專利名稱：：HBVcccDNA核酸定量檢測(cè)試劑盒及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及核酸檢測(cè)試劑盒，具體涉及熒光PCR法HBVcccDNA核酸定量檢測(cè)試劑盒及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：HBVcccDNA(共價(jià)閉合環(huán)狀乙型肝炎病毒)是乙型肝炎病毒在人的肝細(xì)胞核中存在的形式。當(dāng)乙型肝炎病毒(HBV)進(jìn)入人體后，隨血液循環(huán)進(jìn)入肝臟侵入肝細(xì)胞。病毒進(jìn)入肝細(xì)胞后，其蛋白成分留在細(xì)胞外，其DNA直接進(jìn)入人的肝細(xì)胞核，通過(guò)人體的RNA聚合酶II將其負(fù)鏈的缺口修補(bǔ)成為完整的環(huán)，然后折疊成超螺旋結(jié)構(gòu)，就成為共價(jià)(covalence)、閉合(close)、環(huán)狀(cycle)的DNA，取三個(gè)英文字頭，即為cccDNA。cccDNA又是制造乙型肝炎病毒的模板，而且又長(zhǎng)時(shí)間躲在肝細(xì)胞核內(nèi)，不容易清除，所以有的帶毒者即使是血清內(nèi)的HBVDNA已經(jīng)消失，但其肝細(xì)胞核內(nèi)尚有cccDNA存在，它就會(huì)繼續(xù)制造HBVDNA和乙肝病毒抗原，裝配成乙肝病毒(HBV)入血，使乙型肝炎帶毒者血清內(nèi)又現(xiàn)HBVDNA及各種抗原陽(yáng)性。所以它是使得乙型肝炎帶毒者長(zhǎng)期攜帶病毒，而不能輕易治愈的罪魁禍?zhǔn)?。也就是說(shuō)，朋VcccDM實(shí)際是乙型肝炎病毒攜帶者的一個(gè)看不見(jiàn)打不著的最隱蔽的敵人。因此檢測(cè)HBVcccDNA對(duì)乙型肝炎的治療有著重大意義。過(guò)去報(bào)道檢測(cè)HBVcccDNA的方法并不適合臨床檢測(cè)使用，因?yàn)檫@些方法需要涉及凝膠電泳、核酸轉(zhuǎn)膜、同位素探針雜交、多次洗滌、同位素成像等程序。操作人員很難掌握每一個(gè)技術(shù)環(huán)節(jié)和操作細(xì)節(jié)，實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性也不好，而且費(fèi)時(shí)。經(jīng)典方法Southernblot的定量范圍和靈敏度也非常有限。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)使基因擴(kuò)增、分子雜交和光化學(xué)融為一體。PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物分析的全過(guò)程均在單管封閉條件下進(jìn)行，并通過(guò)微機(jī)控制，實(shí)現(xiàn)了對(duì)PC財(cái)廣增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)和結(jié)果自動(dòng)分析。Taqman熒光PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上添加了一條熒光雙標(biāo)記的探針，一個(gè)標(biāo)記在探針的5'端，稱為熒光報(bào)告基因(R)，另一個(gè)標(biāo)記在探針的3'端，稱為熒光淬滅基因(Q)，兩者可構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)，即5'端熒光基因所發(fā)出的熒光可被另一熒光基因吸收或者抑制。探針的3'端羥基(-OH)已被去除或者封閉，不具有延伸能力。探針在無(wú)特異性PCR發(fā)生時(shí)，熒光信號(hào)不改變。當(dāng)有特異性PCR擴(kuò)增發(fā)生時(shí)，探針會(huì)在PCR過(guò)程中被Taq酶的5'—3'外切酶活性作用而切斷，抑制作用消失，從而引起報(bào)告基因熒光信號(hào)增長(zhǎng)。隨著PCR的過(guò)程的進(jìn)行，熒光信號(hào)伴PCR產(chǎn)物的增長(zhǎng)而增長(zhǎng)。熒光PCR就是利用此原理，在PCR反應(yīng)前后，分析檢測(cè)反應(yīng)中特定熒光信號(hào)的變化，得到信號(hào)增強(qiáng)值，再利用試驗(yàn)確定的信號(hào)增強(qiáng)闡值，即可以判別樣品的陰陽(yáng)性。