專利名稱：鏈格孢菌的粗代謝物用于生物除草的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明為鏈格孢菌的粗代謝物用于生物除草的方法，屬于微生物應用于農(nóng)業(yè)植物保護、防除農(nóng)作物雜草的技術(shù)領域，專用于農(nóng)田雜草的防除。
微生物代謝物治草是以微生物的代謝產(chǎn)物或從微生物中分離得到的植物毒素作為除草劑治理雜草的一種方法?，F(xiàn)已成為研究和開發(fā)的重點或熱點。這類除草劑在貯存、應用、制劑的相容性和半衰期方面都比活體微生物更優(yōu)越，且不會使非靶標植物染病，其藥效通常也不依賴于環(huán)境因素，便于預測。茴香毒素(Anisomycin)是鏈霉菌代謝的產(chǎn)物，能強烈抑制稗草和馬唐等雜草?！盁o公害”除草劑甲氧苯酮就是根據(jù)茴香霉素仿制而成的一種水田除草劑，對水稻和稗草有高度的選擇性，抑制稗草葉綠素形成，產(chǎn)生白化而致死。青霉菌屬(Penicillium frequentans)中的11個種，經(jīng)發(fā)酵后能產(chǎn)生N-甲?；u氨基乙酸，可殺死馬唐及一些雙子葉雜草。金色假單胞桿菌(Psendomonasaurecafaciens)的發(fā)酵產(chǎn)物吩嗪-1-羧酸與2羥基吩嗪-1-羧酸，每英畝10磅的劑量可防除狗尾草、水田芥和水生植物藍綠藻和浮萍(Lemna sp．)等。
這其中最著名的要數(shù)雙丙氨膦，它是由吸水鏈霉菌(Streptomyces hygruscopicus)發(fā)酵的產(chǎn)物，在日本廣泛地的應用。根據(jù)雙丙氨膦的化學結(jié)構(gòu)研制開發(fā)出的滅生性除草劑草胺膦(草丁膦)，在歐美國家廣泛應用。并且，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)研制開發(fā)出抗草胺膦作物，被廣泛栽培，進一步，擴大了該除草劑的使用范圍。
利用鏈格孢菌的活孢子作生物除草劑，防除雜草已有很多報道。但是，利用代謝產(chǎn)物進行除草，僅有以AAL-toxin毒素和交鏈孢酸為主要的有效成分進行除草的報道。AAL-toxin毒素的殺草作用申請了專利。在該專利中，曾提及含有該毒素的粗提物的除草活性，其主要有這些特征是主要針對某些闊葉雜草如龍葵、曼佗羅、弗吉尼亞合萌、大果田菁等，對禾本科雜草幾乎無效；粗提物是以固體培養(yǎng)基如玉米粉或大米進行固體培養(yǎng)后，經(jīng)水洗過濾而獲得的過濾液，具活性的濃度在1000ppm以上等。交鏈孢酸也有類似的僅對闊葉草有效的特點。但是，這兩種毒素除草的種類較少，不能防除禾草與莎草，對闊葉草的防除種類亦少；固體培養(yǎng)生產(chǎn)能力相對較低，不適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
我國目前尚未有一種生物除草劑產(chǎn)業(yè)化，客觀上推進生物除草劑的產(chǎn)業(yè)化，將改變我國目前除草劑的產(chǎn)品結(jié)構(gòu)，農(nóng)藥化工的產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，以及滿足綠色和有機食品生產(chǎn)對無公害除草劑的需求。
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有鏈格孢菌毒素不能防除禾草與莎草，對闊葉草的防除種類亦少；固體培養(yǎng)生產(chǎn)能力相對較低，不適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的缺陷，提供一種鏈格孢菌的粗代謝物用于生物除草的方法，直接利用含有植物毒素活性成分的鏈格孢菌粗代謝產(chǎn)物作為生物源化學除草劑，用于生物除草，作為廣譜性除草劑，莖葉噴霧處理，安全有效地控制禾本科雜草、闊葉草和莎草。適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的培養(yǎng)技術(shù)。對環(huán)境污染小，殺草譜廣、殺草迅速。
本發(fā)明鏈格孢菌的粗代謝物用于生物除草的方法，其內(nèi)容和實施方案如下鏈格孢菌的粗代謝產(chǎn)物用于控制雜草的方法為直接利用鏈格孢菌(Alternariaalternata(Fr．)Keissler)經(jīng)PDA培養(yǎng)的菌種培養(yǎng)物小塊，采用液體培養(yǎng)或小麥固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，過濾掉活菌絲及其它活性細胞后，其粗代謝產(chǎn)物的混合物原液，經(jīng)水稀釋15倍以內(nèi)至濃縮10倍間，其中粗代謝物的作用濃度在1000μg／ml以下。噴施于雜草莖葉上，在48小時內(nèi)致雜草迅速死亡，這些雜草包括了主要的闊葉雜草、禾草和莎草。
