專利名稱：重組新型溶栓酶的制作方法
以基因重組技術(shù)為核心的現(xiàn)代生物工程技術(shù)是當(dāng)今最活躍和發(fā)展迅速的高新技術(shù)之一。應(yīng)用基因重組技術(shù)開發(fā)新型醫(yī)療藥物已展現(xiàn)出巨大的生命力，并成為推動制藥工業(yè)發(fā)展的新興力量。重組新型溶栓酶NTA(new thrombolytic agent)是一個通過重組人體基因工藝所產(chǎn)生的具有溶解血栓功能的酶蛋白。圍繞NTA所述的技術(shù)領(lǐng)域包括基因的體外重組和克隆，針對NTA基因特征的表達(dá)技術(shù)與載體的構(gòu)建，以及酶活性的化學(xué)分析。
纖維蛋白的固體化聚合所形成的凝血現(xiàn)象是人體對損傷組織修復(fù)的一個正常功能。當(dāng)聚合的纖維蛋白完成其使命后，就會被血漿酶，一個分子量約為92000的蛋白水解酶所分解而可溶化(1)。血漿酶通常是以無活性的蛋白溶酶原的形式高量(約192mg/ml)儲存于血液中。在蛋白溶酶原激活酶的存在下，蛋白溶酶原可成為有活性的血漿酶。血液中的蛋白溶酶原激活酶由多種細(xì)胞產(chǎn)生，例如血管內(nèi)皮細(xì)胞可直接分泌此種蛋白進(jìn)入血流。蛋白溶酶原激活酶存在量的大小影響并決定凝血與溶栓的平衡，包括心肌梗塞及腦栓塞病態(tài)血塊的形成與分解。目前臨床用溶栓酶總體上皆屬于蛋白溶酶原激活酶類，如尿激酶，tPA，鏈激酶及葡激酶等，這些酶都不直接溶解血栓，而是激活并啟動人體自身溶栓系統(tǒng)。
臨床用溶栓酶的來源不同。尿激酶和tPA是人體本身的基因產(chǎn)物。TSV-PA來源于蛇毒。鏈激酶和葡激酶來源于細(xì)菌類。其作用機(jī)理也不盡相同。尿激酶和tPA是通過切斷蛋白溶酶原的第Arg560-Va1561鍵改變其立體構(gòu)造使其成為有活性的血漿酶。而葡激酶則是通過和蛋白溶酶原分子結(jié)合使其分子變形并暴露活性位點(diǎn)成為具有活性的血漿酶。在這些溶栓酶中，tPA和葡激酶的作用機(jī)理雖然相同，但是在激活蛋白溶酶原使其成為活性的血漿酶的過程中，血栓的存在可催化其反應(yīng)速度。這種特性使tPA和葡激酶具有血栓特異性，從而優(yōu)于其它溶栓酶。但因葡激酶源為細(xì)菌蛋白并引起人體的顯著免役反應(yīng)，故而作為人體本身基因產(chǎn)物并具有血栓特異性反應(yīng)的tPA是最被普遍認(rèn)為的優(yōu)秀溶栓酶。臨床證明70％以上的心肌梗塞患者，其栓塞可被tPA開通(2，3)。
盡管tPA是優(yōu)秀的溶栓酶，但仍存在許多缺陷(4，5)。tPA的半衰期極短，藥效發(fā)揮時間有限。臨床上不得不采用高劑量，多次使用及點(diǎn)滴操作。并且tPA的部分活性還被蛋白溶酶原激活酶抑制素PAI-1所抵銷。另外，tPA的大量化生產(chǎn)極其不易(6)。開發(fā)和研制具備有tPA優(yōu)點(diǎn)的溶栓酶的同時，從分子克隆和生產(chǎn)工藝上全部或部分克服上述缺陷是重組新型溶栓酶NTA的技術(shù)目的。
NTA的分子克隆和表達(dá)質(zhì)粒的組建策略如圖1所示。NTA的DNA分子源于人胎兒大腦。大腦mRNA通過逆轉(zhuǎn)酶反應(yīng)生成cDNA并被插入λgt11載體(7)。提純的cDNA片斷經(jīng)過附加克隆位點(diǎn)及修飾后被克隆于T7啟動子和lac調(diào)控之下在大腸桿菌中表達(dá)生成。表達(dá)載體同時攜帶有DnaY基因以利于高含量的argAGG/AGA哺乳類基因如NTA在大腸宿主細(xì)胞株中表達(dá)。
首先使用含大腦cDNA的λgt11食菌體，濃度約108pfu/ml，感染大腸菌Y1090r-細(xì)胞株。食菌體稀釋液組成為45mM Tits(pH7.1)，100mMNaCl和0.01％明膠。在不同稀釋梯度的溶液中加入大腸菌Y1090r-，最終吸光度為0．3至0.4(600nm)。加入的大腸菌事先在含有0.2％麥芽糖和10mM MgSO4的LB中過夜培養(yǎng)。感染后的細(xì)胞液和十倍體積的含0.7％10mM MgSO4的LB中過夜培養(yǎng)。感染后的細(xì)胞液和十倍體積的含0.7％瓊脂的LB(49℃)混合，在培養(yǎng)皿中形成食菌透明點(diǎn)。大約57000個食菌透明點(diǎn)被轉(zhuǎn)移吸附到硝基纖維薄膜上。