熒光檢測(cè)所獲得Ct值(cyclethreshold)與擴(kuò)增前樣品中模板數(shù)對(duì)數(shù)值成線形負(fù)相關(guān)。據(jù)此建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以定量分析樣品中目的基因數(shù)量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法雖然非常靈敏，而且操作簡(jiǎn)便，但是關(guān)鍵點(diǎn)在于，必須把HBVcccDNA和其他非cccDNA形態(tài)區(qū)分開，否則失去特異性檢測(cè)朋VcccDNA的價(jià)值，但現(xiàn)有技術(shù)中尚缺乏這樣的設(shè)計(jì)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)共價(jià)閉合環(huán)狀乙型肝炎病毒(HBVcccDNA)核酸定量檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)及其制備方法與應(yīng)用，解決了現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)HBVcccDNA難的難題，為臨床診斷病人提供依據(jù)。本發(fā)明的檢測(cè)原理朋VcccDNA與Dane顆粒中DNA以及病毒其他復(fù)制中間體核酸形式是有區(qū)別的，根本區(qū)在于朋VcccDNA是完整的DNA雙鏈，而HBV非cccDNA核酸形態(tài)在DR1和DR2區(qū)域附近存在缺口。利用該區(qū)別點(diǎn)，建立一種選擇性檢測(cè)朋VcccDNA的方法。本發(fā)明利用非cccDNA在DR1和DR2區(qū)域存在的一個(gè)斷端的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)一條由兩種無(wú)同源性序列組成的引物，引物3'端與朋V核酸斷端前的部分序列互補(bǔ)配對(duì)，做單鏈延伸反應(yīng)，生成一條5'端帶有無(wú)關(guān)序列的朋V單鏈，再以此無(wú)關(guān)序列作為下一個(gè)PCR反應(yīng)的引物，以保證后面PCR擴(kuò)增的模板僅來(lái)源與5'端帶有無(wú)關(guān)序列的HBV單鏈。由于非cccDNA在DR1和DR2處有斷端，所以單鏈無(wú)法有效延伸，致使后面PCR中，HBV特異性引物無(wú)法與新單鏈結(jié)合，也就不能形成PCR過(guò)程中指數(shù)擴(kuò)增。這樣就有效區(qū)分了HBVcccDNA和其他非cccDNA。本發(fā)明的具體策略如圖l和2所示。設(shè)計(jì)一條嵌合引物，該引物由兩部分組成，片斷A位于嵌合引物的3'端，與HBVDNA正鏈互補(bǔ)，并且正處于DR2缺口前方。片斷B位于嵌合引物的5'端，該序列與HBV基因組序列無(wú)任何同源性。在DNA聚合酶作用下，嵌合引物以HBVDNA為互補(bǔ)模板，形成第一延伸鏈。由于HBV非cccDNA形態(tài)在DR2處存在缺口，所以新產(chǎn)生的核酸鏈在該處停止。cccDNA是完整的雙鏈結(jié)構(gòu)，以此為模板可以形成較長(zhǎng)的單鏈。然后以第一次反應(yīng)的產(chǎn)物作第二次PCR反應(yīng)的模板。第二次PCR反應(yīng)中應(yīng)用的一條引物序4列與嵌合引物5'端的B序列完全一致。因?yàn)樵撔蛄信cHBV基因組序列無(wú)同源性，所以保證該P(yáng)CR的擴(kuò)增模板對(duì)象僅為上一輪反應(yīng)新形成的核酸單鏈，不受HBVDNA的干擾。第二輪PCR的另一條引物設(shè)計(jì)在HBVDNADR2后，與朋VDNA部分負(fù)鏈序列互補(bǔ)。非cccDNA為模板形成的新單鏈會(huì)在DR2處終止，因此在第二輪PCR中不會(huì)有產(chǎn)物的指數(shù)倍擴(kuò)增。而以cccDNA為模板形成的單鏈?zhǔn)峭暾?，在第二輪PCR中，產(chǎn)物呈指數(shù)倍擴(kuò)增。在兩條引物中間，設(shè)計(jì)一條針對(duì)HBV序列的Taqman探針。利用Taq酶5'—-3'外切酶活性，在PCR過(guò)程中，熒光報(bào)道基團(tuán)被Taq酶從探針上切割下來(lái)，遠(yuǎn)離熒光淬滅基團(tuán)，熒光激發(fā)增強(qiáng)，并且與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量增長(zhǎng)呈正比，熒光檢測(cè)與PCR檢測(cè)模板量建立關(guān)聯(lián)。