專(zhuān)利名稱(chēng)：生產(chǎn)內(nèi)皮抑制素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)內(nèi)皮抑制素的方法，特別是涉及使用原核表達(dá)系統(tǒng)，以提高的表達(dá)效率和產(chǎn)率生產(chǎn)重組人內(nèi)皮抑制素的方法。本發(fā)明的方法在提高表達(dá)效率的基礎(chǔ)上大大提高了人內(nèi)皮抑制素蛋白的產(chǎn)率，同時(shí)簡(jiǎn)化了表達(dá)產(chǎn)物的純化步驟及復(fù)性后蛋白質(zhì)活性的保留，從而大大降低了大批量生產(chǎn)用于臨床前檢驗(yàn)及臨床試用所需的人內(nèi)皮抑制素的生產(chǎn)成本。
血管生成(即從已有血管長(zhǎng)出新的毛細(xì)血管)對(duì)于胚胎發(fā)育、器官形成，組織再生及創(chuàng)傷修復(fù)是不可缺少的(Folkman.J.and Shing,Y.J.Biol.Chem.267:10931-10934.1992；Folkman,J.,Nature Medicine 1:27-31,1995)。同時(shí)，血管生成又是導(dǎo)致腫留生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、心血管疾病、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等許多病理?xiàng)l件發(fā)展與惡化的必要因素。
血管生成是一個(gè)包括內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和分化、細(xì)胞外基質(zhì)降解、微管形成及芽生新的毛細(xì)血管等多個(gè)步驟的，并且有一系列調(diào)節(jié)因子參預(yù)的過(guò)程。已發(fā)現(xiàn)并鑒定的血管生成刺激因子包括血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、血管通透因子(VPF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF-2和-1)等。另一方面，迄今也已發(fā)現(xiàn)并鑒定了纖連蛋白、層粘連蛋白、轉(zhuǎn)化因子β1、血小板反應(yīng)蛋白1、血小板因子4、催乳素等血管生成抑制因子。特別是近年來(lái)，O′Reilly等人(O′Reilly,M.S.et al.,Cell79:315-328,1994.′Reilly,M.S.et al,Cell 88:277-287,1997)先后發(fā)現(xiàn)并鑒定了作為纖溶酶原之內(nèi)部片段和膠原蛋白XⅧ之C末端20KDa球形區(qū)的血管生成抑制素和內(nèi)皮抑制素。從已有研究結(jié)果可以預(yù)想到，組織中血管生成表型的開(kāi)放與關(guān)閉將取決于組織局部區(qū)域血管生成刺激因子和抑制因子間的動(dòng)態(tài)平衡(參見(jiàn)Folkman,J.,N.Engl.J.Med.333:1757-1763,1995)。
特別令人感興趣的是，近年來(lái)的研究顯示，上述血管生成抑制因子大都是在對(duì)其各自的來(lái)源分子進(jìn)行蛋白質(zhì)水解并形成末端或內(nèi)部片段之后，才表現(xiàn)有內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制活性的。因此，推測(cè)蛋白質(zhì)的內(nèi)源蛋白酶裂解可能對(duì)其生物學(xué)活性的發(fā)揮起著關(guān)鍵性作用(參見(jiàn)O′Reilly,M.S.etal.,Cell 88；277-285,1997)。這一現(xiàn)象以及以前發(fā)現(xiàn)的某些生物學(xué)活性蛋白質(zhì)的內(nèi)部或側(cè)翼片段具有與該蛋白質(zhì)的完整分子相反的生物學(xué)活性；以及酶原只有在某些特定組織內(nèi)的特定生化過(guò)程中才能轉(zhuǎn)化成活性酶蛋白的現(xiàn)象，可能代表了生物體進(jìn)化過(guò)程中所建立的復(fù)雜的保護(hù)、應(yīng)激及適應(yīng)機(jī)制。
作為膠原蛋白XⅧ的20KDa羧基本末端片段，內(nèi)皮抑制素是內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的一種特殊抑制劑，并可顯著地抑制小鼠多種原發(fā)性腫瘤的生長(zhǎng)(O′Reilly,M.S.et al.,Cell88:277-285,1997和USP5.854,205)。并已顯示，重復(fù)使用內(nèi)皮抑制素可使小鼠腫瘤處于持久的休眠狀態(tài)，而且沒(méi)有誘發(fā)藥物抗性(Boehm,T.et al.,Nature 390:404-407,1997)。最近的研究進(jìn)一步顯示，內(nèi)皮抑制素導(dǎo)致細(xì)胞靜止在生長(zhǎng)周期的G1期并特異地誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡(Dhanabal,M.et al.,Biochem.Biopys.Res.Commun.258:345-352,1999)。
內(nèi)皮抑制素最初是根據(jù)其具有抑制毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的能力，而由培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞瘤細(xì)胞系中分離的(O′Reilly,M.S.et al.,Cell88:277-285,1997)。在分析其核苷酸編碼序列的基礎(chǔ)上，O′Reilly等人進(jìn)一步利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了沉淀的并且未復(fù)性的內(nèi)皮抑制素蛋白，并認(rèn)為未復(fù)性的純化蛋白質(zhì)有利于在皮下注射部位延遲釋放。作者提到，當(dāng)以標(biāo)準(zhǔn)方法使內(nèi)皮抑制素重新折疊并溶于組織培養(yǎng)基中后，即可強(qiáng)有力地抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖。但不幸的是，蛋白質(zhì)重折疊過(guò)程中造成蛋白質(zhì)的顯著丟失。鑒于該產(chǎn)物能夠延長(zhǎng)用藥后的抗腫瘤活性，因而推測(cè)內(nèi)皮抑制素可在體內(nèi)逐漸恢復(fù)天然構(gòu)象并延長(zhǎng)發(fā)揮抗血管生成活性的時(shí)間。
