具有抑藻活性的褐藻多酚組合物及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供具有抑藻活性的褐藻多酚組合物及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)有機(jī)溶劑輔助低溫超聲的方法提取了泡葉藻，得到的褐藻多酚組合物對(duì)“水華”微藻的生長(zhǎng)具顯著的抑制作用，抑制作用表現(xiàn)為對(duì)細(xì)胞分裂和葉綠素a合成的抑制，對(duì)微藻生長(zhǎng)的抑制是多個(gè)方面的綜合體現(xiàn)。本發(fā)明還提供了一種綜合利用泡葉藻的方法，可以極大的提高他們的產(chǎn)值，減少能源消耗。
【專利說(shuō)明】
具有抑藻活性的褐藻多酚組合物及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及環(huán)境工程領(lǐng)域，特別涉及一種褐藻多酚組合物及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 褐藻屬較高等的多細(xì)胞藻類，屬真核細(xì)胞生物。全世界大約有1，500~2，000種褐 藻，主要分布于大陸附近的水域，則淡水種罕見。褐藻的外表從暗褐色的橄欖綠都有，其取 決于巖藻黃素與葉綠素的比例。常見的褐藻包括泡葉藻屬（Ascophyllum)、馬尾藻屬 (Sargassum)和海帶屬(Laminaria)。近年來(lái)，人們已經(jīng)證實(shí)了褐藻中的一些成分具有抗細(xì) 菌、抗真菌、抗病毒、抗氧化、抗炎、抗腫瘤和促進(jìn)生長(zhǎng)等活性，因此根據(jù)這些生物特性，褐藻 逐漸開發(fā)為肥料、飼料、藥品、化妝品和食品的原料。
[0003] 泡葉藻(Ascophyllumnodosum)是一種常見的，已大規(guī)模養(yǎng)殖的褐藻。原產(chǎn)于北大 西洋水域，別名為巖藻、挪威海帶、多節(jié)海帶等。研究表明泡葉藻是含褐藻多酚最多的褐藻 之一，其含量大概為干重的6.5%。
[0004] "水華"（Algae Bloom)，指的是水體富營(yíng)養(yǎng)化后導(dǎo)致淡水水體中藻類，如藍(lán)藻、綠 藻、硅藻等，大量繁殖的自然生態(tài)現(xiàn)象。"水華"不僅影響了生態(tài)環(huán)境、經(jīng)濟(jì)發(fā)展，微藻所分泌 的毒素還嚴(yán)重影響了飲水質(zhì)量和人類的健康。通常人們會(huì)采用物理、化學(xué)和生物的方法進(jìn) 行治理。早期的研究發(fā)現(xiàn)大型海藻可能分泌了一些抑制海洋微藻生長(zhǎng)的物質(zhì)，因此在海藻 生長(zhǎng)區(qū)域的附近沒有發(fā)現(xiàn)微藻。近年來(lái)的研究證實(shí)，綠藻和紅藻中的萜類、多不飽和脂肪 酸、溴代過(guò)氧化物酶可以影響赤潮微藻的生長(zhǎng)。
[0005] 雖然已有報(bào)道將褐藻提取物應(yīng)用于治理富營(yíng)養(yǎng)水體，但是其主要的活性物質(zhì)并沒 有詳細(xì)的研究，對(duì)微藻生長(zhǎng)的抑制作用也沒有深入的探討，而且針對(duì)用于抑制"水華"微藻 的褐藻提取物，其提取方法也有待優(yōu)化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種褐藻多酚組合物的制備方法， 包括：
[0007] 1)褐藻用溶劑進(jìn)行超聲提??；
[0008] 2)步驟1)得到的提取物分離上清液，濃縮。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明，所述褐藻包括但不限于泡葉藻，例如可以是泡葉藻或其與其它海藻， 優(yōu)選與其它褐藻的混合物。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明，所述褐藻在提取前可經(jīng)過(guò)預(yù)處理。所述預(yù)處理包括浸泡和/或粉碎。 優(yōu)選地，所述泡葉藻為泡葉藻粉。
[0011 ]根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中：
