專利名稱：水葫蘆生防真菌——鳳眼蓮鏈格孢的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雜草的生物控制及微生物領(lǐng)域，特別是涉及一種水葫蘆生防真菌——鳳眼 蓮鏈格孢"Jtaraarz'a c_ras\s7》es0 。
背景技術(shù)：
水葫蘆(&c力/w/77ia cr3sw》a9)，又名水浮蓮，原產(chǎn)于南美，是世界十大害草之一， 也是侵入我國的最重要有害物種之一，已在我國17個(gè)省、市、自治區(qū)泛濫成災(zāi)，其危害最 嚴(yán)重為浙江、福建、廣東、云南和臺(tái)灣五省，主要是引起江河湖澤水庫等水域的污染和阻 塞，阻礙水路交通運(yùn)輸和干擾水電站的正常運(yùn)行，每年造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
目前，國內(nèi)外對(duì)水葫戸主要采用人工打撈控制和化學(xué)除草劑防除，雖有一定成效，但 兩種措施的防除效果都非常有限，打撈僅能清除水葫蘆植株，留在水體中的種子仍能萌發(fā) 并很快形成新的雜草株群；而使用化學(xué)除草劑殺死雜草后，植株殘?bào)w可使水體有機(jī)化而造 成環(huán)境污染，化學(xué)制劑本身也存在著藥物殘留和非靶標(biāo)生物安全等環(huán)境污染問題。因此， 近年來人們開展了對(duì)雜草的生物控制的探索，20世紀(jì)60年代，在研究利用水葫蘆象甲等草 食性昆蟲的同時(shí)，不少國家對(duì)水葫蘆病原菌也作了大量的調(diào)査研究工作，并且已經(jīng)取得一 定的進(jìn)展全世界已經(jīng)報(bào)道了60多種侵染水葫蘆的病原真菌，在南非等國家已經(jīng)篩選到的 諾曼尼尾孢(Cercos^ora i^Qfea^'i)和zR葫聲鏈格孢C4"e/77a_r_z'a eic/ / or/n'ae)對(duì)水葫盧 具有較強(qiáng)的抑制作用，其中諾曼尼尾孢防除水葫蘆的技術(shù)已獲國際專利保護(hù)，但是這種病 原菌對(duì)雜草的控制效果及應(yīng)用范圍都相當(dāng)有限，還未見其在其他國家或地區(qū)被應(yīng)用的報(bào) 道。
我國也曾有人對(duì)水葫戸病害及病原真菌進(jìn)行調(diào)査和研究，發(fā)現(xiàn)的水葫蘆致病真菌主要 有細(xì)極鏈格孢C^er/7ari3 te/7"i5"57-鵬)、尖孢尾孢(^7sofe5"/ ori湖0^7邵arww)、阿氏擬 盤多毛孢(尸e"a〗ot/c^sis so^sta) 、 7K葫戸單孢Oo/70spo2"j'LM e/c/ 力oi77iae)禾卩瓜亡革菌 (77 a朋tep/ or^ women's)等，但這些真菌對(duì)水葫蘆的致病作用都非常有限，沒有實(shí)際 應(yīng)用價(jià)值，迄今也還沒有關(guān)于這些病菌的進(jìn)一步研究和應(yīng)用的詳細(xì)報(bào)道。
因此，尋求對(duì)水葫蘆有強(qiáng)致病性和生防控制作用的病原微生物，由此進(jìn)一步研制無殘 留、不污染環(huán)境的生物除草劑，將不僅具有重要的商業(yè)開發(fā)應(yīng)用價(jià)值，而且能安全有效地 控制水葫蘆的危害，以避免由此造成的巨大經(jīng)濟(jì)損失。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種對(duì)水葫蘆有很強(qiáng)致病作用和控制效果的殺草真菌——鳳眼 蓮鏈格孢菌株。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征將其定為一個(gè)鏈格孢新種，通過試驗(yàn)測(cè)定確定了它生長產(chǎn) 孢和侵染致病的最適條件，研究發(fā)現(xiàn)其通過產(chǎn)生毒素使雜草植株發(fā)病死亡的致病機(jī)理，分 析了病菌及其毒素的寄主專化性。
本發(fā)明目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的-
本發(fā)明的鳳眼蓮鏈格孢殺草菌株通過以下步驟分離純化而來-