液體培養(yǎng)方法為玉米和黃豆粉液體培養(yǎng)基(SCSC)、馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基(PSK)、紫莖澤蘭葉汁培養(yǎng)基等液體培養(yǎng)基之一種PSK培養(yǎng)基200g土豆水煮過濾液(四層紗布過濾)，30g蔗糖，1gK2HPO4，加水至1L。
SCSC培養(yǎng)基15g玉米粉+15g黃豆粉，30g蔗糖，3gCaCO3，加水至1L。
紫莖澤蘭葉汁培養(yǎng)基200g紫莖澤蘭葉水煮過濾液，30g蔗糖，1gK2HPO4，加水至1L。
每1升培養(yǎng)液置于3升左右容積的培養(yǎng)瓶中，在23-26℃溫度下，黑暗或12小時光照／12小時黑暗交替，靜置或震蕩(110轉(zhuǎn)／分鐘)培養(yǎng)5-8天。將培養(yǎng)液用濾紙過濾，濾液經(jīng)高速離心，取上清液用0．45μm微孔薄膜過濾，得無菌濾液。
小麥粒固體培養(yǎng)基稱取100g，裝入500ml的三角瓶中，用清水淘凈后，再浸泡10h，除去多余水分，置于滅菌鍋中滅菌30分鐘(121℃)，冷卻后接種鏈格孢菌株，于25℃、12hL(光)／12hD(暗)的條件下培養(yǎng)，每天搖動1-2次三角瓶，避免結(jié)塊，3周后取出培養(yǎng)物，80℃下烘干，粉碎，然后用乙酸乙酯抽提3次，常壓蒸餾回收乙酸乙酯，得粗毒素。
無菌濾液經(jīng)稀釋15以內(nèi)至濃縮10倍間，可以加入1-5％的助劑，助劑為非離子型表面活性劑、植物源助劑以及滲透劑。主要種類有增效劑SD(SD)、十二烷基苯磺酸鈉(12WB)、農(nóng)乳100號(NR100)以及0．01-0．5％滲透劑等。噴霧于2-5葉期的雜草幼苗上，經(jīng)5小時以上，雜草幼苗出現(xiàn)萎焉癥狀，再經(jīng)2天左右時間并可以完全殺死雜草?？梢詺⑺礼R唐、牛筋草、光頭稗、稗草、野燕麥、看麥娘、日本看麥娘、菵草、硬草、牛毛氈、鱧腸、鐵莧菜、豬殃殃、大巢菜、稻槎菜、藜、牛繁縷、雀舌草、節(jié)節(jié)菜、鴨舌草、播娘蒿、鴨趾草、水花生、反枝莧、野莧、薺菜等農(nóng)田主要的闊葉雜草、禾草和莎草。
發(fā)明人在對紫莖澤蘭的生物防治研究過程中發(fā)現(xiàn)了野外紫莖澤蘭的自然發(fā)病現(xiàn)象，故對其寄生真菌進行篩選研究。分離獲得了鏈格孢菌(Alternaria alternata(Fr．)Keissler)菌株，對其生物學特性、致病性及致病機理進行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)其致病的主要作用機理是致病植物毒素的產(chǎn)生。通過對鏈格孢菌經(jīng)液體培養(yǎng)后濾除活菌后的培養(yǎng)殘液，測試培養(yǎng)殘液、提取的粗毒素、以及分離提純的毒素的除草生物活性，發(fā)現(xiàn)在1-1000μg／ml以內(nèi)就能使雜草產(chǎn)生明顯的毒害癥狀，引起毒害癥狀的最快時間在5小時，2天內(nèi)可以完全殺死雜草。研究發(fā)現(xiàn)對供試的94種植物中，僅有3種不敏感。
粗毒素的制備是將菌株按上述的條件培養(yǎng)后，將培養(yǎng)液用4層紗布過濾，再用普通濾紙抽濾，取濾液用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，將乙酸乙酯蒸餾回收，得粗毒素。粗毒素經(jīng)少量無水酒精溶解，再用水稀釋至特定濃度，處理雜草。
鏈格孢菌毒素溶液處理的部位，明顯受害，癥狀的出現(xiàn)最快時間在5小時，致48小時，受處理的雜草部位完全壞死。毒素的毒害作用，僅限于受藥劑處理的部位，幾乎沒有傳導。
鏈格孢菌毒素影響雜草離體葉片細胞膜的透性，隨著毒素濃度的增加，浸出液的相對電導率上升。當毒素濃度從1增加到2．5μg／g時，浸出液的相對電導率變化很小，而當毒素濃度從2．5增加到5μg／g時，浸出液的相對電導率變化很大，增加2倍多，當毒素濃度再增加時，浸出液的相對電導率上升很小，這個結(jié)果表明，毒素的吸收可能與膜上受體有關(guān)，當受體被飽和后，相對透性不再受毒素濃度的影響。鏈格孢菌毒素能引起紫莖澤蘭葉組織K+和Na+的滲漏，隨著毒素濃度的增加，浸出液中K+和Na+的含量上升。
