大鯢雄性四倍體純系高效育成方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大鯢雄性四倍體純系高效育成方法，包括如下步驟：他莫昔芬喂養(yǎng)料的配備、對大鯢母本進行投喂他莫昔芬喂養(yǎng)料、冷休克+靜水壓處理、雌激素抑制劑溶液的配制、取受精卵放入雌激素抑制劑溶液中常溫浸泡、取魚苗投喂氯米芬幼體料等，通過此方法，可獲得100%的大鯢雄性四倍體純系，有效提高了四倍體的育成率及出苗率，相比雜交而言，能獲得純度更高、后代更為穩(wěn)定的雄性四倍體魚系，為不育三倍體大鯢的育成奠定了堅實的基礎(chǔ)。
【專利說明】
大鯢雄性四倍體純系高效育成方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及鱖魚的多倍體繁育方法，具體涉及大鯢雄性四倍體純系高效育成方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大銳，又稱大銳，是世界上現(xiàn)存最大也是最珍貴的兩棲動物，是農(nóng)業(yè)廣業(yè)化和特色 農(nóng)業(yè)重點開發(fā)及野生動物基因保護品種。三倍體大鯢的不育特征，使其在生長速度、抗逆 性、抗病性以及肉質(zhì)等方面表現(xiàn)出更為顯著的優(yōu)勢。現(xiàn)有技術(shù)中，要獲得三倍體不育大鯢， 最快捷有效的方法是通過四倍體與二倍體倍間雜交獲得，那么就需要建立遺傳穩(wěn)定、純度 極高的四倍體魚系。目前為止尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于大鯢雄性四倍體高效育成的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種方法穩(wěn)定、種群純度高 達100%的大鯢雄性四倍體純系高效育成方法。
[0004] 為達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 大鯢雄性四倍體純系高效育成方法，包括如下步驟： (1) 他莫昔芬喂養(yǎng)料的配備:取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入到大鯢常規(guī)飼養(yǎng) 飼料中，制成喂養(yǎng)料，其中他莫昔芬含量為25~30g/kg喂養(yǎng)料，待用； (2) 投喂:在大鯢母本產(chǎn)卵前5~10天，按常規(guī)飼料投喂方法對大鯢母本進行投喂他莫 昔分喂養(yǎng)料，每天兩次，早上8:00每100g大銳母本投喂20~25g，下午6:00每100g大銳母本 投喂10~15g;至其卵發(fā)育成熟，然后，取雄大鯢放在一起，使其自然產(chǎn)卵交配受精，得受精 卵，備用； (3) 冷休克+靜水壓處理:在一次卵裂時，采用冷休克與靜水壓相結(jié)合的方法，把步驟 (2)中的受精卵放入溫度為-1~1.0°C的冷水中，靜水壓壓力為180~300Kg/cm 2,持續(xù)時間 為3~5min; (4) 雌激素抑制劑溶液的配制:將氯米芬和睪酮一起溶于80%~90%的乙醇中，再加蒸餾 水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為100~160mg/l，睪 酮的濃度為40~100mg/l; (5) 取步驟(3)處理后的受精卵放入按步驟(4)所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸 泡10~30s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至出苗； (6) 取步驟(5)中的魚苗，投喂氯米芬幼體料;配比量為每kg幼體料加10~15g氯米芬， 每次投喂量為每萬尾30~50g幼體料，每天投喂三次，直至變?yōu)闉踝忻?；從而獲得100%雄性 大鯢四倍體純系。
[0005] 本發(fā)明的優(yōu)點：1、本發(fā)明中在母本中投喂他莫昔芬，起到抑制DNA復(fù)制和促雄性的 雙重作用的同時，推延了受精卵第一次卵裂的時間（3-5min)、提高了所有受精卵第一次卵 裂的同步程度(可達99%)，為操作下一步提供時間保障和奠定了染色體加倍的基礎(chǔ);2、在受 精卵一次卵裂采用冷休克與較低的靜水壓(低于常用的350kg/cm2)，以及較短的處理時間 (低于5min)，不僅有效減少對受精卵的不良影響，提高受精卵的成活率，而且進一步強化四 倍體的轉(zhuǎn)化率;3、雌激素抑制劑溶液浸泡，再一次強化與保證雄性轉(zhuǎn)化率;4、最后投喂氯米 芬，保證大鯢的雄性轉(zhuǎn)化率。因而通過此方法，可獲得100%的大鯢雄性四倍體純系，有效提 高了四倍體的育成率及出苗率，相比雜交而言，能獲得純度更高、后代更為穩(wěn)定的雄性四倍 體魚系，為不育三倍體大鯢的育成奠定了堅實的基礎(chǔ)。
【具體實施方式】
[0006] 現(xiàn)結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步描述。