然后，負(fù)載食菌體的纖維薄膜被浸泡于含0.5M NaOH和1M NaCl的溶液中2分鐘，0.8M磷酸緩沖液(pH6.7)中2分鐘，10×SSC(140mM檸檬酸鈉，1．5M NaCl，pH7.0)中1分鐘。用短波UV烤箱照射5分鐘后進(jìn)行雜交(68℃，15小時)。雜交溶液的組成為5×SSC，1×Denharts溶液(7)，0.7×106cpm/ml32P標(biāo)記的探針，0.1％SDS和90μg/ml鮭魚DNA。探針由蛋白溶酶原激活酶3個活性中心的DNA序列混合組成；gg(c/g)gattc(c/g)ggaggc，gacaatga(c/t)attgcg和gccgccca(c/t)tgcttc，分別對應(yīng)氨基酸序列G-D-S*-G-G，D-N-D*-I-A和A-A-H*-C-F(*號表示活性中心)。
陽性食菌體被用于重新感染10ml大腸菌Y1090r。培養(yǎng)液被逐步擴(kuò)大體積，約得250ml至300ml的食菌體消化液。經(jīng)被50μg／ml RNase A和10U/ml DNaseI消化2小時(37℃)后，食菌體被4.5M NaCl和12.5％PEG8000沉淀回收(15000xg 30分鐘)。用石碳酸/三氯甲烷分離并被乙醇沉淀提取食菌體DNA進(jìn)行序列測定。
使用PCR方法對基因cDNA兩端附加克隆位點(diǎn)?；虻纳隙烁郊用盖形稽c(diǎn)NdeI(catatg)，末端為BamHI(ggatcc)。PCR反應(yīng)溶液(0.1ml)包含20mM Tris(pH8.8)，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.2mM dNTP，100ng食菌體DNA和各200ng的兩端引物P1和P5。引物的序列分別為catatggcctcttgcagagatgaaaaaacgcag和ggatcctcacggtcgcatgttgtcacgaatc(P1和P5的位置參考圖2)。PCR溶液溫度升高至94℃時每0.1ml反應(yīng)液中加入5UPfu開始反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)?4℃1分鐘，50℃1分鐘，68℃3分鐘，15次重復(fù)。所得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)提純后被磷化(7)，然后克隆插入載體pNoTA/T7之中，形成質(zhì)粒pNoTA-bhPA。
同樣采用PCR進(jìn)一步修飾基因。使用兩個背靠背并且反方向的引物可在基因的任選位置進(jìn)行簡化修飾。反應(yīng)1溶液包含50mM Tris(pH8.5)，25mM KCl，1.5mM MgSO4，0.2mM dNTP，50ng pNoTA-bhPA質(zhì)粒和各100ng的引物，體積0.1ml。引物P2的序列為ggccatatgtatatctcc，P3和P4分別為agagcactgtgccctgcc，gagggaaacagtgactgc。其在基因中的位置如圖2所示。所有引物皆在PCR前被磷化。PCR反應(yīng)程序?yàn)樽冃?94℃)1分鐘，退火(39℃)1分鐘，合成(68℃)9分鐘。加入5UPfu后反應(yīng)重復(fù)20次。由P3和P4引物反應(yīng)所生成的PCR產(chǎn)物經(jīng)自我結(jié)合后被轉(zhuǎn)入大腸菌TG1中增殖。經(jīng)提純得到質(zhì)粒pNoTA-rhNTA。此質(zhì)粒被NdeI和BamHI酶切后，游離出含有NdeI和BamHI粘性末端的rhNTA片斷。該cDNA片斷被直接克隆插入下述的表達(dá)質(zhì)粒pDnaY/T7。
表達(dá)質(zhì)粒pDnaY/T7由常規(guī)的T7表達(dá)質(zhì)粒pETlla和含有DnaY基因的pDC952質(zhì)粒組合而建。DnaY基因產(chǎn)生tRNAargAGG/AGA。此tRNA在大腸菌含量極低。裝載有此tRNA基因的表達(dá)質(zhì)粒有利于高含量的argAGG/AGA哺乳類基因在大腸宿主細(xì)胞中表達(dá)。首先從pDC952質(zhì)粒中克隆DnaY基因。DnaY基因片斷被引物cgctataagcttgtactttgatacatgaaaatac和cgctataagcttgtacataccaaggcggc擴(kuò)幅。此兩引物各有HindIII酶切位點(diǎn)。所得PCR片斷經(jīng)HindIII酶切后和同樣被HindIII酶切的pETlla質(zhì)粒結(jié)合生成含DnaY基因的表達(dá)質(zhì)粒pDnaY/T7。該表達(dá)質(zhì)粒被NdeI和BamHI酶切后與上述含有NdeI和BamHI色粘性末端的rhNTA片斷結(jié)合生成質(zhì)粒prhNTA。圖2展示質(zhì)粒prhNTA的DNA序列及構(gòu)造。對應(yīng)于第3至42個氨基酸被修飾精簡的質(zhì)粒為pNTA。