引起細胞膜透性改變是致病毒素作用于寄主后發(fā)生的普遍性的反應。菌株產(chǎn)生的致病毒素能引起雜草離體葉片細胞膜的透性上升，K+、Na+的滲漏，葉組織的膜脂過氧化加劇，說明致病毒素引起細胞膜的傷害，造成膜功能的紊亂。致病毒素處理后，雜草離體葉片的過氧化物酶(POD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化氫酶(CAT)的活性下降，使活性氧清除系統(tǒng)中酶系統(tǒng)遭到破壞，活性氧過量積累，細胞因此受到傷害，最終使雜草葉片表現(xiàn)出受害癥狀。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其主要優(yōu)點和積極效果如下1)現(xiàn)有技術(shù)中鏈格孢菌采用玉米或大米固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，主要針對某些闊葉雜草如龍葵、曼佗羅、弗吉尼亞合萌、大果田菁等，對禾本科雜草幾乎無效；本發(fā)明鏈格孢菌經(jīng)用液體培養(yǎng)的粗代謝產(chǎn)物，利用液體發(fā)酵培養(yǎng)的方法，便于大批量工業(yè)化生產(chǎn)。亦可采用小麥固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)，生產(chǎn)粗毒素，均能用于控制農(nóng)田主要的闊葉雜草、禾草和莎草。粗毒素的直接利用，省卻有效成分的提取和分離，簡化工藝流程，減少設備的投資，降低生產(chǎn)成本。
2)現(xiàn)有技術(shù)中鏈格孢菌產(chǎn)物除草，要在2天以上。本發(fā)明中，鏈格孢菌經(jīng)用液體培養(yǎng)的粗提液或其有效成分控制雜草，殺草速度快，能在5小時內(nèi)使雜草受害，2天左右將雜草完全殺死。這對農(nóng)田換茬時或播種前處理雜草具有很大的優(yōu)越性。其以觸殺型殺草為主，也便于在使用中利用位差選擇性。其作用方式類似于目前普遍使用的化學除草劑百草枯。但是，鏈格孢菌液體培養(yǎng)的粗提液毒性顯著低于百草枯，且活性亦更高。
3)鏈格孢菌液體培養(yǎng)的粗提液或其有效成分的活性較高，前者的有效濃度在1000ppm以下，而后者的有效濃度更低至1-25ppm。由于活性高，用量降低，對農(nóng)田環(huán)境的污染性相對降低。
4)鏈格孢菌液體培養(yǎng)的粗提液或其有效成分，直接噴施于雜草的莖上，用于莖葉處理，可以控制絕大多數(shù)主要農(nóng)田雜草，馬唐、牛筋草、光頭稗、稗草、野燕麥、看麥娘、日本看麥娘、菵草、硬草、牛毛氈、鱧腸、鐵莧菜、豬殃殃、大巢菜、稻槎菜、藜、牛繁縷、雀舌草、節(jié)節(jié)菜、鴨舌草、播娘蒿、鴨趾草、水花生、小薊、反枝莧、野莧、薺菜等闊葉雜草、禾草和莎草。因而，殺草譜特別寬，應用范圍將更加廣泛。另見表1。
表1 不同植物種類對活性成分的敏感性 (植物對粗毒素的敏感性分級標準0級，不敏感1級，稍敏感；2級，較敏感；3級，敏感；4級，很敏感；5級，極敏感)
實施例實施例1分別在澳大利亞的悉尼、Wollongong和中國的云南省等野外自然生長的紫莖澤蘭發(fā)病植株上采集分離到6個菌株，經(jīng)對501、402、503、LS、YN、AW等6個菌株菌種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天(25℃、L∶D=12∶12)，然后取直徑為6．5mm大小的菌絲塊，接種到300mlPSK液體培養(yǎng)基中(500ml三角瓶)，培養(yǎng)5-7天(25℃、L(光)∶D(暗)=12∶12、110轉(zhuǎn)／分)，至菌絲開始變黑，將培養(yǎng)液用濾紙過濾，濾液經(jīng)高速離心，取上清液用0．45μm微孔薄膜過濾，得無菌濾液。以濾液制備無菌濾液，用針刺法接種到紫莖澤蘭離體葉片上，在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)(25℃、12hL(光)／12hD(暗)、濾紙保濕)間隔一定時間后，置于解剖鏡下觀察和記錄病斑的直徑大小，最后統(tǒng)計分析確定菌株產(chǎn)毒能力的差異。對照分別采用無菌水(CK1)和無菌處理的PSK(CK2)。