在重慶地區(qū)不同季節(jié)多次采集水葫蘆自然發(fā)病植株，采用馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基 (PSA)，經(jīng)室內(nèi)組織培養(yǎng)和純化得到不同類型的真菌，用柯赫氏證病方法確定其中的致病 菌，最后經(jīng)過致病性試驗(yàn)比較篩選獲得對(duì)水葫蘆有很強(qiáng)致病作用的殺草病原真菌(AFTOOl
菌株)。
本發(fā)明的鳳眼蓮鏈格孢菌株已于2008年7月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)大屯路，郵編100101)，保藏號(hào)CGMCCN0.2569。 以下是鳳眼蓮鏈格孢的詳細(xì)描述
鳳眼蓮鏈格孢殺草菌株的形態(tài)特征與分類鑒定在PSA培養(yǎng)基上菌落生長速度很快， 在25'C下全光照與全黑暗培養(yǎng)5d菌落直徑均可達(dá)到約70mm。菌絲部分埋生，部分表生， 氣生菌絲絨毛狀，菌落初為青綠色后漸變?yōu)楹诨疑?，背面黑綠色。分生孢子鏈生， 一般7 12個(gè)孢子，倒棒狀，卵形，倒梨形或近橢圓形，淡褐色至中度褐色，孢身24.7(12.5 37.5) X10. 1(7.5 12.5) Mm，具短喙或無喙，0 30 X 2.5-4nm。成熟孢子表面具小疣 突，具l 3個(gè)橫隔，0 4個(gè)縱隔，除頂端次生產(chǎn)孢外，常見于側(cè)面的任何部位產(chǎn)生短梗。 分生孢子梗直立，直或略彎，分隔，不分枝或分枝，極淡的褐色至淡褐色，隨著產(chǎn)孢作合 軸式(syrapodial)延伸，高倍鏡下可見表面生細(xì)疣突，23.5 70. 5 X 3.5 5um。根據(jù) 這些特征，參考有關(guān)真菌及鏈格孢屬鑒定的文獻(xiàn)資料(如張?zhí)煊睿?003中國真菌志—— 鏈格孢屬，科學(xué)出版社;http:〃www.doctorfungus.org/)鑒定，該菌為鏈格孢屬中細(xì)極鏈 格孢組"7ter朋/a te/7"i'sw'腿group)的一新個(gè)成員(member)，將其命名為鳳眼蓮鏈格孢， 拉丁學(xué)名為/^ter/7ar/acrs, w'pes。這是真菌分類學(xué)上的一個(gè)新種，其依據(jù)主要有1)査 閱現(xiàn)有鐮刀菌屬的相關(guān)分類文獻(xiàn)和其他參考資料，這種鏈格孢的形態(tài)特征與其他種類有明 顯差異；這一點(diǎn)經(jīng)國際鏈格孢屬真菌分類權(quán)威專家、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)的張?zhí)煊罱淌隍?yàn)證；2) 在水葫蘆植物上迄今己經(jīng)記載的病原鏈格孢菌有2種，即交鏈孢C^ter朋r2'a Wtema") 水葫蘆鏈格孢(力Ae/77ar^ e/c力/w/77/s),它們的分生孢子等結(jié)構(gòu)的形態(tài)與該種鏈格孢區(qū)別很大，而且交鏈孢為一種弱寄生菌，其導(dǎo)致的病害癥狀非常輕微，水葫蘆鏈格孢主要引起 一種"黑斑病"，癥狀與本鏈格孢引起的"葉斑病"有根本性差別(Charudattan R ，2001. Biological control of water hyacinth by using pathogens, ACIAR Proceedings 102， 21-28; Shabana， YM et al, Biological control of water hyacinth by mycoherbicide in Egypt. ACIAR Proceedings 102' 53-56)。
鳳眼蓮鏈格孢的最佳培養(yǎng)和侵染條件該致病真菌在正常光照和黑暗條件下不容易產(chǎn) 孢，而在紫外光照射下產(chǎn)孢較快；菌落生長最適培養(yǎng)基為馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)，最適溫 度25-30。C，最適酸堿度為pH7.0 10;病菌侵染致病的最佳條件是接種后保濕和暗光24 小時(shí)，并在整個(gè)侵染期保持溫度28 30。C。