這里展示的是修飾精簡型NTA。質(zhì)粒pNTA被轉(zhuǎn)入大腸菌BL21(DE3)并在LB平板上形成氨比西林抗性的菌落體。取單個菌落體在LB培養(yǎng)液中增殖至吸光度0.4-0.5(600nm)后，加入IPTG(終濃度1mM)，誘導(dǎo)4小時。誘導(dǎo)前后的細(xì)胞總蛋白如圖3的SDS-PAGE電泳圖所示。激光掃描顯示NTA的表達(dá)量為35％以上，從而實(shí)現(xiàn)了NTA蛋白質(zhì)的高產(chǎn)。試驗(yàn)并顯示同樣的載體在不合DnaY基因的情況下幾乎觀察不到誘導(dǎo)前后之差別。該結(jié)果充分表明這一首創(chuàng)的同時擁有推動mRNA及蛋白生產(chǎn)的表達(dá)質(zhì)粒之實(shí)用性。
表達(dá)的NTA蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)形成包涵體。破碎整體細(xì)胞提取包涵體可使用常規(guī)的超音波，壓力(French Press Cells 15000psi)或者B-PER溶液(PIERCE)。使用尿素和還原劑在室度(23℃)反應(yīng)3小時裂解包涵體。裂解溶液組成為0.1M Tris(pH8.5)，0.14MmM 2-mercaptoethanol，8M尿素，1mMEDTA以及0.1％吐溫-20。包涵體在裂解溶液中的濃度為10mg/ml。溶解后的包涵體隨之被加入含有還原及氧化劑的復(fù)性溶液中進(jìn)行活性化反應(yīng)。復(fù)性溶液的組成為0.1M Tris(pH9.0)，0.19mMGSH(還原型glutathionine)，0.9mM GSSG(氧化型glutathione)，0.1％吐溫-20和0.5M精氨酸。影響NTA復(fù)性效率的重要因素分別為蛋白濃度，精氨酸和pH值。NTA含有16個半胱氨酸，高達(dá)總蛋白的6.5％。高濃度的蛋白質(zhì)在復(fù)性過程中易產(chǎn)生聚合反應(yīng)。通過向上述復(fù)性溶液中加入不同濃度的蛋白質(zhì)得到NTA的最佳濃度為30-35mg/l。在反應(yīng)溫度為23℃時的最佳反應(yīng)時間為20-48小時。精氨酸的最佳濃度為0.5-0.75M。在復(fù)性過程中發(fā)現(xiàn)pH值對NTA的復(fù)性效率極其重要。其最佳值為pH9.0。在生理pH時，NTA蛋白反而不被激活，基本上無復(fù)性現(xiàn)象。NTA的復(fù)性效率和氫離子濃度成直線反比關(guān)系(圖4-上)。
復(fù)性后的NTA蛋白質(zhì)溶液被超濾濃縮(10kDa超濾膜)后，加入含有0.1％Triton X-100的0.1M醋酸鈉緩沖液(pH4.2)。加入的過程中用5M鹽酸控制pH于4.2-4.5極為重要。然后復(fù)性的NTA蛋白質(zhì)被強(qiáng)性陽離子交換樹脂(SP-Sephadex)純化。交換樹脂吸附NTA后，首先用高濃度的鹽溶液(1M NaCl，0.1M酸鈉緩，pH4.2)沖洗。之后使用低濃度鹽溶液(10mM NaCl，0.1M酸鈉緩，pH4.2)。從交換樹脂上解離NTA蛋白質(zhì)，使用精氨酸并提高pH值(10mMTris，0.5M精氨酸，pH7.4)。純化后的NTA蛋白質(zhì)的還原性電泳如圖3所示。氨基酸成分分析顯示該蛋白質(zhì)和基因序列的計(jì)算值相符，表明所表達(dá)和純化的蛋白質(zhì)為正確的基因產(chǎn)物(圖5)。以上結(jié)果并顯示高效率的表達(dá)使NTA較其它溶栓酶易被提取純化。
蛋白溶酶原激活酶活性的測量使用多肽底物Val-Leu-Lys-pNA。該底物通常無色，在血漿酶的作用下呈黃色(波峰405nm)。NTA蛋白質(zhì)的活性可通過激活蛋白溶酶原生成血漿酶的程度以比色的形式量化。反應(yīng)溶液的組成為100mM Tris(pH7.5)，0.09％吐溫-20，10μg/ml蛋白溶酶原(Glu-plasminogen)和0.25mg／ml Val-Leu-Lys-pNA。反應(yīng)溶液溫度為37℃。加入NTA后，用405nm波段記錄顏色的變化。