[0012] 步驟1)中，超聲提取可以采用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行；
[0013] 優(yōu)選地，所述超聲提取同時(shí)進(jìn)行攪拌，例如磁力攪拌。例如，所述攪拌的轉(zhuǎn)速為 50rpm以上，例如lOOrprn~500rpm，200rpm~400rpm。所述磁力攬摔轉(zhuǎn)速可以為600~1， 400rpm，優(yōu)選800~1，200rpm，更優(yōu)選1，000~1，lOOrpm。
[0014] 其中，優(yōu)選地，褐藻原料與溶劑的比例可以是1~50g/100mL溶劑，例如3~20g/ 1 OOmL溶劑、6 ~18g/1 OOmL溶劑，優(yōu)選9 ~15g/1 OOmL溶劑，更優(yōu)選 12 ~14g/1 OOmL，如 12 · 81 g/ 100mL溶劑。
[0015] 超聲提取的時(shí)間可以為5min以上，例如10~300min，優(yōu)選20~150min，如30min、 45min、60min、90min、120min〇
[0016] 超聲功率95~855w，優(yōu)選190~665w，更優(yōu)選285~475w。
[0017] 提取溫度可以在55°C以下，例如室溫、30°C、40°C或50°C，更優(yōu)選40°C。
[0018] 所使用的溶劑可以選自水、醇類溶劑、酯類溶劑、酮類中的一種或多種，優(yōu)選甲醇、 乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、異丁醇、乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸甲酯、丙酮中的一種 或多種，更優(yōu)選水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯和/或丙酮中的一種或多種。當(dāng)選擇兩種溶劑組成 的混合物作為溶劑時(shí)，其混合體積比可以是10:1~1:10，例如9:1~2:1、3:7~7:3或4:6~ 6:4。作為實(shí)例，所述溶劑可以選自40~90體積％，如50~75體積％或65~75體積％的丙酮 水溶液，具體可以為70體積％的丙酮水溶液。
[0019] 步驟2)中，可以將步驟1)得到的提取物離心或過(guò)濾，分離上清液。
[0020] 對(duì)于離心的具體條件沒有特別限制，例如：溫度可以為60°C以下，優(yōu)選50°C以下， 如30°C 以下，如 10°C 以下、如4°C，轉(zhuǎn)速可以為 12,000rpm、10,000rpm、8,000rpm、5,000rpm， 離心時(shí)間為1 ~60min，例如3min、8min、10min 或 15min。
[0021] 作為實(shí)例，提取后于4°C，10,000rpm下離心10min。
[0022] 優(yōu)選地，在上清液濃縮后還將其干燥。
[0023] 優(yōu)選地，上清液濃縮采用減壓蒸餾，干燥采用凍干機(jī)凍干。
[0024] 本發(fā)明還提供一種褐藻多酚組合物。所述褐藻多酚組合物中褐藻多酚的質(zhì)量百分 比可以在15%以上，優(yōu)選20%以上，例如24%以上。
[0025] 優(yōu)選地，所述褐藻多酚組合物為上述制備方法得到的產(chǎn)物。
[0026] 本發(fā)明還提供了所述褐藻多酚組合物用于抑制"水華"微藻生長(zhǎng)的應(yīng)用，優(yōu)選用于 抑制"水華"微藻的細(xì)胞分裂和/或葉綠素 a合成。其中，優(yōu)選地，當(dāng)褐藻多酚組合物用于抑制 "水華"微藻生長(zhǎng)時(shí)，所述褐藻多酚組合物在微藻生長(zhǎng)介質(zhì)(如培養(yǎng)液或微藻生長(zhǎng)水體）中的 濃度可以>2體積％，例如2.5體積％以上，如3體積％或4體積％。
[0027] 所述的微藻包括但不限于小球藻（Chlorella vulgaris)和/或斜柵藻（和 Scenedesmus sp.)。該組合物對(duì)"水華"微藻生長(zhǎng)的抑制通過(guò)多方面綜合起效，具體表現(xiàn)為 對(duì)細(xì)胞分裂和葉綠素 a合成的抑制。
[0028] 本發(fā)明還提供一種綜合利用褐藻的方法，包括：
