專利名稱：一種用于調(diào)節(jié)畜禽胃腸道微生態(tài)的飼料添加劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種屎腸球菌(Enterococcus faecium)純培養(yǎng)物的用于調(diào)節(jié)畜禽胃腸道微生態(tài)的飼料添加劑，該純培養(yǎng)物已于二零零零年一月二十五日由武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏編號為CCTCC NO:M99016。
傳統(tǒng)的飼料添加劑主要包括各種非生物性的抗生素類生長促進(jìn)劑及營養(yǎng)性添加物，在飼料中應(yīng)用已達(dá)半個多世紀(jì)，對畜牧業(yè)的發(fā)展起到了重大促進(jìn)作用，同時也暴露出其兩大弱點(diǎn)一抗藥性和藥物殘留日趨嚴(yán)重。目前，歐美許多國家已經(jīng)或正在計劃禁止或嚴(yán)格限制使用抗生素類添加劑。調(diào)節(jié)畜禽胃腸道微生態(tài)的飼料添加劑(亦稱益生素)是對動物有益的微生物活菌制品，它通過在動物腸道中大量繁殖，抑制有害細(xì)菌生長，維持動物正常的腸道微生物平衡發(fā)揮作用；能顯著促進(jìn)畜禽生長，提高畜禽生產(chǎn)性能，增強(qiáng)動物的免疫機(jī)能，有效防治疾病，克服使用抗生素引起的菌群失調(diào)、內(nèi)源感染、耐藥性、藥物殘留和污染等問題，可替代或部分替代抗生素，現(xiàn)已成為新一代畜禽促生長飼料添加劑產(chǎn)品。
屎腸球菌廣泛存在與自然界和畜禽胃腸道中，是一種有益的微生物。普通的屎腸球菌因其耐酸、耐高溫等抗逆性能較差，因而不能用作飼料添加劑使用。
本發(fā)明的目的是提供一種含有活的屎腸球菌(CCTCC NO:M99016)純培養(yǎng)物的、且具有一定的抵抗動物胃腸道逆性環(huán)境、能調(diào)節(jié)胃腸道微生態(tài)平衡的飼料添加劑。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的其特征在于屎腸球菌(CCTCC NO:M99016)菌泥5％～10％(W/W)，營養(yǎng)性輔料10％～40％(W/W)，穩(wěn)定劑10％～20(W/W)％，填充料40％～60％(W/W)。本發(fā)明所選擇的動物源屎腸球菌純培養(yǎng)物具有較好的耐酸、耐高溫特性，對大多數(shù)在飼料中使用的抗生素有一定耐受性。該純培養(yǎng)物經(jīng)過分離純化和鑒定(美國VITEC全自動細(xì)菌分析儀)，具有以下的特征經(jīng)膽汁耐受性篩選檢測證實(shí)能耐受30％～40％膽汁；經(jīng)耐酸性篩選檢測證實(shí)在pH3.0條件下保溫2小時，存活率為1.4％(參考文獻(xiàn)動物源乳桿菌篩選及生物特性參數(shù)測定《江蘇農(nóng)學(xué)院學(xué)報》，1997,18(1):1-5；Comparison of the bilesalts and sodium dodecyl sulfate stress responses in Enterococcus faecalis《Appliedand Environmental Microbiology》,1996,62(7):2416-2420)；經(jīng)安全性篩選檢測，即將含有108和109cfu/nl活菌的發(fā)酵液分別給1日齡健康雛雞腹腔注射和口服，在整個試驗(yàn)期內(nèi)未發(fā)現(xiàn)任何毒副作用，證實(shí)其無害。本發(fā)明所選擇的純培養(yǎng)物經(jīng)藥敏檢測證實(shí)其對氨芐青霉素、氯霉素、慶大霉素、青霉素G、利福平、氯林可霉素、環(huán)丙氟哌酸、托布霉素、紅霉素、氧氟沙星、SMZ、洛克沙生、泰樂菌素、奎乙醇、阿散酸、呋喃唑酮、莫能霉素耐藥；對桿菌肽、鹽霉素中等耐藥(美國VITEC全自動細(xì)菌分析儀)。