現(xiàn)有技術(shù)也報(bào)導(dǎo)了使用酵母(巴斯德畢赤酵母)系統(tǒng)克隆和表達(dá)可溶形式的重組內(nèi)皮抑制素的方法(Dhanabal,M.et al.,Cancer Res.59:189-197,1999)。另外，盡管報(bào)導(dǎo)了可在原核系統(tǒng)中表達(dá)有血管生成抑制活性形式的蛋白質(zhì)，但產(chǎn)物卻很難重折疊成可溶的蛋白質(zhì)，而是傾向于從溶液中沉淀析出。再者，還有人在其他真核細(xì)胞系，如NS/O小鼠骨髓瘤細(xì)胞系中表達(dá)了作為Fc-內(nèi)皮抑制素融合蛋白的內(nèi)皮抑制素(Lo,K.-M.et al,Protein Eng.11:495-500 1998)，在人胚胎腎細(xì)胞中以高水平表達(dá)了可溶形式的小鼠內(nèi)皮抑制素(Hohenester,E.et al.,EMBO J.17(6):1656-1664,1998)，以及使用修飾的附加型表達(dá)載體在293人腎細(xì)胞中表達(dá)了小鼠和人內(nèi)皮抑制素(Kohfeldt,J.F.,FEBS Lett.,16:908-916,1997)。
鑒于內(nèi)皮抑制素作為腫瘤生長(zhǎng)抑制劑使用時(shí)的臨床前研究及臨床試用的用量很大，而大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物又難以復(fù)性和易于形成沉淀的問(wèn)題，目前大多傾向于使用酵母系統(tǒng)大批量生產(chǎn)分泌形式的重組人內(nèi)皮抑制素。然而，使用巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)不僅生產(chǎn)設(shè)備投資巨大(如使用大至10噸或10噸以上發(fā)酵罐)，而且也存在因污染而遭受巨大損失的危險(xiǎn)。因此，有必要進(jìn)一步提供一種改良的，以更高的產(chǎn)率和更簡(jiǎn)單的純化工藝生產(chǎn)重組人內(nèi)皮抑制素的方法。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供編碼帶有N末端附加氨基酸序列的人內(nèi)皮抑制素的核苷酸序列，特征在于如果不考慮密碼子的簡(jiǎn)并性，其中所說(shuō)的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的序列，其中所示的Xaa+代表編碼中性氨基酸的密碼子或不存在。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的編碼附加氨基酸的核苷酸序列是在制備人內(nèi)皮抑制素核苷酸編碼序列的過(guò)程中，以與所說(shuō)的編碼序列直接相連的方式得到的。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種以提高的表達(dá)產(chǎn)率和簡(jiǎn)化的純化步驟生產(chǎn)帶有N末端附加氨基酸序列的內(nèi)皮抑制素的方法，該方法包括(1)提供3′末端直接連接有如SEQ ID NO:1所示的寡核苷酸序列的人內(nèi)皮抑制素核苷酸編碼序列(2)將步驟(1)得到的完整核苷酸序列連接到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，以得到重組表達(dá)載體；(3)將步驟(2)得到的重組載體轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌宿主中，并在適于表達(dá)由(1)中所述的核苷酸序列編碼的人內(nèi)皮抑制素的條件下，培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；(4)從細(xì)胞培養(yǎng)基中和細(xì)胞內(nèi)回收并純化所需的表達(dá)產(chǎn)物。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的表達(dá)產(chǎn)物的N末端氨基酸是甘氨酸(Gly)。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的表達(dá)載體是攜帶T7啟動(dòng)子的pET質(zhì)?；蚱溲苌?。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的表達(dá)載體是pET25B。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的大腸桿菌宿主是大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞系。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的表達(dá)產(chǎn)物是N末端帶有(Met)GlyGlyXaaHisHisHisHisHis附加氨基酸序列的人內(nèi)皮抑制素，其中Xaa代表中性氨基酸或不存在。
根據(jù)本發(fā)明這一目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的附加寡核苷酸末端作為翻譯起始密碼子ATG所編碼的蛋氨酸(Met)在翻譯后加工過(guò)程中被刪除。


圖1顯示編碼N末端帶有附加氨基酸序列的人內(nèi)皮抑制素的核苷酸序列(EEQ ID NO:1)。
圖2顯示由
圖1所示核苷酸序列編碼的N末端帶有附加序列的人內(nèi)皮抑制素的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
圖3顯示純化的N端帶有附加序列的人內(nèi)皮抑制素的SDS-PAGE分析。泳道1加1mM IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)胞裂解產(chǎn)物；泳道2分離的包涵體；泳道3用Ni-NTA柱純化的人內(nèi)皮抑制素；泳道4用Ni-NTA和SP-Sepharose層析純化的人內(nèi)皮抑制素；泳道5分子量標(biāo)準(zhǔn)品。
圖4顯示用PH梯度(磷酸緩沖)的洗脫液從Ni-NTA柱上洗脫之蛋白質(zhì)的A280吸光率曲線。
圖5顯示按本發(fā)明方法生產(chǎn)的(實(shí)線)和要酵母系統(tǒng)中表達(dá)的人內(nèi)皮抑制素(虛線)的RP-HPLC分析。
圖6顯示純化的N端帶有附加序列的人內(nèi)皮抑制素的Western印跡分析。泳道1用Ni-NTA柱純化的人內(nèi)皮抑制素；泳道2用SP-Sepharose柱純化的人內(nèi)皮抑制素；泳道3酵母表達(dá)的人內(nèi)皮抑制素。
圖7顯示純化的N端帶有附加序列的人內(nèi)皮抑制素對(duì)H22肝癌帶瘤小鼠的體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)抑制活性。