如圖1A、1B所示。本發(fā)明一方面提供了一種冊(cè)VcccDNA核酸定量檢測(cè)試劑盒，包括引物l、引物2、引物3和Taqman探針，其中，引物1的序列為SEQIDNO:l,引物2及引物3的序列分別為SEQIDN0:2和SEQIDN0:3，Taqman探針的序列為SEQIDN0:4。所述的Taqman探針的5'端設(shè)有熒光報(bào)告基因(R)，3'端設(shè)有熒光淬滅基因(Q)。所述的引物1即為前述嵌合引物，引物2和3則分別為第二輪PCR的正鏈及負(fù)鏈引物。除引物及探針外，試劑盒中還可包括Taq酶、PCRbuffer、MgCl2水溶液、dNTP等常規(guī)PCR試劑，還可包括陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照。本發(fā)明第二方面，提供了上述HBVcccDNA核酸定量檢測(cè)試劑盒的使用方法，包括下列步驟1.抽取樣本HBV病毒DNA;2.以樣本DNA為模板，采用試劑盒中的引物l進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3.采用熒光定量PCR儀，以步驟2獲得的產(chǎn)物為模板，釆用試劑盒中的引物2、引物3及Taqman探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果，可計(jì)算獲得朋VcccDNA的定量結(jié)果。較佳的，上述步驟2和步驟3可合并完成，即在同一PCR條件下完成。較佳的，上述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)條件為37。C2min，94°C2min，而后93。C20sec與62°C50sec交替進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，在62'C時(shí)進(jìn)行熒光檢測(cè)。本專利使檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)光、電、機(jī)一體化，大大加快了檢測(cè)速度，減少人為誤差和實(shí)驗(yàn)室污染，增強(qiáng)了該方法臨床應(yīng)用前景。本專利對(duì)于檢測(cè)HBVcccDNA有很好的特異性，可以很好的區(qū)分朋V非cccDNA和HBVcccDNA。本專利非常靈敏可以檢測(cè)1000copies/mlHBVcccDNA，該方法有很好的定量線性范圍從5X107_5000copies/ml。對(duì)于乙肝病人的治療與復(fù)發(fā)有著很好的輔助診斷作用。圖l:嵌合引物的設(shè)計(jì)圖圖2:嵌合引物檢測(cè)HBVcccDNA的原理圖圖3:模擬體稀釋曲線圖4:模擬體曲線相關(guān)系數(shù)圖5:20個(gè)HBV肝穿組織檢測(cè)結(jié)果圖6:IO個(gè)HBV血清樣本結(jié)果圖7:特異性檢測(cè)圖圖8:其他病毒檢測(cè)圖具體實(shí)施例方式實(shí)施例1HBVcccDNA模擬體pUCm-HBV質(zhì)粒的構(gòu)建設(shè)計(jì)和用途選擇覆蓋HBVDR1和DK2區(qū)域的序列作為擴(kuò)增對(duì)象，設(shè)計(jì)兩條引物，通過(guò)常規(guī)PCR反應(yīng)，然后應(yīng)用T-A克隆策略，將部分HBVDNA序列克隆到pUCra-T載體。然后用特異性PCR反應(yīng)、限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)以及核酸序列測(cè)定方法篩選和鑒定克隆。PCR鑒定和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定結(jié)果表明插入的DNA片斷長(zhǎng)度與預(yù)期值相符。序列測(cè)定結(jié)果與GENEBANK中HBV序列結(jié)果吻合。該序列包含DR1和DR2區(qū)域，基本特點(diǎn)與HBVcccDNA—致可以作為HBVcccDNA模擬體。l.PCR擴(kuò)增獲得HBVDNA部分序列引物1256:5'-TCCTCTGCCGATCCATACTG-3，(SEQIDNO:5)1893:5'-ATGTCCATGCCCCAAAGC-3'(SEQIDNO:6)選擇引物1256和1893，兩條引物中間序列覆蓋DR1和DR2區(qū)域。10XPCRbuffer4jul25mMMgCl2:2.4(il10mMdNTP:0.8jil引物1256(20pmoVp))引物1893(20pmol/pl)l^ilTaq酶(5U)0.3^1雙蒸水26.5pl模板4pl總體積40pl.