在血栓的存在下，是否加速NTA激活蛋白溶酶原成為活性的血漿酶的反應(yīng)速度是衡量NTA酶活性特征的重要指標(biāo)。CNBr分解的纖維蛋白含有FCB-2和FCB-5片斷。FCB-2和FCB-5是存在于血栓表面的具有刺激和加速溶栓活動的主要有效成分(8)。在上述的酶活性分析溶液中添加CNBr分解的纖維蛋白50μg／ml，然后加入純化的NTA蛋白1μg/ml產(chǎn)生的吸光度隨時間之變化如圖4-下所示。在CNBr分解的纖維蛋白的存在下，NTA的活性得到顯著提高。此表明NTA的酶活性有明顯的血栓特異性。
溶栓酶在血液中的壽命長短直接影響該藥劑有效劑量的確定。使用白兔比較并測量NTA和tPA在血漿中的半衰期作為壽命長短的標(biāo)志。靜脈注射NTA和tPA后，在不同時間內(nèi)采集血漿，分析NTA和tPA的抗原變化(圖6-上)得出NTA的半衰期(抗原減半時間)為15至23分鐘。而tPA只有3.5分鐘。
NTA作為大腦來源的蛋白溶酶原激活酶在基因庫GenBank的登記號碼為AF260825。4.參考文獻(xiàn)(1) Chandler W.The effects of cardiopulmonary bypass on fibrin formation and lysisis a normal fibrinolytic response essential Journal of Cardiovascular Pharmacology1996；27S63-68．(2) Topol EJ，Bates ER，Waltson JA，Baumann G，Wolfe S，Maino J，Bayer L，GormanL，Kline EM，ONeill WW.Community hospital administration of intravenoustissue plasminogen activator in acute myocardial infarctionimproved timing，thrombolytic efficacy and ventricular function.Journal of American CollegeCardiology 1987；101173-1177.(3) Verstraete M，Bernard R，Bory M，Brower RW，Collen D，de Bono DP，Erbel R，Huhmann W，Lennane RJ，Lubsen J.Randomized trial of intravenous recombinanttissue-type plasminogen activator versus intravenous streptokinase in acutemyocardial infarction.Lancet 1985；1842-847.(4) Johns JA，Gold HK，Leinback RC.Prevention of coronary artery reocclusion andreduction in late coronary artery stenosis after thrombolytic therapy in patients withacute myocardial infarction.A randomized study of maintenance infusion ofrecombinant human tissue-type plasminogen activator.Circulation 1988；78545-546.(5) Thomson PL，Aylward P，F(xiàn)ederman J.Coronary thrombolysis and myocardialsalvage by tissue plasminogen activator given up to 4 hours aifer onset ofmyocardial infarction.Lacent 1988；1203-207.(6) Harakas NK，Schaumann JP，Connolly DT，Wittwer AJ，Olander JV，F(xiàn)eder J.