本發(fā)明涉及以重組DNA技術(shù)生產(chǎn)人內(nèi)皮抑制素的方法，特別是涉及在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，以改善的表達(dá)效率和產(chǎn)率生產(chǎn)N末端帶有至少由7個(gè)氨基酸組成的附加氨基酸序列的人內(nèi)皮抑制素的方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明通過(guò)修飾人內(nèi)皮抑制素的核苷酸編碼序列，一方面顯著地提高了內(nèi)皮抑制素結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始效率，從而獲得產(chǎn)物的高水平表達(dá)，另一方面由于按本發(fā)明方法表達(dá)的人內(nèi)皮抑制素N端附加序列中包括多個(gè)(至少5個(gè))連續(xù)的組氨酸，因而大大簡(jiǎn)化了表達(dá)產(chǎn)物的純化步驟，同時(shí)提高了產(chǎn)物的純度。
按本發(fā)明方法制備的人內(nèi)皮抑制素與按已知方法制備的內(nèi)皮抑制素具有完全相同的生物學(xué)活性，而且實(shí)質(zhì)上沒(méi)有產(chǎn)生因加入附加N端序列所導(dǎo)致的體內(nèi)免疫原性。
本說(shuō)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)“內(nèi)皮抑制素”是指用還原和非還原凝膠電泳測(cè)得分子量約為18-22KDa，能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞增質(zhì)的蛋白質(zhì)、其片段或其修飾形式。這里所說(shuō)的“修飾”是指在基本上保留分子的內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性的前提下，對(duì)野生型內(nèi)皮抑制素分子中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、加入或取代。具體地說(shuō)，經(jīng)修飾的內(nèi)皮抑制素可以是從內(nèi)皮抑制素分子的一端或兩端加入一個(gè)或多個(gè)氨基酸得到的延長(zhǎng)形式的蛋白質(zhì)或肽，或者是在內(nèi)皮抑制素分子的一端或兩端缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸得到的截短形式的蛋白質(zhì)或肽，或者也可以是用結(jié)構(gòu)或理化性質(zhì)上相似的氨基酸取代野生序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸所得到的實(shí)質(zhì)上沒(méi)有改變?cè)冀Y(jié)構(gòu)、構(gòu)型或活性的蛋白質(zhì)或肽?；诒景l(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“內(nèi)皮抑制素”尤其是指延長(zhǎng)形式的并保留有內(nèi)皮抑制素野生型分子固有的生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)或多肽。
可以依據(jù)已知的氨基酸序列，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的肽合成技術(shù)制備內(nèi)皮抑制素，特別是本發(fā)明的N端延長(zhǎng)的或者說(shuō)N端帶有附加氨基酸序列的內(nèi)皮抑制素(以下有時(shí)簡(jiǎn)稱(chēng)為YH-endo)或功能等同異構(gòu)體。
然而，從臨床應(yīng)用角度看，最好是使用重組DNA技術(shù)，以盡可能簡(jiǎn)化的方法和較低的生產(chǎn)成本大批量生產(chǎn)N末端帶有(Met)GlyGlyXaaHisHisHisHisHis附加序列(其中Xaa代表中性氨基酸或不存在)，但又不改變其生物學(xué)活性的內(nèi)皮抑制素。
根據(jù)本發(fā)明，首先提供了編碼N端帶有附加氨基酸序列(Met)GlyGlyAaaHisHisHisHisHis的內(nèi)皮抑制素的核苷酸系列。例如，可以使用本領(lǐng)域已知自動(dòng)合成系統(tǒng)合成所說(shuō)的完整核苷酸序列，或者首先合成一系列的寡核苷酸，然后將它們彼此連接后得到全長(zhǎng)度序列。作為一種常用的可替代方法，可使用基于N末端氨基酸序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物以及克隆遺傳材料的已知技術(shù)從基因庫(kù)中得到所說(shuō)的核苷酸序列。然而，為了方便起見(jiàn)，可以基于附加氨基酸序列及內(nèi)皮抑制素N末端固有的氨基酸序列合成適當(dāng)?shù)墓押塑账嵋?包括正向和反向引物)，并在DNA聚合酶和四種脫氧核苷酸的存在下，以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)合成所需的核苷酸序列。
根據(jù)本發(fā)明，可以設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)囊镆约尤刖幋aN末端延長(zhǎng)部分的核苷酸序列以及適于與載體DNA連接的酶切位點(diǎn)。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解到，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，可以在不改變其編碼的氨基酸序列的前提下，對(duì)本發(fā)明的內(nèi)皮抑制素編碼序列進(jìn)行許多不同的改動(dòng)或改變。
可以使用如此得到的核苷酸序列，在適當(dāng)?shù)脑嘶蛘婧吮磉_(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)由之編碼的N末端延長(zhǎng)的內(nèi)皮抑制素蛋白質(zhì)?；蛘邔⑦@樣的核苷酸序列連接到質(zhì)?；虿《据d體上，或包裹在脂質(zhì)微粒中，以其作為免疫原，并用適當(dāng)?shù)姆椒▽?dǎo)入人或哺乳動(dòng)物體內(nèi)(如注入肌肉內(nèi))，以在體內(nèi)表達(dá)循環(huán)的血管生成抑制因子內(nèi)皮抑制素并發(fā)揮其腫瘤生長(zhǎng)抑制作用(即所謂基因治療)，或者也可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶或RT-PCR技術(shù)合成適當(dāng)?shù)姆戳x核酸，用于腫瘤其他血管生成相關(guān)病理?xiàng)l件的治療。這里所說(shuō)的其他血管生成相關(guān)病理?xiàng)l件包括但不只限于心血管病、糖尿性視網(wǎng)膜病變及類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