[0029] 1)使用上述方法提取褐藻后，提取剩余的殘?jiān)M(jìn)行再提取，得到褐藻多糖；
[0030] 2)步驟1)得到的褐藻多糖中，將褐藻淀粉和甘露醇作為酵母發(fā)酵的底物，生產(chǎn)生 物能源;和/或?qū)⒑衷迥z進(jìn)行降解，分成不同聚合度的寡糖。
[0031] 有益效果
[0032] 本發(fā)明的褐藻多酚組合物對(duì)"水華"微藻的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用。本發(fā)明褐藻 多酚組合物的提取方法還取得了良好的提取效率。并且，本發(fā)明還實(shí)現(xiàn)了對(duì)褐藻的綜合利 用，可以極大的提高他們的產(chǎn)值，減少能源消耗，物盡其用。
【附圖說(shuō)明】
[0033] 圖1示出3%褐藻提取物對(duì)兩種微藻作用7天后的生長(zhǎng)抑制效果(包括細(xì)胞密度和 葉綠素 a合成指標(biāo)）。 實(shí)施例
[0034] 以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明所述的褐藻多酚組合物的制備方法和應(yīng)用作進(jìn)一步的 解釋與說(shuō)明，但以下實(shí)施例不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。
[0035] 除非另有說(shuō)明，所述儀器和試劑均可商購(gòu)獲得。
[0036] 實(shí)施例1.泡葉藻提取褐藻多酚組合物的制備
[0037] 泡葉藻（Ascophyllum nodosum)干粉（100 目）購(gòu)買自加拿大Stawest Botanicals 公司。
[0038] 藻粉用100mL溶劑進(jìn)行超聲提取，采用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝)進(jìn)行，同時(shí)輔助 磁力攪拌，轉(zhuǎn)速約l，〇〇〇rpm，溫度控制在30 °C以下，70 %丙酮為溶劑提取。提取后10， 000rpm、4°C離心10分鐘，取上清液減壓蒸餾后于凍干機(jī)凍干，最后將提取物重懸于20mL去 離子水，待使用。
[0039] 表1泡葉藻提取條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0040]
[0041 ] *功率為細(xì)胞粉碎機(jī)的總功率(950w)的百分比
[0042]另外，還使用50%、75 %丙酮水溶液作為提取溶劑，實(shí)驗(yàn)a~e相似的提取條件，得 到的提取率相近。
[0043] 實(shí)施例2.泡葉藻提取褐藻多酚組合物對(duì)"水華"微藻生長(zhǎng)的抑制作用
[0044] 2.1泡葉藻提取物影響微藻生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)
[0045] 兩種微藻Chlorella vulgaris和Scenedesmus sp.分別在裝有30mL無(wú)菌培養(yǎng)液的 三角瓶中培養(yǎng)，除了對(duì)照，其他各加入lmL實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)d的泡葉藻提取物。置于光照培養(yǎng)箱 培養(yǎng)7天后，取樣用Countstar自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Inno-Alliance Biotech,Inc.，USA)測(cè)細(xì)胞 密度，用于計(jì)算抑制率。計(jì)算公式如下：
[0046]
[0047 ]兩種微藻分別在10 OmL培養(yǎng)液中培養(yǎng)，提取物的加入量為使得其在該培養(yǎng)液中的 濃度為3% (體積比）。培養(yǎng)條件與上述一致。同樣采用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀培養(yǎng)7天后檢測(cè)微藻細(xì)胞 密度，并計(jì)算抑制率(圖1)。
[0048] 半最大效應(yīng)濃度(EC5Q)指的是泡葉藻提取物引起微藻細(xì)胞數(shù)減少50 %最大效應(yīng)的 濃度。本發(fā)明根據(jù)不同濃度泡葉藻對(duì)微藻生長(zhǎng)的抑制率，采用Min i tab軟件的Prob i t回歸分 析方法，計(jì)算EC50。