耐高溫檢測(參考文獻(xiàn)《生物技術(shù)在飼料工業(yè)中的應(yīng)用》，1995年第一版，北京中國農(nóng)業(yè)出版社；Survivaloflactic acid bacteria in the human stomach and adhesion to intestinal cells《Journalof Dairy Science》1987,70:1-12；Survival,physiology,and lysis of lactococcus lactisin the digestive tract＜Appl.Envir.Microbiol.＞1 999,65:4881-4886)表明，經(jīng)85℃熱處理3min，該純培養(yǎng)物存活率在82％以上，證實(shí)其對高溫有一定的耐受性。本發(fā)明所使用的屎腸球菌(CCTCC NO:M99016)菌泥，其制法如下(1)挑取斜面保存的屎鏈球菌單菌落4～5個，接種于裝有1000mlKF培養(yǎng)基(參考文獻(xiàn)現(xiàn)代細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)基和生化試驗(yàn)手冊，1992年第一版，北京中國科學(xué)技術(shù)出版社，培養(yǎng)基中不加瓊脂、TTC和溴甲酚紫)的三角瓶中，37℃靜置培養(yǎng)8小時，作為種子液；取種子液接種于裝有25升滅菌的生產(chǎn)用培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，37±1℃靜置培養(yǎng)14小時；生產(chǎn)用培養(yǎng)基制備蛋白胨，10g；牛肉浸膏，5g；氯化鈉，5g；葡萄糖，1g；碳酸鈣，1g；蒸餾水，1000ml；pH調(diào)至7.6；(2)發(fā)酵結(jié)束后，菌液在室溫25-30℃，轉(zhuǎn)速4000轉(zhuǎn)/min條件下，離心30min，離心后除去上清夜，取菌泥，調(diào)整菌體濃度為5000億/ml，備用；將菌泥加入到上述添加劑配方中作為飼料添加劑，其在豬，尤其是仔豬的胃腸道中能有效的增加有益微生物的數(shù)量，調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡，改善其消化吸收機(jī)能，抑制有害細(xì)菌生長，預(yù)防或減輕腹瀉、下痢等疾病的危害。應(yīng)用于其它畜禽類，例如雞、鴨、狗、貓等，也有良好效果。由于該屎腸球菌純培養(yǎng)物具有耐高溫和耐受大多數(shù)抗生素的特性，其作為飼料添加劑在飼料制造過程中，能夠耐受制粒和飼料中抗生素的破壞力，保持一定的活菌數(shù)量。由于上述緣故，本添加劑才能作為一種具生物活性的，且具有一定的抵抗豬胃腸道逆行環(huán)境、調(diào)節(jié)胃腸道微生態(tài)平衡能力的飼料添加劑。10％～40％(W/W)營養(yǎng)性輔料(W/W的意義是重量百分比，以下同。)的作用是為該屎腸球菌純培養(yǎng)物在胃腸道快速增殖提供營養(yǎng)，其比例是根據(jù)屎腸球菌純培養(yǎng)物的營養(yǎng)需求而確定；10％～20(W/W)穩(wěn)定劑的作用是保持屎腸球菌純培養(yǎng)物的活性，其比例是根據(jù)有關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)確定的；40％～60％(W/W)填充料的作用是使屎腸球菌純培養(yǎng)物維持一定的固體形態(tài)，且填充料成分本身也是一種重要的營養(yǎng)源，其比例是根據(jù)有關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的。