本發(fā)明進(jìn)一步提供生產(chǎn)如上文限定的N端有附加氨基酸序列的內(nèi)皮抑制素的方法，該方法包括(1)提供3′末端直接連接有如SEQ ID NO:1所示的寡核苷酸序列的人內(nèi)皮抑制素核苷酸編碼序列；(2)將步驟(1)得到的完整核苷酸序列連接到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中以得到重組表達(dá)載體；(3)將步驟(2)得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌宿主中，并在適于表達(dá)步驟(1)中所述的核苷酸序列編碼的帶有N端附加序列之內(nèi)皮抑制素的條件下，培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；(4)從細(xì)胞培養(yǎng)基中和細(xì)胞內(nèi)回收并純化所需的表達(dá)產(chǎn)物。
可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的DNA操作技術(shù)(例如參見(jiàn)Sambrook et al,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour,1989)完成目的基因的制備，重組載體的構(gòu)建、產(chǎn)物的表達(dá)、表達(dá)產(chǎn)物的分離和純化等操作。例如，可使用PCR技術(shù)從人組織cDNA文庫(kù)中得到編碼人內(nèi)皮抑制素的核苷酸片段，經(jīng)在克隆載體中擴(kuò)增并進(jìn)一步鑒定后，將其連接到經(jīng)適當(dāng)酶切的表達(dá)載體(如pET25B)上，并轉(zhuǎn)化到選擇的大腸桿菌中。然后，培養(yǎng)細(xì)胞并誘導(dǎo)表達(dá)所需的N末端帶有附加氨基酸及(His)5尾部的人內(nèi)皮抑制素蛋白質(zhì)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法中由于在已知內(nèi)皮抑制素基因序列的3′端加入編碼Gly Gly Xaa His His His His His附加氨基酸的寡核苷酸序列(其中Xaa代表任何一種中性氨基酸或不存在)，從而可同時(shí)帶來(lái)兩方面的積極效果。首先加入Gly Gly Xaa(其中Xaa代表任何一種中性氨基酸或不存在)的核苷酸編碼序列，將顯著的提高DNA轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄本翻譯的起始效率，從而為提高表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)車(chē)提供了必要條件。我們以前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，如果從3′端刪去(Met)Gly GlySer的編碼序列，內(nèi)皮抑制素蛋白質(zhì)的表達(dá)產(chǎn)率只占細(xì)菌總蛋白的約1％；相反，由于加入N末端(Met)Gln Gln Ser序列，則可使內(nèi)皮抑制素蛋白質(zhì)的產(chǎn)率達(dá)到總細(xì)胞蛋白質(zhì)含量的20-50％。此外，Gly GlyXaa的加入還將有利于保護(hù)蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物免于遭受部分蛋白酶降解。另一方面，緊接在GlyGlyXaa之后的(His)5附加序列的加入，主要是為了便于使用Ni整合型層析柱純化目的產(chǎn)物，進(jìn)而簡(jiǎn)化蛋白質(zhì)純化步驟(例如參見(jiàn)Skerra,A et al.,Biotochnology(NY)9(3):273-278,1991；Stuber,Detal.,Immunol.Motlods 4:120-123,1991)。還應(yīng)特別指出的是，雖然Gly Gly Xaa序列中的Xaa可以是任何氨基酸或不存在，但優(yōu)選的Xaa是Ser。
為了得到3′端帶有附加氨基酸之核苷酸編碼序列的(SEQ ID NO:1)的人內(nèi)皮抑制素基因序列，可以基于待加入的N端附加氨基酸序列及已知的全長(zhǎng)度內(nèi)皮抑制素的氨基酸使用自動(dòng)DNA合成裝置，合成一對(duì)含有附加序列和適應(yīng)酶切位點(diǎn)的上游引物和下游引物。使用人肝cNA作為模板，在四種單核苷及DNA聚合酶存在下進(jìn)行PCR反應(yīng)。由于合成的寡核苷酸引物中已加入了編碼N端附加氨基酸的相應(yīng)核苷酸序列，所以經(jīng)PCR擴(kuò)散后即可得到3′端帶有附加氨基酸之編碼序列和適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)的全長(zhǎng)度內(nèi)皮抑制素基因序列(約579bp)。將如此得到的基因序列連接到適當(dāng)?shù)目寺≥d體中并在大腸桿菌宿主細(xì)胞中。培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞并在適當(dāng)?shù)倪x擇培養(yǎng)基上選擇陽(yáng)性克隆后，從細(xì)胞中分離所需的DNA并經(jīng)酶切分析證實(shí)所得片段的正確性?；蛘咭嗫赏ㄟ^(guò)對(duì)兩條鏈的全核苷酸序列分析進(jìn)一步證實(shí)之。
然后將編碼帶有N末端附加序列內(nèi)皮抑制素，并且兩端已另外加入適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)的核苷酸片段(XhoⅠ/NdeⅠ片段)連接到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，例如含有噬菌體T7啟動(dòng)子并已用同樣的核酸內(nèi)切酶切成線性同時(shí)除去了信號(hào)序列的pET25B載體中。使用本領(lǐng)域已知的方法將所得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到適于在其中表達(dá)所需內(nèi)皮抑制素蛋白質(zhì)的細(xì)胞，例如大腸桿菌LB21(DE3)細(xì)胞系中。在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞，并經(jīng)誘導(dǎo)后完成蛋白質(zhì)的表達(dá)。預(yù)期的表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列是(Met)GlyGlyXaaHisHisHisHisHis-內(nèi)皮抑制素，特別是(Met)GlyGlySerHisHisHisHisHis-內(nèi)皮抑制素，即本文定名為YH-endo的蛋白質(zhì)?？砂凑罩圃焐?Qiagen)提供的使用手冊(cè)中所述的方法，于8M尿素存在下使用Ni-NTA層析柱完成重組蛋白質(zhì)的純化。用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)分析純化的蛋白質(zhì)，然后合并含有所需表達(dá)產(chǎn)物的洗脫物。
