水沖洗去除泥土，再放入廣口容器中，其上蓋上打濕的毛巾，然后在36土 TC恒溫箱中熱處理12天，保持相對(duì)濕度在 85±1%;
[0027](2)外植體的滅菌及生長(zhǎng)點(diǎn)的剝?nèi)?將經(jīng)過(guò)熱處理后的百合珠芽加洗潔精在水中清洗，洗凈表面粘液后，先用體積分?jǐn)?shù)為70 %酒精浸泡20秒，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%升汞滅菌12分鐘后，然后用無(wú)菌水清洗4次，洗凈殘液，備用；
[0028]將滅菌后的百合珠芽置于體視顯微鏡下，先用解剖刀切下四周較大的鱗片，再用解剖針挑取0.4-0.6mm大小的莖尖，接種在啟動(dòng)培養(yǎng)基中；
[0029](3)啟動(dòng)培養(yǎng):啟動(dòng)培養(yǎng)基配方為:MS+8mg/L病毒唑+2.5mg/L 6-BA+2.0mg/L 2,4-D+0.2mg/L NAA+0.lmg/1活性炭+5/L瓊脂+30g/L白糖，先暗培養(yǎng)8天，再在光下培養(yǎng)，光強(qiáng)100Lx；
[0030](4)RT_PCR病毒檢測(cè)及叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng):在啟動(dòng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)(先暗培養(yǎng)8天，再在光下培養(yǎng))52天，待幼芽長(zhǎng)出2-3片葉時(shí)，取葉片進(jìn)行RT-PCR病毒檢測(cè)，確定已脫除病毒則可轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)叢生芽，叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:MS+3mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+6g/L瓊脂+30g/L白糖，光強(qiáng)2500Lx;
[0031](5)鱗莖誘導(dǎo)及生根培養(yǎng):在叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)50天后，轉(zhuǎn)至鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:MS+2mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.4mg//L活性炭+6g//L瓊脂+30g/L白糖，在此培養(yǎng)基中培養(yǎng)55天后，鱗莖發(fā)育較多且根系生長(zhǎng)良好，可直接成苗移Mo
[0032]試驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)施例能成功脫除植株體內(nèi)病毒，脫毒率達(dá)100%，成活率在86%以上。
[0033]實(shí)施例3
[0034]本實(shí)施例包括以下步驟:
[0035](I)外植體的選擇及處理:選擇百合珠芽作為外植體，先用水沖洗去除泥土，再放入廣口容器中，其上蓋上打濕的毛巾，然后在37土 TC恒溫箱中熱處理18天，保持相對(duì)濕度在90±1% ;
[0036](2)外植體的滅菌及生長(zhǎng)點(diǎn)的剝?nèi)?將經(jīng)過(guò)熱處理后的百合珠芽加洗潔精在水中清洗，洗凈表面粘液后，先用體積分?jǐn)?shù)為75 %酒精浸泡30秒，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%升汞滅菌12分鐘后，然后用無(wú)菌水清洗4次，洗凈殘液，備用；
[0037]將滅菌后的百合珠芽置于體視顯微鏡下，先用解剖刀切下四周較大的鱗片，再用解剖針挑取0.4-0.6mm大小的莖尖，接種在啟動(dòng)培養(yǎng)基中；
[0038](3)啟動(dòng)培養(yǎng):啟動(dòng)培養(yǎng)基配方為:MS+12mg/L病毒唑+3mg/L 6-BA+2mg/L 2,4-D+0.4mg/L NAA+0.3mg/L活性炭+6/L瓊脂+30g/L白糖，先暗培養(yǎng)8天，再在光下培養(yǎng)，光強(qiáng)I10Lx；
[0039](4)RT_PCR病毒檢測(cè)及叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng):在啟動(dòng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)(先暗培養(yǎng)8天，再在光下培養(yǎng))52天，待幼芽長(zhǎng)出2-3片葉時(shí)，取葉片進(jìn)行RT-PCR病毒檢測(cè)，確定已脫除病毒則可轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)叢生芽，叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:MS+3.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+7g/L 瓊脂+35g/L 白糖，光強(qiáng) 2000Lx;
[0040](5)鱗莖誘導(dǎo)及生根培養(yǎng):在叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)60天后，轉(zhuǎn)至鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:MS+3mg/L 6-BA+0.5mg/L ΝΑΑ+0.5mg//L活性炭+6g//L瓊脂+40g/L白糖，在此培養(yǎng)基中培養(yǎng)60天后，鱗莖發(fā)育較多且根系生長(zhǎng)良好，可直接成苗移Mo