本發(fā)明可以這樣完善其特征在于營養(yǎng)性輔料是由葡萄糖5％～20％(W/W)、蔗糖5％～20％(W/W)組成。穩(wěn)定劑是由淀粉10％～19(W/W)和高分子聚合物0.5％～1％(W/W)組成。穩(wěn)定劑也可由玉米蛋白粉10％～19％(W/W)和羧甲基纖維素0.5％～1％(W/W)組成。填充料是由磷酸氫鈣40％～60％(W/W)組成。其中，屎腸球菌菌泥，含活菌500-1000億/ml，占添加劑總量的5％(W/W)；磷酸氫鈣，占添加劑總量的65％(W/W)；葡萄糖，占添加劑總量的10％(W/W)；蔗糖，占添加劑總量的10％(W/W)；淀粉，占添加劑總量的9.2％；羧甲基纖維素，占添加劑總量的0.8％(W/W)。營養(yǎng)性輔料采用葡萄糖和蔗糖共同組成，它們是屎腸球菌純培養(yǎng)物的重要能源提供者。穩(wěn)定劑10％～19％(W/W)淀粉和0.5％～1％(W/W)高分子聚合物是根據(jù)其粘附特性和易于被屎腸球菌純培養(yǎng)物利用的特性而定的，選擇10％～19％(W/W)玉米蛋白粉和0.5％～1％(W/W)羧甲基纖維素作為穩(wěn)定劑還可進(jìn)一步提高含屎腸球菌純培養(yǎng)物添加劑的熱穩(wěn)定性。40％～60％(W/W)磷酸氫鈣用作填充料一方面可為動物提供直接使用的磷源，另一方面又可形成穩(wěn)定的固體形態(tài)。
上述組分可以形成以下配方屎腸球菌菌泥，含活菌500-1000億/ml，占添加劑總量的10％(W/W)；磷酸氫鈣，占添加劑總量的60％(W/W)；葡萄糖，占添加劑總量的10％(W/W)；蔗糖，占添加劑總量的10％(W/W)；淀粉，占添加劑總量的9.2％；羧甲基纖維素，占添加劑總量的0.8％(W/W)。
本發(fā)明由于采用了屎腸球菌(CCTCC NO:M99016)純培養(yǎng)物制成的菌泥配以營養(yǎng)性輔料、穩(wěn)定劑和填充劑，從而制成了具有生物活性的、能調(diào)節(jié)豬的胃腸道微生態(tài)平衡，改善其消化吸收機(jī)能的，且能通過有效抑制胃腸道有害微生物生長，達(dá)到預(yù)防和減輕腹瀉、下痢目的的新型飼料添加劑。
實(shí)施例1一種用于調(diào)節(jié)仔豬胃腸道微生態(tài)的飼料添加劑生產(chǎn)工藝(1)發(fā)酵液的制作取在KF固體培養(yǎng)基斜面保存的屎鏈球菌單菌落4～5個，接種于1000ml 1號培養(yǎng)基的三角瓶中，于37℃溫度下靜置培養(yǎng)8小時，作為種子液；種子液接種于裝有25升滅菌1號培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，于37±1℃溫度下靜置密閉培養(yǎng)14小時；KF固體培養(yǎng)基的制備月示蛋白胨10g，酵母浸膏10g，麥芽糖20g，乳糖1g，氯化鈉5g，甘油磷酸鈉10g，溴甲酚紫0.015g，疊氮鈉0.4g，紅四氮唑(TTC)0.1g，瓊脂20g，蒸鎦水1000ml，除TTC、溴甲酚紫外，其他成分混合加熱溶解，調(diào)pH值至7.4，再加入溴甲酚紫和1％TTC溶液10mml，混勻，煮沸5分鐘；1號培養(yǎng)基的制備蛋白胨10g，牛肉浸膏5g，氯化鈉5g，葡萄糖1g，碳酸鈣1g，蒸鎦水1000ml，混勻后調(diào)pH值至7.6，121℃高壓滅菌30min；(2)菌泥的制作發(fā)酵液在室溫25～30℃、4000轉(zhuǎn)/min條件下離心30min，除去上清液，菌泥用無菌的含有2.13％Na2HPO4、2.042％KH2PO4及0.85％NaCL的溶液調(diào)節(jié)菌體濃度至500-1000億/ml備用(菌泥宜即制即用)；(3)添加劑的制作將菌泥同60g磷酸氫鈣，10g葡萄糖，10g蔗糖，9.2g淀粉，0.8g羧甲基纖維素混勻，制粒。在55℃溫度下干燥40～60min，過40目篩，包裝即成飼料添加劑產(chǎn)品；添加劑應(yīng)用于斷奶仔豬的試驗(yàn)本試驗(yàn)采用隨機(jī)分組的設(shè)計方法，選用5～10kg體重范圍的長×大二元雜交斷奶仔豬60頭，隨機(jī)分為3個組，每組20頭。