洗脫過(guò)程中，可使用分光光度法定時(shí)取樣檢測(cè)280nm吸光率，同時(shí)使用SDS-PAGE法檢測(cè)洗脫物中約21kDa蛋白質(zhì)的存在，以監(jiān)測(cè)按本發(fā)明方法生產(chǎn)的YH-endo的洗脫峰(參見(jiàn)圖3和4)。對(duì)按本發(fā)明方法制備的YH.endo進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析，結(jié)果顯示其表達(dá)產(chǎn)率約為10g/L培養(yǎng)物。這一產(chǎn)率顯著高于已報(bào)導(dǎo)的大腸桿菌或酶母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)內(nèi)皮抑制素的產(chǎn)率。推測(cè)這一產(chǎn)率的改善是由于N末端附加氨基酸編碼序列的加入顯著地提高了mRNA的翻譯起始速度所致。
可使用不同的方法完成蛋白質(zhì)的重折疊(復(fù)性)，例如可使用含有還原態(tài)和氧化態(tài)谷脫甘肽及不同濃度尿素的Tris緩沖液(重折疊緩沖液)處理蛋白質(zhì)。雖然O′Reilly等人(例如參見(jiàn)O′Reilly,M.S.et.al.,Cell 88:277-285,1997)曾報(bào)導(dǎo)未重疊折的不溶性?xún)?nèi)皮抑制素同樣表現(xiàn)有血管內(nèi)皮細(xì)胞增質(zhì)抑制活性和腫瘤生長(zhǎng)抑制活性，但我們的研究顯示，在嚴(yán)格控制的復(fù)性條件下達(dá)到實(shí)現(xiàn)盡可能大比例蛋白質(zhì)的充分復(fù)性，對(duì)于改善大腸桿菌表達(dá)的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性及貯存穩(wěn)定性是十分重要的。
可以使用凝血酶裂解去除重組人內(nèi)皮抑制素的His尾端部分，例如可按大約200∶1的比例向純化蛋白質(zhì)的溶液中加入凝血酶并于大約23℃下保溫30分鐘。然后使用凝膠過(guò)濾層析法分離裂解片段。然而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，既使不除去His尾端及與之直接相連的GlyGlySer序列也不會(huì)影響終產(chǎn)物的生物學(xué)活性，而且沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其可導(dǎo)致任何免疫原性反應(yīng)(數(shù)據(jù)未示出)。
按照已知的方法，使用12％聚丙烯酰胺對(duì)從Ni-NTA柱上純化的YH-endo進(jìn)SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示在還原條件下(例如用含1M二巰基乙醇的洗脫液處理)，YH-endo具有大約21KDa的表觀分子量(圖3)，另外，為了確定按本發(fā)明方法制備的YH-endo的免疫反應(yīng)性，可使用預(yù)制備的免抗YH-endo進(jìn)行反相高壓液相層析(RP-HPLC)分析(圖5)。
雖然按照上述本發(fā)明方法能夠以高產(chǎn)率和高純度，并以較低的生產(chǎn)成本制得適于工業(yè)化大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)的重組人內(nèi)皮抑制素，但這一切均須以所得產(chǎn)物具有足夠高的，適于臨床應(yīng)用的生物學(xué)活性為基礎(chǔ)。目前已建立了許多用于檢測(cè)內(nèi)皮抑制素蛋白的生物學(xué)活性的方法，這里可以提到的方法包括體外內(nèi)皮細(xì)胞增殖和/或遷移抑制試驗(yàn)(其中使用的細(xì)胞系包括牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(C-PAE)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVE)、牛腎上腺皮質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMVE-L)、人內(nèi)皮細(xì)胞ECV304細(xì)胞系等內(nèi)皮細(xì)胞，以及牛主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(SMC)、牛視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(PPE)、水貂上皮細(xì)胞(MLE)、NIH3T3成纖維細(xì)胞、IMR-90肺成纖維細(xì)胞及H9c2成肌細(xì)胞等非內(nèi)皮細(xì)胞)；小鼠角膜血管生成試驗(yàn)(Kenyon,B.M.et al.,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.37:1625-1632,1996)；雞胚尿囊絨毛膜(CAM)試驗(yàn)；以及細(xì)菌表達(dá)的內(nèi)皮抑制素對(duì)移植腫瘤的體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)和/或轉(zhuǎn)移抑制試驗(yàn)(其中使用的腫瘤動(dòng)物模型包括B16-BL6腫轉(zhuǎn)移瘤、H22肝細(xì)胞瘤、LLC-LM原發(fā)瘤、Lewis肺癌、T241纖維肉瘤、B16F10黑色素瘤、786-0腎透明細(xì)胞瘤等)。
盡管目前用于檢測(cè)內(nèi)皮抑制素生物學(xué)活性的內(nèi)皮細(xì)胞系和腫瘤動(dòng)物模型均缺乏足夠的敏感性和特異性，但我們的初步實(shí)驗(yàn)(參見(jiàn)實(shí)施例4)結(jié)果表明，按本發(fā)明方法制備的YH-endo蛋白質(zhì)具有與不帶有N端附加氨基酸序列的內(nèi)皮抑制素完全相同生物學(xué)活性，即體外內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制活性和帶瘤小鼠的體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)抑制活性。
下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例說(shuō)明本發(fā)明的方法及其優(yōu)點(diǎn)，但這些實(shí)施例并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明待批權(quán)利要求范圍的限制。