稍作離心，置PCR擴(kuò)增儀上擴(kuò)增。同時(shí)設(shè)陰性、陽(yáng)性對(duì)照。PCR擴(kuò)增條件:94'C預(yù)變性2min;94。C變性30sec.，58。C退火30sec.，72。C延伸lmin，共40個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，72。C延伸5min.PCR擴(kuò)增結(jié)束后，在l.5%瓊脂糖上作凝膠電泳分析，紫外燈下觀察結(jié)果。3.膠回收kit回收酶切片段4.連接反應(yīng)在O.5ml滅菌印endorf管中加入pUCm-T載體(購(gòu)自上海博亞生物技術(shù)公司)(lOng/pl)，目的片段2.5pl，連接IOXbuffer1pi,T4DNA連接酶lpl(5U)，用雙蒸水補(bǔ)足至IOpl，混勻后置4'C冰箱過(guò)夜。5.重組體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)菌制備1)從LB平板上挑單個(gè)菌落JM109，接種于5mlLB液體培養(yǎng)基，37。C培養(yǎng)過(guò)夜。2)在40mlLB液體培養(yǎng)基中加0.4ml菌種，37。C振蕩培養(yǎng)約3h,置冰浴10rain。3)4°C3000rpm/min離心10min，棄上清。4)用5ml預(yù)冷的CaCl2，溶液(O.lmol/L)重懸細(xì)菌，置冰浴30min。5)4。C3000rpm/min離心10min，棄上清。6)加lml預(yù)冷的CaCl2溶液重懸沉淀。pUCm—冊(cè)V重組體轉(zhuǎn)化吸取感受態(tài)細(xì)胞懸液IOOlal加入5nl上述pUCm-18與HBV部分片斷連接產(chǎn)物，混勻，置冰浴30min。42。C水浴90sec后再置冰浴2min加入500nlLB液體培養(yǎng)基，37'C振蕩培養(yǎng)lh。將20(V1轉(zhuǎn)化的菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基表面(含氨卞青霉素100iag/ml)，37'C培養(yǎng)30min后，倒置平板繼續(xù)培養(yǎng)16-20h。挑取白色生長(zhǎng)菌落置3mlLB液體培養(yǎng)基(含氨卞青霉素IOO嗎/ml)中，37'C振搖過(guò)夜。6.陽(yáng)性克隆篩選1)PCR法篩選陽(yáng)性克隆:取l(^l增菌液置50iLi1裂解液中，沸水浴10min以變性DNA，冷卻后取,l作為模板，加入10XPCRbuffer4pl，25mMMgCl22.4pl，10mMdNTP0.8^1,PCR引物1256，1893各10pmol，Taq酶l,5U，用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足40fi1，稍作離心，置PCR擴(kuò)增儀上擴(kuò)增。同時(shí)設(shè)陰性、陽(yáng)性對(duì)照。PCR擴(kuò)增條件94。C預(yù)變性2min，94。C變性30sec.，58。C退火30sec.，72'C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行l(wèi).5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，挑選的4個(gè)克隆全為陽(yáng)性。2)酶切法篩選陽(yáng)性克隆質(zhì)粒小劑量抽提經(jīng)PCR方法篩選陽(yáng)性的克隆株作質(zhì)粒小劑量抽提，取3pl于1%瓊脂糖凝膠電泳，剩余儲(chǔ)存于一20。C冰箱備用。3)pstl酶切在O.5ml印endorf管中依次加入5pl質(zhì)粒，11.3pldH20,2plRE10XBuffer，0.2plAcetylatedBSA(10ng/Vl)，混勻后加入O.5plpstl限制性內(nèi)切酶(lOU/pl),4000rpm離心0.5min后于37'C水浴箱水浴2h。取10jal酶切結(jié)產(chǎn)物于l.5%的瓊脂糖凝膠上電泳。結(jié)果顯示為陽(yáng)性克隆。4)核酸序列測(cè)定鑒定上述PCR和限制性內(nèi)切酶鑒定的重組體質(zhì)粒，用核酸序列測(cè)定法鑒定插入序列的正確性。觀U序引物用T7。經(jīng)過(guò)比對(duì)符合預(yù)期。