鳳眼蓮鏈格孢的致病性和?；曾P眼蓮鏈格孢對(duì)水葫蘆有良好的致病和生長抑制作 用，主要侵染植株葉片，接種后7天即可發(fā)病，病葉率達(dá)100%，初期葉片上出現(xiàn)大小不等 的圓形至不規(guī)則病斑，以后擴(kuò)展至葉柄，病斑正反兩面著生灰褐色霉層，導(dǎo)致大面積葉片 甚至整個(gè)植株枯死。在適宜條件下用高濃度菌絲片段和分生孢子懸浮液接種試驗(yàn)結(jié)果表 明，該真菌對(duì)水稻、小麥、玉米、豌豆、油菜、辣椒、番茄、棉花等重要作物在內(nèi)的6科 16種水、旱作物都不致病，也不影響它們的種子萌發(fā)和植株生長，這說明鳳眼蓮鏈格孢是 水葫蘆的專性致病菌，若用于研制水葫蘆除草劑，可以保證生境中其它植物的安全。
鳳眼蓮鏈格孢粗毒素用真菌的培養(yǎng)液，經(jīng)過乙酸乙酯萃取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器真空蒸餾得 到致病毒素。用該毒素的水液分別浸漬水葫蘆葉片和植株根系后24小時(shí)內(nèi)即表現(xiàn)毒性癥 狀，72小時(shí)內(nèi)葉片黃化、植株萎蔫(但不退綠)。用此粗毒素溶液處理前述20種植物的種 子和植株后未觀察到毒性癥狀，說明這種毒素也是高度專化的。


圖1為鳳眼蓮鏈格孢的形態(tài)特征圖
1為PSA平板上的菌落初期，2為PSA平板上的菌落后期，3為分生孢子鏈，4為分生 孢子，5為分生孢子類型圖，6為分生孢子梗
圖2為鳳眼蓮鏈格孢及其毒素對(duì)水葫蘆的致病作用圖
7為用菌體處理第15天的水葫蘆植株，8為用菌體處理第15天的水葫蘆葉片，9、 10 為用毒素處理第3天的葉片和對(duì)照，11、 12為用毒素處理第3天的植株和對(duì)照。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是從自然環(huán)境中分離獲得的鳳眼蓮鏈格孢"7te277an'a crawipes)， 是首次發(fā)現(xiàn)并鑒定的一個(gè)真菌新種，其菌絲片斷和分生孢子接種體對(duì)世界十大惡性雜草水 葫戸(^/c力/wr/n'a crssw'pes)具有很強(qiáng)的致病控制作用，它分泌的毒素對(duì)這種雜草也具有很強(qiáng)的毒性致死功效。病菌的菌劑和毒素對(duì)重要作物及環(huán)境中其它植株都沒有不良影響， 表現(xiàn)出高度的?；瘹⒉莼钚?，可通過發(fā)酵菌體或仿生合成技術(shù)生產(chǎn)無殘留的環(huán)保型真菌性 除草劑，具有潛在的商業(yè)開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值，特別是在水葫蘆的生物防治實(shí)踐中具有重要的 開發(fā)應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述 實(shí)施例1:
病原菌的分離純化與篩選
(1) 真菌分離培養(yǎng)用馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)，其配方是去皮的新鮮馬鈴薯200g， 蔗糖和瓊脂各20g，加自來水至lOOOml。先加水將馬鈴薯煮爛，雙層紗布過濾后加入蔗糖 和瓊脂，補(bǔ)充適量的水至1000ml，充分?jǐn)嚭途鶆蚝笱b入三角瓶中，放入消毒器中滅菌后放 置。使用前加熱熔融，倒入滅菌培養(yǎng)皿或試管中制成平板或斜面培養(yǎng)基，供真菌分離培養(yǎng) 或菌種保存用。
(2) 分離培養(yǎng)和純化從自然條件下采集具有典型病害癥狀的水葫蘆植株樣品，漂 洗干凈后剪取葉片病斑與健康部分交界的組織小塊兒(2 mm),放入5%次氯酸鈉溶液中表面 消毒以后用滅菌水漂洗3次，置于PSA平板中，在25"C溫箱中培養(yǎng)并每天觀察，待不同菌 落長出后適時(shí)分別割取菌絲先端，轉(zhuǎn)移到新的PSA平板上繼續(xù)培養(yǎng)成純的菌落，再轉(zhuǎn)移到 PSA試管斜面培養(yǎng)基上，并編號(hào)標(biāo)明菌株，保存?zhèn)溆谩?br> (3) 確定病原菌根據(jù)柯赫氏證病律步驟確定病原菌。用病葉組織分離純化后獲得 各種真菌給健康水葫戸植株葉片涂抹或針刺點(diǎn)滴接種，保證避光保濕24小時(shí)，在28。C下 生長，觀察發(fā)病情況。引起接種葉片發(fā)病、表現(xiàn)相同癥狀的真菌即可確定為病原菌。
(4) 強(qiáng)致病菌篩選將上述試驗(yàn)確定所有病原菌相同的方法(涂抹霧或針刺點(diǎn)滴)給 水葫盧植株接種，并在相同適宜條件下培養(yǎng)觀察接種植株上病害的嚴(yán)重程度，比較篩選出 引起水葫蘆發(fā)病嚴(yán)重的菌株，由此篩選獲得了鳳眼蓮鏈格孢。