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圖1.rhNTA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建由pETlla和pDC592合成的pDnaY/T7質(zhì)粒攜帶精氨酸t(yī)RNA基因，以輔助真核細(xì)胞基因在大腸桿菌中表達(dá)。重組新型溶栓酶rhNTA來源于人類胎兒大腦。rhNTA的cDNA被克隆插入pDnaY/T7，生成蛋白的表達(dá)質(zhì)粒prhNTA。圖示整體克隆路線概要。圖2.prhNTA質(zhì)粒的DNA序列及組成prhNTA質(zhì)粒含7467bp。劃線部分分別表示啟動子，調(diào)控區(qū)，精氨酸的tRNA及構(gòu)造基因的始末。箭頭表示引物的開始位置。rhNTA基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)序列由氨基酸單字母表示。第3至42個氨基酸被修飾精簡的質(zhì)粒為pNTA。圖3.NTA蛋白質(zhì)的表達(dá)左列為未誘導(dǎo)的細(xì)胞總蛋白(25μg)。中列為IPTG誘導(dǎo)4小時后的細(xì)胞總蛋白(30μg)。右列為提純后的NTA蛋白質(zhì)(7μg)。圖示為Coomassieblue R-250染色的還原型SDS-PAGE(15％)電泳圖。圖4.復(fù)性蛋白質(zhì)的酶特點(diǎn)上圖pH對復(fù)性的影響。不同pH值的復(fù)性效率和最佳pH9.0時的活性比較。圖中之圖顯示復(fù)性效率與氫離子濃度的直線關(guān)系。下圖NTA蛋白質(zhì)的血栓特異性反應(yīng)。“添加血栓纖維”表示NTA在CNBr分解的血漿纖維存在下的反應(yīng)。圖5.NTA蛋白質(zhì)的氨基酸組成成分理論值和測量值的比較。氨基酸由三字母簡寫表示。N/A表示該氨基酸在分析時無數(shù)值顯示。圖6.NTA和tPA的藥代比較使用白兔測量NTA和tPA在血漿中的半衰期。靜脈注射NTA和tPA(0.7mg/kg體重)，在不同時間內(nèi)分析血漿中NTA和tPA的抗原含量。所示為3個試驗(yàn)組的平均值。
權(quán)利要求
1．具有溶解血栓功能的重組新型溶栓酶包含395個氨基酸，并且包括第161至167氨基酸的置換分子。
2．醫(yī)藥制品包含第1項(xiàng)所言及之分子成分。
3．核酸分子可譯成第1項(xiàng)所要求之蛋白成分。
4．表達(dá)質(zhì)粒含有第3項(xiàng)所述核酸。(A)提取，分離或合成第3項(xiàng)所述核酸。(B)把第3項(xiàng)所述核酸分子插入表達(dá)質(zhì)粒。
5．細(xì)胞含有第3項(xiàng)所要求之核酸序列。
6．生產(chǎn)制造第1項(xiàng)所述之蛋白質(zhì)序列，包括(A)培養(yǎng)含有第3項(xiàng)所述核酸的細(xì)胞。(B)分離，純化第1項(xiàng)所述蛋白質(zhì)分子。
7．第1項(xiàng)所述蛋白N末端的39個氨基酸即第3至42氨基酸被精簡修飾形成的NTA分子。
8．醫(yī)藥制品包含第7項(xiàng)所言及之成分。
9．核酸分子可譯成第7項(xiàng)所要求之蛋白序列。
10．表達(dá)質(zhì)粒含有第8項(xiàng)所述核酸。(A)提取，分離或合成第8項(xiàng)所述核酸。(B)把第8項(xiàng)所述核酸分子插入表達(dá)質(zhì)粒。
11．細(xì)胞含有第8項(xiàng)所要求之核酸序列。
12．生產(chǎn)制造第8項(xiàng)所述之核酸序列，包括(A)培養(yǎng)含有第8項(xiàng)所述核酸的細(xì)胞。(B)分離，純化第7項(xiàng)所述蛋白質(zhì)分子。
全文摘要
使用溶栓酶已成為治療心肌梗塞和腦血栓疾病的標(biāo)準(zhǔn)療法。NTA來源于人類大腦,是經(jīng)重組基因克隆所獲得的新型溶栓酶。該分子由大腸桿菌生產(chǎn)。NTA基因克隆于T7啟動于和lac調(diào)控下表達(dá)。在dnaY的輔助下,NTA表達(dá)量為細(xì)胞總蛋白的35%以上。NTA具有組織型纖溶酶原激活劑tPA的優(yōu)點(diǎn),如血栓特異性的同時,在藥理藥代上優(yōu)于tPA。NTA的半衰期為15至23分鐘,而tPA只有3.5分鐘。
文檔編號C12N15/57GK1287174SQ00112980
公開日2001年3月14日 申請日期2000年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月2日
發(fā)明者竇德獻(xiàn) 申請人:竇德獻(xiàn)