實(shí)施例2試劑盒的組裝合成如下序列引物l(Chimericprimer):5:—TCGCTTTCGGGTCCCTCATGCGACGTGC_3'(SEQIDN0:1)引物2(PI):5'-TCGCTTTCGGGTCCCT-3'(SEQIDNO:2)引物3(P2):5'—GCACCTCTCTTTACGCGGTC-3'(SEQIDN0:3)Taqman探針5'-FAM-CCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCG-BHQ1-3'(SEQIDNO:4)。將上述引物及探針?lè)盅b后組成試劑盒。實(shí)施例3HBVcccDNA模擬體pUCm-HBV質(zhì)粒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HBVcccDNA選擇實(shí)施例2試劑盒中的P1作為正鏈引物，選擇P2作為負(fù)鏈引物。兩條引物中間引入Taqman探針，擴(kuò)增儀器選擇ABI7000。HBVcccDNA模擬體pUCra-HBV用紫外分光光度計(jì)標(biāo)定濃度后，作十倍梯度稀釋，既5X107，5X106'5X105，5X104,5Xl03。PCR擴(kuò)增體系:10XPCRreactionbuffer4|UMgCl2(25raM)4)_ilPI(20)iM)0.5^1P2(20一)0.5|ilChimericprimer(1jjM)Taqmanprobe(20jxM)d,(lOmMeach)TaqDNApolymerase(5U)雙蒸水樣本總體積40iulPCR擴(kuò)增條件:使用熒光定量PCR儀溫度時(shí)間循環(huán)數(shù)37°C2rain19化2min193°C20sec40cycles62'C進(jìn)行熒光檢測(cè)62°C50sec結(jié)果HBVcccDNA模擬體pUCm-HBV用紫外分光光度計(jì)標(biāo)定濃度后，作十倍梯度稀釋既5X107,5X106，5X105，5X104,5X103。全部檢測(cè)為陽(yáng)性，熒光增長(zhǎng)曲線呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)峰型，各增長(zhǎng)峰型間CT值均勻。待測(cè)模板量對(duì)數(shù)值與CT值呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.998。(如圖3，圖4)實(shí)施例4特異性試驗(yàn)在107copies/mlHBVcccDNA模擬體中加入HBV定量值為108copies/ml的血清，然后進(jìn)行10倍梯度稀釋，進(jìn)行HBVcccDNA的檢測(cè)，結(jié)果HBVcccDNA模擬體和血清混合模板的檢測(cè)CT值與HBVcccDNA模擬體檢測(cè)CT值具有良好一致性，其相關(guān)系數(shù)為0.99。(如圖7)對(duì)來(lái)自甲肝病毒，丙肝病毒，巨細(xì)胞病毒，皰疹病毒，B19病毒，EB病毒，丁型肝炎病毒等7種病毒，每種各3例樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陰性。(如圖8)上述試驗(yàn)說(shuō)明本發(fā)明的試劑盒具有良好的特異性。實(shí)施例5血清及組織樣本的HBVcccDNA的定量檢測(cè)1.10個(gè)血清樣本和20個(gè)肝穿組織的臨床標(biāo)本。(經(jīng)浙江夸克生物科技有限公司生產(chǎn)的《乙0.5nl0.3|^10.8^10,27^125.13)jl4pl9型肝炎病毒核酸熒光定量檢測(cè)及YMDD變異檢測(cè)試劑盒》檢測(cè)全為陽(yáng)性標(biāo)本)HBVcccDNA分離、純化肝組織用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗10mg新鮮肝穿刺或肝移植組織標(biāo)本數(shù)次，盡量去盡血液。然后轉(zhuǎn)移到1.5ml印endorf管中。用剪刀剪碎組織成糊狀然后加入含2y。Triton-100TE溶液500nl，劇烈振蕩2分鐘，加入酚-氯仿(1:1)溶液500nl至每管，振蕩20秒，13000rpm，離心15分鐘，取上清移至另一離心管中，補(bǔ)加3mol/LNaAc使溶液終濃度為0.33raol/L，然后加入等倍體積的異丙醇，室溫放置20分鐘，13000rpm，離心15分鐘，棄上清，加入lml75%乙醇顛倒混勻，13000rpm，離心15分鐘，棄上清，倒置離心管至液體滴盡，最后加入TE或純水200pl溶解。