實(shí)施例2:
病原菌的培養(yǎng)和接種條件試驗(yàn) (2)溫度試驗(yàn)在培養(yǎng)5d的PDA平板上用打孔器取直徑為0. 5cm的AFT001菌株的 菌絲塊，接種于PDA培養(yǎng)基上，分別設(shè)5°C 、 10°C 、 15°C 、 20°C 、 25°C 、 30°C 、 35°C和40±0. 5°C 8個(gè)溫度處理，每個(gè)處理重復(fù)3次。置于8個(gè)預(yù)先設(shè)定好所需溫度的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 并用垂直十字法逐日測(cè)量菌落大小，每24h測(cè)量l次，連續(xù)測(cè)量5次，記錄數(shù)據(jù)。PDA培養(yǎng)基的酸堿度約為pH7. 0。由此確定鏈格孢菌的最適生長溫度。
(2) 酸堿度實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)采用PDA培養(yǎng)基，共設(shè)置11個(gè)酸堿度處理。分別用1. 0 mol/L 的Na0H和HCl溶液將培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)節(jié)到4.0、 5.0、 6.0、 6.5、 7.0、 7.5、 8.0、 9.0、 10.0、 11.0和12.0 (用電子pH計(jì)測(cè)定)，每個(gè)處理重復(fù)5次；病菌接種和生長測(cè)量 方法同上，接菌處理后置于25'C下培養(yǎng)，每24h測(cè)量一次菌落直徑，連續(xù)測(cè)量6次。由此 確定鏈格孢生長的最佳pH值。
(3) 培養(yǎng)基種類的篩選實(shí)驗(yàn)共比較了 8種培養(yǎng)基對(duì)AFT001菌麥生長的影響，分別 為WA、 CAA、 PSA、 PDA、水葫戸葉片煎汁培養(yǎng)基(WLA)、燕麥片培養(yǎng)基(OSA)、 WLA+PDA和 WLA+PSA。病菌接種和生長測(cè)量方法同前述實(shí)例。各種培養(yǎng)基的酸堿度約為pH7. 0，培養(yǎng)溫 度為25'C。由此確定病菌培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基。
(4) 光照對(duì)產(chǎn)孢量的影響試驗(yàn)將長勢(shì)良好的AFT001菌株接種于PCA(馬鈴薯20g， 胡蘿卜20g，瓊脂20g)培養(yǎng)基上，在近紫外燈(NUV)、日光燈(DL)和黑暗條件下培養(yǎng)20d， 每個(gè)處理重復(fù)3次。收集孢子計(jì)數(shù)，方法如下在培養(yǎng)基上加入lml的無菌水，用蓋玻片 輕刮培養(yǎng)基表面。然后將孢子懸液用100目的網(wǎng)篩過濾，取濾得的孢子液鏡檢，用血球計(jì) 數(shù)板計(jì)數(shù)。比較不同光照培養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)孢的影響，確定有利于病菌產(chǎn)孢的光源。
(5) 病菌接種條件優(yōu)化 一般影響植物病原真菌侵染的影子主要有溫度、保濕時(shí)間 和光照。本發(fā)明中根據(jù)前述鳳眼蓮鏈格孢的最佳生長條件設(shè)置了位于20 30'C間的5個(gè)溫 度，保濕(％)時(shí)間0、 12、 24、 32和48h，光照設(shè)置為1200Lux， 3000Lux下照射0、 6、 12、 18和24h。每個(gè)溫度處理3株水葫戸，每株5-6個(gè)葉片。由此分析確定病菌的適宜接種發(fā) 病條件(溫度、保濕時(shí)間和光照)。
實(shí)施例3: 病原菌粗毒素分離
(1) 病菌培養(yǎng)濾液的準(zhǔn)備在500ml三角瓶中分別倒入250ml馬鈴薯蔗糖(PS)培養(yǎng) 液，滅菌后待用。選取培養(yǎng)6 7d長勢(shì)良好的菌落，用打孔器取0)6mra大小的菌餅，接種 到裝有250mlPS培養(yǎng)液的三角瓶中，每瓶接種8片，在25"C培養(yǎng)箱中12h光照/天條件下 靜止培養(yǎng)20天。在超凈工作臺(tái)上，用定性濾紙(中速)過濾，即可得到培養(yǎng)濾液。由此準(zhǔn) 備足夠的病菌培養(yǎng)濾液供毒素分離提取之用。