實(shí)施例1用于表達(dá)帶有N末端附加氨基酸和(His)尾部之內(nèi)皮抑制素的重組質(zhì)粒的構(gòu)建基于內(nèi)皮抑制素蛋白質(zhì)的N末端和N末端氨基酸序列及待加入之N末端附加氨基酸，設(shè)計(jì)并使用Vent DNA聚合酶(New England biolabs)合成一對(duì)引物，并以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)從人肝臟cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增得到編碼人內(nèi)皮抑制素YH-endo的DNA序列。一對(duì)引物包括5′上游引物CATATGGGGGGTTCTCATCACCATCACCATCAC(SEQ ID NO:3)，其中含有NdeⅠ位點(diǎn)和包括30個(gè)核苷酸的附加氨基酸編碼序列，以及其后的內(nèi)皮抑制素退火序列；和3′(下游)引物CTCGAGCTACTTGGAGGCAGTCATGAAGC(SEQ IDNO:4)，其中含有退火序列和終止密碼子及其后的XhoⅠ位點(diǎn)。PCR的反應(yīng)條件是49℃變性1分鐘，然后于60℃退火1分鐘并于72℃退火1.5分鐘，共進(jìn)行30次PCR循環(huán)。
擴(kuò)增完成后，使用QIAquick PCR純化試劑盒純化PCR擴(kuò)增的片段，并用NdeⅠ和XhoⅠ消化得到579bp片段?；蛘呤褂肨A克隆試劑盒，將其克隆到PCR-TM-Ⅱ拖尾載體中并進(jìn)行全序列測(cè)定，然后再?gòu)腡A克隆載體中切出NdeⅠ/xhoⅠ片段(579bp)。
將此579bp片段連接到已用NdeⅠ和XhoⅠ切成線性并用牛小腸堿性磷酸酶去磷酸化處理的pET25B表達(dá)載體(Novagen)中，得到重組表達(dá)質(zhì)粒YH-endo/pET25B。該載體適于表達(dá)與上述附加序列及(His)5接尾融合的蛋白質(zhì)。首先用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-1Blue,在含有青霉素的培養(yǎng)基中保溫過(guò)夜后，挑選陽(yáng)性菌落并從中大量制備DNA。分別用NdeⅠ/XhoⅠ、HindⅢ/SacⅡ或NdeⅠ/SmaⅠ對(duì)所得重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行切鑒定，分別得到0.6Kb和5.4Kb片段、0.28Kb和5.70Kb片段，以及0.315Kb和5.7Kb片段。經(jīng)DNA序列分析進(jìn)一步證實(shí)序列(
圖1)的正確性后，將此定名為YH-endo/pET25B的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到攜帶T7RNA聚合酶基因的感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)菌株(Novagen)中，以進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)。使用T7序列酶2.0版本DNA測(cè)序試劑盒(Amersham)和Sequi-GenⅡ核酸測(cè)序電泳系統(tǒng)(Bio-Rad)，以鏈終止DNA測(cè)序法進(jìn)一步證實(shí)重組構(gòu)建體的序列。
實(shí)施例2帶有N端附加序列及(His)5加尾的人內(nèi)皮抑制素蛋白質(zhì)的表達(dá)與純化將重組質(zhì)粒YH-endo/pET25B轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21克隆加在含LB培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)(37℃,5％CO2)。待細(xì)胞密度達(dá)到OD600≈0.8-0.9后，向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。約3-4小時(shí)后，以5,000xg離心(30′)收獲細(xì)胞。將細(xì)菌細(xì)胞重新懸浮于含有8M尿素、10mM Tris和100mM磷酸鈉緩沖液的平衡液中室溫放置1小時(shí)，并將細(xì)胞超聲處理3次。然后將包涵體溶解于含有7M鹽酸胍和50mM-巰基乙醇的Tris緩沖液(PH8.0)中繼續(xù)放置1小時(shí)，以10000Xg離心25分鐘并收集上清。將如此得到的上清液上樣于已用上述平衡溶液平衡過(guò)的如QIAexpressionist手冊(cè)(Qiagen)中所述的Ni-NTA柱，用含有8M尿素，0.1M磷酸鈉和20mM咪唑的洗脫液，以pH8.0至pH4.5的逐漸降低的pH梯度洗脫，并按每管1.5ml收集洗出物。用SDS-PAGE方法分析Ni2+柱純化的洗脫物并合并含所需的分子量約21KDa的蛋白質(zhì)的部分。洗脫過(guò)程中，以分光光法監(jiān)視洗脫物的280mM吸光率，可在第20-25管時(shí)(PH5.5)出現(xiàn)一個(gè)高聳的單一吸收峰(圖4)。
將按上述方法從Ni2+柱上洗脫的含內(nèi)皮抑制素蛋白質(zhì)的洗脫物以1∶10體積比，迅速稀釋于含有2.5M尿素、100mMNaCL、0.1MTris-HCL(pH8.0)、2mM還原態(tài)谷胱甘肽和0.02mM氧化態(tài)谷胱肽的溶液中以使蛋白質(zhì)重折疊(復(fù)性)。
可以按1∶200濃度比例向純化并復(fù)性的蛋白質(zhì)中加入溶于20mMTris-HCL緩沖液(含有100mM NaCl)(PM8.0)中的凝血酶，于24℃保溫約20分鐘，以從人內(nèi)皮抑制素分子上裂解掉C端的His加尾部分。裂解后用凝膠過(guò)濾樹(shù)脂Superdex 75HR 10/30(Pharmacia)除去裂解的肽片段?；蛘?，不進(jìn)行此裂解處理而將蛋白質(zhì)直接用于下述理化性質(zhì)和生物學(xué)活性分析。對(duì)未去除N端附加序列之內(nèi)皮抑制素(YH-endo)表達(dá)產(chǎn)物的半定量分析顯示，按照本發(fā)明方法制得的YH-endo蛋白質(zhì)的產(chǎn)率約為10g/L。
實(shí)施例3帶有N末端附加序列及(His)5加尾的人內(nèi)皮抑制素的生物化學(xué)性質(zhì)鑒定1．SDS-PAGE分析按照文獻(xiàn)中已描述的方法，使用12％聚丙烯酰胺凝膠對(duì)Ni-整合型層析柱上洗脫的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE分析。將分析的樣品溶解于含有-巰基乙醇(1M)的洗脫緩沖液中，以致使所有較高分子量的蛋白質(zhì)復(fù)合物都轉(zhuǎn)變成大約21KDa大小的單一帶。結(jié)果如圖3所示。