將上述HBVDNA進(jìn)行Plasmid-SafeATP-D印endentDnase消化酶消化體系-42ul朋VDNA2ul25MmATP+5ul10xReactionBuffer兩種試劑預(yù)先混合置于-20°ClulPlasmid-SafeDnase(10U)總50ul體系37'C孵育10小時(shí)或過(guò)夜，7(TC孵育30min,混合液備用。肝組織樣品HBVcccDNA含量(拷貝/mg)=儀器顯示定量值(copies/ml)X0.2(ml)X50+42+抽提組織重量(ing)肝組織樣品HBVDNA含量(拷貝/mg)=儀器顯示定量值(copies/ml)X0.2(ml)+抽提組織重量(mg)2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HBVcccDNA，條件與實(shí)施例3相同。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>血清94.46X106低于檢測(cè)限血清103.29X106低于檢測(cè)限樣本HBV檢測(cè)copies/mlHBVcccDNA檢測(cè)copies/mlHBV檢測(cè)copies/mgHBVcccDNA檢測(cè)copies/mg肝穿組織11.1犯+042.61E+032.38E+026.21E+01肝穿組織21.3犯+04+2.78E+02+肝穿組織35.64E+03+1.13E+02+肝穿組織47.06E+03+1.41E+02+肝穿組織51.34E+05L72E+042.68E+034.10E+02肝穿組織61.1犯+052.15E+042.38E+035.12E+02肝穿組織76.68E+044.93E+031.34E+031.17E+02肝穿組織87.12E+046.26E+031.42E+031.49E+02肝穿組織91.31E+061.40E+052.62E+043.3犯+03肝穿組織108.90E+051.07E+051.78E+042.55E+03肝穿組織115.59E+058.05E+041.12E+041.92E+03肝穿組織124.67E+055.54E+049.34E+031.32E+03肝穿組織131.27E+071.42E+062.54E+053.38E+04肝穿組織141.22E+078.01E+052.4犯+051.91E+04肝穿組織157.0犯十064.76E+051.41E+051.13E+04肝穿組織165.9犯+063.82E+051.20E+059.10E+03肝穿組織171.31E+081.63E+072.62E+063.88E+05肝穿組織189.83E+071.38E+071.97E+063.29E+05肝穿組織197.98E+077.93E+061.60E+061.8犯+05肝穿組織206.48E+075.90E+061.30E+061.40E+05注+表示檢測(cè)陽(yáng)性，但是濃度太低結(jié)果無(wú)法定量。HBV定量用浙江夸克生物科技有限公司生產(chǎn)的《乙型肝炎病毒核酸熒光定量檢測(cè)及YMDD變異檢測(cè)試劑盒》檢測(cè)表一血清和肝穿組織的定量檢測(cè)結(jié)果由于乙肝cccDNA主要存在在肝細(xì)胞中，在血清中不含或含量很低(只有在肝損傷非常嚴(yán)重，肝細(xì)胞破裂使少量HBVcccDNA進(jìn)入血液循環(huán)中)。因此10例血清中雖然HBV含量很高，但是沒(méi)有檢測(cè)出HBVcccDNA,而20例肝組織都檢驗(yàn)出含有HBV且含有HBVcccDNA，其中15個(gè)為陽(yáng)性且熒光增長(zhǎng)曲線呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)峰型，5個(gè)曲線呈勞光增長(zhǎng)曲線但是定量在定量檢測(cè)限外。檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明的試劑盒對(duì)HBV病毒其他形態(tài)和HBVcccDNA具有很好的特異性。(如圖5，圖6,表l)將這10個(gè)血清樣本和20個(gè)肝組織樣本都進(jìn)行了與Southenblot的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，其中1011個(gè)血清樣本和肝組織樣本1，2，3為陰性，其余肝組織樣本均為陽(yáng)性。與本發(fā)明試劑盒的符合率為90%，還有3個(gè)樣本本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)為陽(yáng)性，而由于其朋VcccDNA濃度過(guò)低，Southenblot檢測(cè)為陰性，這說(shuō)明本發(fā)明的試劑盒的靈敏度高于Southenblot。