(2) 毒素的萃取及活性試驗(yàn)選擇極性不同的有機(jī)溶劑石油醚、氯仿、苯酚和乙酸 乙酯等分別對(duì)培養(yǎng)濾液進(jìn)行萃取，方法是將一定體積的培養(yǎng)濾液用等體積的有機(jī)溶劑萃 取3次，然后合并有機(jī)相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮，回收有機(jī)溶劑。將每種有機(jī)溶劑萃取
7的濃縮物用水溶解后用作對(duì)水葫蘆葉片浸漬處理，測(cè)定其活性。結(jié)果用乙酸乙酯萃取后的濃縮產(chǎn)物溶液對(duì)水葫蘆表現(xiàn)出很強(qiáng)的毒性。實(shí)施例4:
病原菌及其毒素的安全(專化)性測(cè)定
(1) 供測(cè)試的作物選擇了6個(gè)科的20種重要水旱作物，包括禾本科的水稻、小麥、玉米，茄科的番茄、辣椒和煙草，葫蘆科的黃瓜和西瓜，十字花科的蘿卜、甘藍(lán)、油菜和白菜，豆科的花生、豌豆、蠶豆、大豆和綠豆，以及錦葵科的棉花。
(2) 種子萌發(fā)試驗(yàn)選擇前述20種作物的健康種子，分別用菌絲和孢子懸浮液、病
菌粗毒素溶液和清水(對(duì)照)浸泡12 36小時(shí)(小粒種子處理時(shí)間短，大粒種子處理時(shí)間長)，放置在濕濾紙上，在25°C生長箱中萌發(fā)后記載種子萌發(fā)率。結(jié)果表明所測(cè)試的作物種子萌發(fā)率與對(duì)照都沒有顯著差異。
(3)作物植株生長試驗(yàn)用溫水浸泡12 36h (根據(jù)種子大小而定)，放置在濕濾紙上，在25"C生長箱中催芽。待胚芽露出后播種到盆栽缽中。缽內(nèi)加入經(jīng)過水洗和高溫烘干的沙土，然后加入一定量營養(yǎng)液(水中加入適量的尿素、硫酸銨和磷酸鉀)。播種后在溫室條件下生長，待植株長到適當(dāng)大小時(shí)分別用菌絲和孢子懸浮液、病菌粗毒素溶液和清水(對(duì)照)噴霧處理，同時(shí)以處理水葫蘆植株為發(fā)病對(duì)照。處理后每天觀察記錄各種植物的病變情況，到第20天時(shí)收獲植株，測(cè)定不同處理的生長量。結(jié)果表明，用鏈格孢菌液和毒素液處理后水葫蘆植株分別在處理后第7天和第2天即表現(xiàn)出明顯的病害和毒素癥狀，而所有20種作物植株在處理20天后也沒有任何病變，用菌液和毒素液處理后的植株生長量與清水對(duì)照植株的生長量之間沒有顯著差異。這說明病菌及其毒素對(duì)供試作物沒有任何不良影響。
權(quán)利要求
1、一種水葫蘆生防真菌——鳳眼蓮鏈格孢(Alternaria crassipes)，其特征在于菌株為AFT001，該菌株的保藏號(hào)為CGMCC NO.2569。
全文摘要
一種水葫蘆生防真菌——鳳眼蓮鏈格孢(Alternaria crassipes)，從自然環(huán)境中分離獲得，該菌在紫外光照射下易于產(chǎn)孢，菌落生長最適培養(yǎng)基為馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)，最適溫度25～30℃，最適pH7.0～10；病菌侵染致病的最適條件是接種后暗光保濕24h和侵染期間保持28～30℃。其菌體制劑和毒素液對(duì)惡性雜草水葫蘆具有很強(qiáng)的致病殺草作用，經(jīng)發(fā)酵菌體或毒素仿生合成技術(shù)可生產(chǎn)環(huán)保型真菌除草劑，具有潛在的商業(yè)開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。用真菌培養(yǎng)液經(jīng)乙酸乙酯萃取、減壓蒸發(fā)得到致病粗毒素。該菌菌體懸浮液及其毒素液對(duì)水稻等20種重要作物都沒有不良影響。
文檔編號(hào)C12N1/14GK101508959SQ200810237208
公開日2009年8月19日 申請(qǐng)日期2008年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月23日
發(fā)明者君 周, 唐秀麗, 孫現(xiàn)超, 殷利利, 王利軍, 羅化東, 譚萬忠 申請(qǐng)人:西南大學(xué)