[0049] 表2泡葉藻提取物對(duì)兩種微藻的半最大效應(yīng)濃度(EC50)
[0050]
[0051] 結(jié)果表明，所述泡葉藻提取物對(duì)兩種微藻均有良好的抑制作用。
[0052] 2.2微藻葉綠素 a含量的檢測(cè)
[0053]微藻葉綠素 a含量是采用超聲輔助熱乙醇法對(duì)兩種微藻的葉綠素 a進(jìn)行提取。先采 用0.45μπι微孔濾膜抽濾10mL水樣，然后迅速加入10mL預(yù)熱的90 %乙醇80°C水浴提取2分鐘， 超聲破碎3分鐘后，避光靜置4小時(shí)，用微孔濾膜過(guò)濾后，分別在665nm和750nm處測(cè)吸光值 A665和A75Q。加入200yL lmol/L的鹽酸后，再測(cè)一遍吸光值B665和為提取液體積(mL)，V 為樣品體積(L)，計(jì)算公式如下：
[0054]
[0055]
[0056] 葉綠素 a含量常作為指標(biāo)，用于衡量植物的光合作用強(qiáng)度。如圖1所示，泡葉藻提取 物極大地減少了斜柵藻和小球藻細(xì)胞內(nèi)葉綠素 a的合成。
[0057] 2.3泡葉藻提取物抑藻活性成分分析
[0058]當(dāng)泡葉藻提取物重新用100%丙酮進(jìn)行溶解，可以得到可溶和不可溶兩個(gè)組分。使 用100%丙酮多次溶解，以確保這兩個(gè)組分能完全分開。然后離心、凍干，最后分別溶解于 20mL去離子水。
[0059] Chlorella vulgaris和Scenedesmus sp.這兩種藻分別在30mL BG11 培養(yǎng)液中培 養(yǎng)，其中分別加入了 lmL粗提取物、提取物丙酮可溶和丙酮不可溶部分。7天后，通過(guò)微藻細(xì) 胞數(shù)計(jì)算微藻生長(zhǎng)抑制率。
[0000] 褐藻多酸含量測(cè)定是通過(guò)福林酸法(Folin-Ciocalteu method)測(cè)定提取物不同 組分中總多酚含量。提取物樣品、福林酚試劑和碳酸鈉混合后，在室溫靜置lh。用分光光度 計(jì)測(cè)量溶液在765nm的吸光度。測(cè)量結(jié)果通過(guò)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算，總多酚含量為g 沒食子酸當(dāng)量/g干重(提取物）。
[0061]當(dāng)泡葉藻粗提物重新用100%丙酮溶解時(shí)，可得到丙酮溶解組分和丙酮不溶組分， 他們的干重分別占粗提物的38.48%和61.52%，而褐藻多酚含量分別占粗提物的73.86% 和22.15%。分別將這兩個(gè)組分按之前比例添加到培養(yǎng)液中，7天后得知丙酮可溶組分對(duì)兩 種微藻生長(zhǎng)的抑制作用與泡葉藻粗提物一致。
[0062]表3褐藻多酚(PC)的含量（％ )
[0063]
[0064] 另外，采用實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)a、b、(^Pe的提取物重復(fù)進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，結(jié)果相似。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種褐藻多酚組合物的制備方法，包括： 1) 褐藻用溶劑進(jìn)行超聲提取； 2) 步驟1)得到的提取物分離上清液，濃縮； 其中，所述褐藻包括但不限于泡葉藻，例如可以是泡葉藻或其與其它海藻，優(yōu)選與其它 褐藻的混合物； 所述褐藻在提取前可經(jīng)過(guò)預(yù)處理。所述預(yù)處理包括浸泡和/或粉碎；優(yōu)選地，所述泡葉 藻為泡葉藻粉。2. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其中： 步驟1)中，超聲提取可以采用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行； 優(yōu)選地，所述超聲提取同時(shí)進(jìn)行攪拌，例如磁力攪拌； 優(yōu)選地，褐藻原料與溶劑的比例可以是1~50g/100mL溶劑，例如3~20g/100mL溶劑、6 ~18g/100mL溶劑，優(yōu)選9~15g/100mL溶劑，更優(yōu)選12~14g/100mL，如12.81g/100mL溶劑； 超聲提取的時(shí)間可以為5min以上，例如10~300min，優(yōu)選20~150min; 超聲功率95~855w，優(yōu)選190~665w，更優(yōu)選285~475w; 提取溫度可以在55 °C以下，例如室溫、30 °C、40 °C或50 °C，更優(yōu)選40 °C。3. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其中： 步驟1)中，所使用的溶劑可以選自水、醇類溶劑、酯類溶劑、酮類中的一種或多種，優(yōu)選 甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、異丁醇、乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸甲酯、丙酮中 的一種或多種，更優(yōu)選水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯和/或丙酮中的一種或多種。4. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其中： 當(dāng)選擇兩種溶劑組成的混合物作為溶劑時(shí)，其混合體積比可以是10:1~1:10,例如9:1 ~2:1、3:7~7:3或4:6~6:4;例如，所述溶劑可以選自40~90體積％，如50~75體積％或65 ~75體積％的丙酮水溶液，具體可以為70體積％的丙酮水溶液。5. 如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的制備方法，其中： 步驟2)中，將步驟1)得到的提取物離心或過(guò)濾，分離上清液； 對(duì)于離心的具體條件沒有特別限制，例如:溫度可以為60°C以下，優(yōu)選50°C以下，如30 °C 以下，如10°C 以下、如4°C，轉(zhuǎn)速可以為12，000rpm、10，000rpm、8，000rpm、5，000rpm，離心 時(shí)間為1 ~60min，例如3min、8min、lOmin 或 15min。6. 如權(quán)利要求5所述的制備方法，其中在上清液濃縮后還將其干燥;優(yōu)選地，上清液濃 縮采用減壓蒸餾，干燥采用凍干機(jī)凍干。7. -種褐藻多酚組合物，所述褐藻多酚組合物中褐藻多酚的質(zhì)量百分比可以在15%以 上，優(yōu)選20%以上，例如24%以上； 優(yōu)選地，所述褐藻多酚組合物為上述制備方法得到的產(chǎn)物。8. 如權(quán)利要求7所述的褐藻多酚組合物或其溶液用于抑制"水華"微藻生長(zhǎng)的應(yīng)用，優(yōu) 選用于抑制"水華"微藻的細(xì)胞分裂和/或葉綠素 a合成； 優(yōu)選地，當(dāng)褐藻多酚組合物用于抑制"水華"微藻生長(zhǎng)時(shí)，所述褐藻多酚組合物在微藻 生長(zhǎng)介質(zhì)（如培養(yǎng)液或微藻生長(zhǎng)水體）中的濃度可以>2體積％，例如2.5體積％以上，如3體 積％或4體積％。9. 一種如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于：所述微藻選自小球藻（Chiorel la vulgaris)和/或斜概藻（和Scenedesmus sp ·) 〇10.-種綜合利用泡葉藻的方法，包括： 1) 使用如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法提取泡葉藻后，提取剩余的殘?jiān)M(jìn)行再提取， 得到褐藻多糖； 2) 步驟1)得到的褐藻多糖中，將褐藻淀粉和甘露醇作為酵母發(fā)酵的底物，生產(chǎn)生物能 源;和/或?qū)⒑衷迥z進(jìn)行降解，分成不同聚合度的寡糖。
【文檔編號(hào)】A01P13/00GK106070339SQ201610405853
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月8日
【發(fā)明人】吳華南, 石萍, 耿旭
【申請(qǐng)人】北京大學(xué)深圳研究生院