序列表〈110〉上海之江生物科技有限公司〈120〉HBVcccDNA核酸定量檢測(cè)試劑盒及其制備方法與應(yīng)用<130〉090000〈160〉6<170〉Patentlnversion3.1〈210〉1<211〉28<212〉DNA<213〉artificialsequence〈220〉〈223〉引物<400〉1tcgctttcgggtccctcatgcgacgtgc28<210>2〈211〉16<212〉DNA〈213〉artificialsequence〈220〉〈223〉引物〈400〉2tcgctttcgggtccct16〈210〉3〈211〉20〈212〉DNA〈213〉artificialsequence〈220〉13〈223〉引物〈400>3gcacctctctttacgcggtc20<210>4<211〉25〈212〉腿〈213〉artificialsequence〈220〉〈223>探針〈400〉4cccgtctgtgccttctcatctgccg25〈210〉5<211>20<212〉DNA〈213〉artificialsequence<220〉<223>引物<400>5tcctctgccgatccatactg20<210〉6〈211〉18〈212〉腿〈213>artificialsequence〈220><223>引物〈400〉6atgtccatgccccaaagc18權(quán)利要求1.一種HBVcccDNA核酸定量檢測(cè)試劑盒，包括引物1、引物2、引物3和Taqman探針，其中，引物1的序列為SEQIDNO1，引物2及引物3的序列分別為SEQIDNO2和SEQIDNO3，Taqman探針的序列為SEQIDNO4。2.如權(quán)利要求1所述HBVcccDNA核酸定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的Taqman探針的5'端設(shè)有熒光報(bào)告基因，3'端設(shè)有熒光淬滅基因。3.如權(quán)利要求1或2所述HBVcccDNA核酸定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照。4.如權(quán)利要求卜3中任一權(quán)利要求所述HBVcccDNA核酸定量檢測(cè)試劑盒的使用方法，包括下列步驟a、抽取樣本HBV病毒DNA;b、以樣本DNA為模板，采用試劑盒中的引物1進(jìn)行PCR擴(kuò)增；c、采用熒光定量PCR儀，以步驟b獲得的產(chǎn)物為模板，采用試劑盒中的引物2、引物3及Taqman探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。5.如權(quán)利要求4所述HBVcccDNA核酸定量檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，步驟b和步驟c在同一PCR條件下完成。6.如權(quán)利要求4或5所述HBVcccDNA核酸定量檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)條件為37'C2min，94。C2min，而后93。C20sec與62。C50sec交替進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，在62'C時(shí)進(jìn)行熒光檢測(cè)。全文摘要本發(fā)明涉及核酸檢測(cè)試劑盒，公開了一種HBVcccDNA核酸定量檢測(cè)試劑盒及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明的HBVcccDNA核酸定量檢測(cè)試劑盒包括引物1、引物2、引物3和Taqman探針，其中，引物1的序列為SEQIDNO1，引物2及引物3的序列分別為SEQIDNO2和SEQIDNO3，Taqman探針的序列為SEQIDNO4。本發(fā)明使檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)光、電、機(jī)一體化，大大加快了檢測(cè)速度，減少人為誤差和實(shí)驗(yàn)室污染，增強(qiáng)了該方法臨床應(yīng)用前景。文檔編號(hào)C12Q1/70GK101503740SQ200910047009公開日2009年8月12日申請(qǐng)日期2009年3月4日優(yōu)先權(quán)日2009年3月4日發(fā)明者沈步超,邵俊斌申請(qǐng)人:上海之江生物科技有限公司