從圖3中可以看出，大部分結(jié)合于Ni柱上的蛋白質(zhì)均在含20mM咪唑的PH5.5洗脫液中洗出，并且所洗脫的蛋白質(zhì)均表現(xiàn)為一條單一的21KDa的帶。
2．Western印跡分析基本上按照Dhanahal等(Dhanabal,M.et al.,CancerRes,59:189-197,1999)所述的方法制備抗YH-endo的多克隆抗血清，并以12％SDS-PAGE法分離重組人內(nèi)皮抑制素(YH-endo)，然后按照文獻(xiàn)中已述的方法進(jìn)行Westem印跡分析。其中兔抗人內(nèi)皮抑制素抗血清稀釋4000倍；第二抗體是與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結(jié)合的羊抗兔IgG(1∶5000稀釋)。根據(jù)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度檢測(cè)免疫反應(yīng)性(例如參見(jiàn)Dhanabal,M.et al.,Cancer Res.59:189-197,1999)。分析結(jié)果表明，按本發(fā)明方法產(chǎn)生的YH-endo可被抗YH-endo抗血清識(shí)別(參見(jiàn)圖6)。
3．反相高壓液相層析(RP-HPLC)使用Gilson HPLC系統(tǒng)在C18柱(260×4.6mm,Vydac)上進(jìn)行反相高壓液相層析，并使用5-95％乙腈梯度，以1ml/分的流速洗柱。從圖5所示的層析譜可以看出，經(jīng)Hi柱純化的YH-endo顯示為一條單一的尖峰，并表明純化產(chǎn)物中基本上沒(méi)有蛋白質(zhì)聚合體或降解片段存在。
實(shí)施例4帶有N末端附加序列及(His)5加尾的人內(nèi)皮抑制素的生物學(xué)活性檢測(cè)1、雞胚尿囊膜法取新鮮的受精卵放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中，每天翻轉(zhuǎn)兩次。培養(yǎng)至第九天在照卵燈下將氣室打一個(gè)1-2mm的小孔，在距胚鈄1cm兩條卵黃靜脈之間的卵殼上開(kāi)一個(gè)矩形方孔，去除卵黃膜。在尿囊膜上放置一經(jīng)過(guò)消毒的甲基纖維素凹膜，加入4ul待測(cè)樣品。封口并在37℃恒溫下培養(yǎng)3天，觀察結(jié)果。結(jié)果可見(jiàn)，與對(duì)照組相比酵母分泌表達(dá)的內(nèi)皮抑制素及按本發(fā)明方法制備YH-endo均具有明顯的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制活性，而且兩者具有幾乎完全相同的比活性。
2、對(duì)培養(yǎng)的牛內(nèi)皮細(xì)胞(BCE)的增殖抑制活性實(shí)驗(yàn)按孵Folkman等人(Folkman,J.et al.,PNAS USA765217-5221,1979)所述的方法制備牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(BCE)。將細(xì)胞用胰蛋白酶(0.05％,PBS)消化后懸浮于0.25mlDMEM+10％BCS+1％GPS中(25000細(xì)胞/ml)。將細(xì)胞懸液(0.5ml/孔)加于膠原鋪敷的24孔培養(yǎng)板中，并與37℃、10％CO2條件下保溫24小時(shí)。保溫后更換培養(yǎng)基(0.25ml DMEM+5％BCS+1％GPS)并加入待檢樣品，繼續(xù)保溫30分鐘，加入內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)刺激因子FGF-2(1ng/1ml)，72小時(shí)后觀察結(jié)果。結(jié)果說(shuō)明YH-endo由與酵母表達(dá)的endostatin相似的生物活力(ED50≈400ng)。
3．YH-endo對(duì)H22肝癌細(xì)胞、宮頸癌Hela細(xì)胞、胃癌8GC7901細(xì)胞實(shí)體瘤模型的抑瘤試驗(yàn)將體外培養(yǎng)的人H22肝癌細(xì)胞、宮頸癌Hela細(xì)胞、胃癌SGC7901細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后在Hanks液中制成單細(xì)胞懸液中。稀釋后調(diào)整細(xì)胞數(shù)至5-7*107/ml，并按0.2ml/只動(dòng)物接種于小鼠右側(cè)腋部皮下。接種一周后將動(dòng)物隨機(jī)分成8組，每組10只。各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物分別按1.5mg/kg、0.75mg/kg、0.4mg/kg的劑量經(jīng)尾靜脈內(nèi)注射投用，按本方明方法制備的YH-endo。陽(yáng)性對(duì)照組投用藥劑量酵母分泌表達(dá)的內(nèi)皮抑制素。陰性對(duì)照組則注射同樣體積的生理鹽水。連續(xù)給藥20天，每天一次。末次給藥24小時(shí)后，斷頸處死動(dòng)物，分離腫瘤塊并稱(chēng)重，然后計(jì)算抑瘤率。
結(jié)果顯示，按本發(fā)明方法制備的YH-endo分別以1.5、0.75、0.4mg/kg的劑量投用20天后對(duì)H22肝癌動(dòng)物的抑瘤率分別為45.67、43.08和40.00％；對(duì)宮頸Hela細(xì)胞帶瘤動(dòng)物的抑瘤率分別為40.70、30.15和24.12％；對(duì)胃癌SGC細(xì)胞帶瘤動(dòng)物的抑瘤率分別為51.89、44.34和35.85％(參見(jiàn)圖7)。
序列表(1)一般信息(ⅲ)序列數(shù)4(1)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度576堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅹⅰ)序列描述ATGGGGGGTTCTCATCACCATCACCATCACAGCCACCGCGACTTCCAGCCGGTGCTCCACCTGGTTGCGCTCAACAGCCCCCTGTCAGGCGGCATGCGGGGCATCCGCGGGGCCGACTTCCAGTGCTTCCAGCAGGCGCGGGCCGTGGGGCTGGCGGGCACCTTCCGCGCCTTCCTGTCCTCGCGCCTGCAGGACCTGTACAGCATCGTGCGCCGTGCCGACCGCGCAGCCGTGCCCATCGTCAACCTCAAGGACGAGCTGCTGTTTCCCAGCTGGGAGGCTCTGTTCTCAGGCTCTGAGGGTCCGCTGAAGCCCGGGGCACGCATCTTCTCCTTTGACGGCAAGGACGTCCTGAGGCACCCCACCTGGCCCCAGAAGAGCGTGTGGCATGGCTCGGACCCCAACGGGCGCAGGCTGACCGAGAGCTACTGTGAGACGTGGCGGACGGAGGCTCCCTCGGCCACGGGCCAGGCCTCCTCGCTGCTGGGGGGCAGGCTCCTGGGGCAGAGTGCCGCGAGCTGCCATCACGCCTACATCGTGCTCTGCATTGAGAACAGCTTCATGACTGCCTCCAAGTAG(2)SEQID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度192個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅹⅰ)序列描述MetGlyGlySerHisHisHisHisHisHisSerHisArgAspPheGlnProValLeuHisLeuValAlaLeuAsnSerProLeuSerGlyGlyMetArgGlyIleArgGlyAlaAspPheAsnCysPheGlnGlnAlaArgAlaValGlyLeuAlaGlyThrPheArgAlaPheLeuSerSerArgLeuGlnAspLeuTyrSerIleValArgArgAlaAspArgAlaAlaValProIleValAsnLeuLysAsnGluLeuLeuPheProSerTrpGluAlaLeuPheSerGlySerGluGlyProLysLysProGlyAlaArgIlePheSerPheAspGlyLysAspValLeuArgHisProThrTrpProGlnLysSerValTrpHisGlySerAspProAsnGlyArgArgLeuThrGluSerTyrCysGluThrTrpArgThrGluAlaProSerAlaThrGlyGlnAlaSerSerLeuLeuGlyGlyArgLeuLeuGlyGlnSerAlaAlaSerCysHisHisAlaTyrIleValLeuCysIleGluAsnSerPheMetThrAlaSerLys(2)SEQ ID NO:3的信息(Ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅹⅰ)序列描述CATATGGGGGGTTCTCATCACCATCACCATCAC2)SEQ ID NO:4的信息(Ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅹⅰ)序列描述CTCGAGCTACTTGGAGGCAGTCATGAAGC
權(quán)利要求
1.編碼帶有N末端附加氨基酸序列的人內(nèi)皮抑制素的核苷酸序列，特征在于如果不考慮密碼子的簡(jiǎn)并性，其中所說(shuō)的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的序列，其中所示的XXX代表編碼中性氨基酸的密碼子或不存在。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的核苷酸序列，其中所說(shuō)的編碼附加氨基酸的核苷酸序列是在制備人內(nèi)皮抑制素核苷酸編碼序列的過(guò)程中，以與所說(shuō)的編碼序列直接相連的方式得到的。
3.一種以提高的表達(dá)產(chǎn)率和簡(jiǎn)化的純化步驟生產(chǎn)帶有N末端附加氨基酸序列的內(nèi)皮抑制素的方法，該方法包括(1)提供3′末端直接連接有如SEQ ID NO:1所示的寡核苷酸序列的人內(nèi)皮抑制素核苷酸編碼序列(2)將步驟(1)得到的完整核苷酸序列連接到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，以得到重組表達(dá)載體；(3)將步驟(2)得到的重組載體轉(zhuǎn)化到適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌宿主中，并在適于表達(dá)由(1)中所述的核苷酸序列編碼的人內(nèi)皮抑制素的條件下，培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；(4)從細(xì)胞培養(yǎng)基中和細(xì)胞內(nèi)回收并純化所需的表達(dá)產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所說(shuō)的表達(dá)產(chǎn)物的N末端氨基酸是甘氨酸(Gly)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所說(shuō)的表達(dá)載體是攜帶T7啟動(dòng)子的pET質(zhì)粒或其衍生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所說(shuō)的表達(dá)載體是pET25B。
7.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所說(shuō)的大腸桿菌宿主是大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞系。
8.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所說(shuō)的表達(dá)產(chǎn)物是N末端帶有(Met)GlyGlyXaaHisHisHisHisHis附加氨基酸序列的人內(nèi)皮抑制素，其中Xaa代表中性氨基酸或不存在。
9.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所說(shuō)的附加寡核苷酸末端作為翻譯起始密碼子ATG所編碼的蛋氨酸(Met)在翻譯后加工過(guò)程中被刪除。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)內(nèi)皮抑制素的方法,特別是涉及使用原核表達(dá)系統(tǒng),以提高的表達(dá)效率和產(chǎn)率生產(chǎn)重組人內(nèi)皮抑制素的方法。本發(fā)明的方法在提高表達(dá)效率的基礎(chǔ)上大大提高了人內(nèi)皮抑制素蛋白的產(chǎn)率,同時(shí)簡(jiǎn)化了表達(dá)產(chǎn)物的純化步驟及復(fù)性后蛋白質(zhì)活性的保留,從而大大降低了大批量生產(chǎn)用于臨床前檢驗(yàn)及臨床試用所需的人內(nèi)皮抑制素的生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1324818SQ00107569
公開(kāi)日2001年12月5日 申請(qǐng)日期2000年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月22日
發(fā)明者羅永章, 周兵 申請(qǐng)人:煙臺(tái)榮昌生物工程有限公司