[0007] 實施例一 大鯢雄性四倍體純系高效育成方法，包括如下步驟： (1) 他莫昔芬喂養(yǎng)料的配備:取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入到大鯢人工飼養(yǎng) 伺料中，制成喂養(yǎng)料，其中他旲昔芬含量為30g/kg喂養(yǎng)料，待用； (2) 投喂:在大鯢母本產(chǎn)卵前5天，按常規(guī)飼料投喂方法對大鯢母本進行投喂他莫昔芬 喂養(yǎng)料，每天兩次，早上8:00每100g大銳母本投喂25g，下午6:00每100g大銳母本投喂15g; 至其卵發(fā)育成熟，然后，取雄大鯢放在一起，使其自然產(chǎn)卵交配受精，得受精卵，備用； (3) 冷休克+靜水壓處理:在一次卵裂時，采用冷休克與靜水壓相結(jié)合的方法，把步驟 (2)中的受精卵放入溫度為0°C的冷水中，靜水壓壓力為260Kg/cm2,持續(xù)時間為3min; (4) 雌激素抑制劑溶液的配制:將氯米芬和睪酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸餾水配 制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為l〇〇mg/l，睪酮的濃度為 40mg/l； (5) 取步驟(3)處理后的受精卵放入按步驟(4)所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸 泡30s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至出苗； (6) 取步驟(5)中的魚苗，投喂氯米芬幼體料;配比量為每kg幼體料加15g氯米芬，每次 投喂量為每萬尾30g幼體料，每天投喂三次，直至變?yōu)闉踝忻?從而獲得100%雄性大鯢四倍 體純系。
[0008] 實施例二 大鯢雄性四倍體純系高效育成方法，包括如下步驟： (1) 他莫昔芬喂養(yǎng)料的配備:取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入到大鯢人工飼養(yǎng) 伺料中，制成喂養(yǎng)料，其中他旲昔芬含量為25g/kg喂養(yǎng)料，待用； (2) 投喂:在大鯢母本產(chǎn)卵前10天，按常規(guī)飼料投喂方法對大鯢母本進行投喂他莫昔芬 喂養(yǎng)料，每天兩次，早上8:00每100g大銳母本投喂25g，下午6:00每100g大銳母本投喂15g; 至其卵發(fā)育成熟，然后，取雄大鯢放在一起，使其自然產(chǎn)卵交配受精，得受精卵，備用； (3) 冷休克+靜水壓處理:在一次卵裂時，采用冷休克與靜水壓相結(jié)合的方法，把步驟 (2)中的受精卵放入溫度為-1°C的冷水中，靜水壓壓力為300Kg/cm2，持續(xù)時間為3min; (4) 雌激素抑制劑溶液的配制:將氯米芬和睪酮一起溶于80%~90%的乙醇中，再加蒸餾 水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為140mg/l，睪酮的濃 度為80mg/l; (5) 取步驟(3)處理后的受精卵放入按步驟(4)所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸 泡10s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至出苗； (6)取步驟(5)中的魚苗，投喂氯米芬幼體料;配比量為每kg幼體料加10g氯米芬，每次 投喂量為每萬尾50g，每天投喂三次，直至變?yōu)闉踝忻?從而獲得100%雄性大鯢四倍體純系。
[0009] 上述兩個實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選方案之二，并不能限制本發(fā)明的保護范圍，任 意與本發(fā)明等同或相似的技術(shù)手段視為本發(fā)明的保護范圍。以下附上本發(fā)明部分處理方式 及結(jié)果統(tǒng)計。
[0010] 附:大鯢雄性四倍體育成結(jié)果統(tǒng)計
注：上述結(jié)果是在母本產(chǎn)卵前10大投喂他昊昔芬，靜水壓處理3分鉀、常溫浸泡10s、每 萬尾每次投喂氯米芬〇.5g所取得的結(jié)果。
【主權(quán)項】
1.大鯢雄性四倍體純系高效育成方法，包括如下步驟： (1) 他莫昔芬喂養(yǎng)料的配備：取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入到大鯢常規(guī)飼養(yǎng) 飼料中，制成喂養(yǎng)料，其中他莫昔芬含量為25~30g/kg喂養(yǎng)料，待用； (2) 投喂：在大鯢母本產(chǎn)卵前5~10天，按常規(guī)飼料投喂方法對大鯢母本進行投喂他莫 昔分喂養(yǎng)料，每天兩次，早上8:00每100g大銳母本投喂20~25g，下午6:00每100g大銳母本 投喂10~15g;至其卵發(fā)育成熟，然后，取雄大鯢放在一起，使其自然產(chǎn)卵交配受精，得受精 卵，備用； (3) 冷休克+靜水壓處理：在一次卵裂時，采用冷休克與靜水壓相結(jié)合的方法，把步驟 (2)中的受精卵放入溫度為-1~1.0°C的冷水中，靜水壓壓力為180~300Kg/cm 2,持續(xù)時間 為3~5min; (4) 雌激素抑制劑溶液的配制:將氯米芬和睪酮一起溶于80%~90%的乙醇中，再加蒸餾 水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為100~160mg/l，睪 酮的濃度為40~100mg/l; (5) 取步驟(3)處理后的受精卵放入按步驟(4)所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸 泡10~30s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至出苗； (6) 取步驟(5)中的魚苗，投喂氯米芬幼體料;配比量為每kg幼體料加10~15g氯米芬， 每次投喂量為每萬尾30~50g幼體料，每天投喂三次，直至變?yōu)闉踝忻?；從而獲得100%雄性 大鯢四倍體純系。
【文檔編號】A01K61/00GK105994079SQ201610497480
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月30日
【發(fā)明人】楊品紅, 謝中國, 劉良國
【申請人】湖南文理學(xué)院