試驗(yàn)1組添加0.02％飼料添加劑產(chǎn)品，試驗(yàn)2組添加0.05％飼料添加劑產(chǎn)品，對照組則不添加；在一致的飼養(yǎng)條件下進(jìn)行了添加飼料添加劑產(chǎn)品對仔豬飼喂效果的試驗(yàn)，試驗(yàn)期30天；結(jié)果如下表1表1仔豬的生長性能比較項目 對照組 試驗(yàn)1組試驗(yàn)2組始均重(kg) 7.52±1.32 7.27±1.347.32±1.30末均重(kg) 18.04±3.2119.18±3.43 19.20±3.26試驗(yàn)期(日) 3131 31供試數(shù)(頭) 2019 20總增重(kg) 210.4 226.3 237.6均增重(g/日) 339.52±83.38 384.06±76.11(+44.54)* 383.51±86.01(+44.04)*總耗料(kg) 309.2 305.6 312.0料肉比 1.47:11.35:1(-0.12)1.31:1(-0.16)腹瀉率(％) 4.92 3.17(-1.75) 2.91(-2.01)注表1括號內(nèi)的數(shù)字表示上升或下降的絕對數(shù)；*表示與對照組相比差異達(dá)顯著性水平(P＜0.05)實(shí)驗(yàn)表明試驗(yàn)1組的平均頭日增重與飼料利用率比對照組分別提高了13.12％和8.16％，腹瀉率由4.96％降為3.05％；試驗(yàn)2組的平均頭日增重與飼料利用率比對照組分別提高了12.97％和10.88％，腹瀉率由4.96％降為3.15％。
權(quán)利要求
1.一種用于調(diào)節(jié)仔豬胃腸道微生態(tài)的飼料添加劑，其特征在于屎腸球菌(CCTCC NO:M99016)菌泥5％～10％(W/W)，營養(yǎng)性輔料10％～40％(W/W)，穩(wěn)定劑10％～20(W/W)％，填充料40％～60％(W/W)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的飼料添加劑，其特征在于營養(yǎng)性輔料是由葡萄糖5％～20％(W/W)、蔗糖5％～20％(W/W)組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的飼料添加劑，其特征在于穩(wěn)定劑是由淀粉10％～19％(W/W)和高分子聚合物0.5％～1％(W/W)組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的飼料添加劑，其特征在于穩(wěn)定劑是由玉米蛋白粉10％～19％(W/W)V)和高分子聚合物羧甲基纖維素0.5％～1％(W/W)組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的飼料添加劑，其特征在于填充料是由磷酸氫鈣40％～60％(W/W)組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的飼料添加劑，其特征在于屎腸球菌菌泥，含活菌500-1000億/ml，占添加劑總量的10％(W/W)；磷酸氫鈣，占添加劑總量的60％(W/W)；葡萄糖，占添加劑總量的10％(W/W)；蔗糖，占添加劑總量的10％(W/W)；淀粉，占添加劑總量的9.2％；羧甲基纖維素，占添加劑總量的0.8％(W/W)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種飼料添加劑,其主要特征在于:含有屎腸球菌(CCTCCNO:M99016)菌泥以及營養(yǎng)性輔料、穩(wěn)定劑、填充料。該添加劑具有調(diào)節(jié)仔豬胃腸道微生態(tài)的生物活性,能改善胃腸道的消化功能,抑制有害細(xì)菌的繁殖。對豬,尤其是仔豬的生長發(fā)育有明顯的促進(jìn)作用。
文檔編號C12N1/20GK1314091SQ0011413
公開日2001年9月26日 申請日期2000年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月21日
發(fā)明者謝明權(quán), 陳莊, 陳平潔, 廖玲, 禹慧敏 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所