試驗結(jié)果表明菌株501培養(yǎng)物無菌濾液對紫莖澤蘭的致病力最強，因而其中的致病毒素含量應是最高的，故此，該菌株的產(chǎn)毒能力明顯高于其它各菌株。從而，也說明鏈格孢菌的不同菌株間的產(chǎn)毒能力是有差異的。實施例2將501菌株接種在SCSC液體培養(yǎng)基中，于溫度為25±1℃、光照為12h／d、搖速為110rpm／min的條件下培養(yǎng)5-7天。將培養(yǎng)液用濾紙過濾，濾液經(jīng)高速離心，取上清液用0．45μm微孔薄膜過濾，得無菌濾液。
用將過濾液經(jīng)加熱濃縮20倍、10倍、5倍、2．5倍、1倍、原液、或經(jīng)稀釋1倍、2．5倍、5倍、10倍、20倍的紫莖澤蘭鏈格孢毒素濃縮液分別噴霧至三葉期的馬唐幼苗。分別在處理1天、2天、3天、7天后觀察雜草受害情況。表2 鏈格孢菌毒素不同濃度濃縮液對馬唐三葉期幼苗的防除效果 N過濾原液濃縮X過濾原液稀釋表中數(shù)據(jù)為防除百分率。
表3 不同植物種類對501菌株粗毒素的敏感性 (植物對粗毒素的敏感性分級標準病情指數(shù)(％)0-0級，不敏感；1-20-1級，稍敏感；21-40-2級，較敏感；41-60-3級，敏感；61-80-4級，很敏感；81-100-5級，極敏感)實施例3如實例2所述生產(chǎn)鏈格孢菌粗提液加入，加入助劑和0．1％滲透劑，能明顯提高鏈格孢菌粗提液除草效果。表4 不同助劑對鏈格孢菌粗提液殺草作用的影響(供試雜草為馬唐) X過濾原液稀釋表中數(shù)據(jù)為防除百分率。
權(quán)利要求
1．格孢菌的粗代謝物用于生物除草的方法，其特征在于直接利用鏈格孢菌(Alternaria alternata(Fr．)Keissler)經(jīng)PDA培養(yǎng)的菌種培養(yǎng)物小塊，采用液體培養(yǎng)或小麥固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，過濾掉活菌絲及其它活性細胞后，其粗代謝產(chǎn)物的混合物原液，經(jīng)水稀釋15倍以內(nèi)至濃縮10倍間，噴施于雜草莖葉上。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的鏈格孢菌粗代謝物用于生物除草的方法，其中液體培養(yǎng)基為玉米和黃豆粉液體培養(yǎng)基(SCSC)、馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基(PSK)、小麥粒固體培養(yǎng)基等。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鏈格孢菌粗代謝物用于生物除草的方法，其特征在于無菌濾液經(jīng)稀釋15倍以內(nèi)至濃縮10倍間，可以加入1-5％的助劑，助劑為非離子型表面活性劑、植物源助劑及滲透劑。
4．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鏈格孢菌粗代謝物用于生物除草的方法，其特征在于助劑為增效劑SD、十二烷基苯磺酸鈉、農(nóng)乳100號以及0．01-0．5％滲透劑等。
5．根據(jù)權(quán)利要求3所述的鏈格孢菌粗代謝物用于生物除草的方法，其特征在于助劑為增效劑SD、十二烷基苯磺酸鈉、農(nóng)乳100號以及0．01-0．5％滲透劑等。
全文摘要
本發(fā)明為鏈格孢菌液體培養(yǎng)的粗代謝產(chǎn)物用于控制雜草的方法,屬于微生物應用于農(nóng)業(yè)植物保護領域。直接利用其粗代謝產(chǎn)物的混合物原液,經(jīng)水稀釋15倍以內(nèi)至濃縮10倍間,噴施于雜草莖葉上,在48小時內(nèi)致雜草迅速死亡,這些雜草包括了主要的闊葉雜草、禾草和莎草,具廣譜性。所用的液體培養(yǎng)基為玉米和黃豆粉液體培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基。亦可以小麥粒固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。施藥5小時即可引起雜草明顯的受害癥狀,癥狀表現(xiàn)是使雜草萎焉,接觸藥液處形成傷害,具有顯觸殺型的特點。
文檔編號C12N1/14GK1293241SQ00112560
公開日2001年5月2日 申請日期2000年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月20日
發(fā)明者強勝, 萬佐璽, 董云發(fā), 李揚漢, 朱春林, 戴寶江 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學, 南通江山農(nóng)藥化工股份有限公司