[0041]試驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)施例能成功脫除植株體內(nèi)病毒，脫毒率達(dá)100%，成活率在88%以上。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種食用百合的脫毒及快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)外植體的選擇及處理:選擇百合珠芽作為外植體，用水沖洗去除泥土后，在35-40V恒溫箱中熱處理10-20天，保持相對(duì)濕度在85-100%; (2)外植體的滅菌及生長(zhǎng)點(diǎn)的剝?nèi)?將經(jīng)過(guò)熱處理后的百合珠芽加洗潔精在水中清洗，洗凈表面粘液后，先用酒精浸泡，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1-0.2%的升汞滅菌，然后用無(wú)菌水清洗，洗凈殘液，備用； 將滅菌后的百合珠芽置于體視顯微鏡下，先用解剖刀切下四周較大的鱗片，再用解剖針挑取0.4-0.8mm大小的莖尖，接種在啟動(dòng)培養(yǎng)基中； (3)啟動(dòng)培養(yǎng):啟動(dòng)培養(yǎng)基配方為:MS+5-15mg/L病毒唑+0.5-3.0mg/L 6-BA+0.5-2.0mg/L2，4-D+0.1-0.5mg/L ΝΑΑ+0.1-0.5mg/L活性炭+5_7g/L瓊脂+20_40g/L白糖，先暗培養(yǎng)5-10天，再在光下培養(yǎng)，光強(qiáng)500-1500Lx ； (4)RT-PCR病毒檢測(cè)及叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng):在啟動(dòng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)50-60天，待幼芽長(zhǎng)出2-3片葉時(shí)，取葉片進(jìn)行RT-PCR病毒檢測(cè)，確定已脫除病毒則可轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)叢生芽，叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:MS+2.0-4.0mg/L 6-BA+0.1-0.5mg/L NAA+5_7g/L瓊脂+20_40g/L白糖，光強(qiáng) 500-3000Lx; (5)鱗莖誘導(dǎo)及生根培養(yǎng):在叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)40-60天后，轉(zhuǎn)至鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:MS+1.0-3.0mg/L 6-BA+0.1-0.5mg/L ΝΑΑ+0.2-0.6mg/L活性炭+5_7g/L瓊脂+20-40g/L白糖，在此培養(yǎng)基中培養(yǎng)50-60天后，鱗莖發(fā)育較多且根系生長(zhǎng)良好，可直接成苗移栽。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的食用百合的脫毒及快速繁殖方法，其特征在于，步驟(I)中，將珠芽放在36-38 0C恒溫箱中熱處理15-18天，保持相對(duì)濕度在100%。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的食用百合的脫毒及快速繁殖方法，其特征在于，步驟(2)中，剝?nèi)〉陌俸锨o尖大小為0.4-0.6_。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的食用百合的脫毒及快速繁殖方法，其特征在于，優(yōu)化了脫毒百合培養(yǎng)基成分，縮短了組培苗生長(zhǎng)周期，提高了生產(chǎn)效率； 啟動(dòng)培養(yǎng)基配方為:MS+6-12mg/L病毒唑+1.5-2.5mg/L 6-BA+1.0-2.0mg/L2，4-D+0.3-0.4mg/L NAA+0.2-0.4mg/L活性炭+5_7g/L瓊脂+30_35g/L白糖； 叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:MS+2.5-3.5mg/L 6-BA+0.2-0.3mg/L NAA+5_7g/L瓊脂+20-40g/L白糖; 鱗莖誘導(dǎo)及生根培養(yǎng)基配方為:MS+2.0-3.0mg/L 6-BA+0.2-0.4mg/L NAA+0.4-0.5mg/L活性炭+5-7g/L瓊脂+35-40g/L白糖，在此培養(yǎng)基中既可分化鱗莖同時(shí)根系生長(zhǎng)良好，可以減少一次繼代生根培養(yǎng)的時(shí)間，提早成苗。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的食用百合的脫毒及快速繁殖方法，其特征在于，步驟(3)中，將剝?nèi)〉那o尖接種在啟動(dòng)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為:先暗培養(yǎng)5-10天，再在光下培養(yǎng)，光強(qiáng)1000-1200LX。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK105830930SQ201610341190
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年5月20日
【發(fā)明人】周曉波, 向清平, 吳藝飛, 向永號(hào), 丁茁荑, 張治國(guó), 袁祖華, 李世樹(shù), 戴雄澤, 周仕兵, 劉峰
【申請(qǐng)人】湖南省蔬菜研究所, 龍山縣科學(xué)技術(shù)情報(bào)交流站